一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法

摘要

本发明公开了一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。用哌啶特异性地与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应，可以检测出5-醛基胞嘧啶；而通过高钌酸钾将DNA中的5-羟甲基胞嘧啶氧化成5-醛基胞嘧啶后哌啶处理，通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带可以得到5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。本方法可以快速、有效和灵敏地实现5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的检测。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法，属于DNA测序领域。

背景技术

表观遗传学作为遗传学的一门重要分支学科，主要研究基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,其主要内容包括DNA甲基化、基因组印记、RNA干扰和组织蛋白修饰等。近几年来，越来越多的人开始关注DNA甲基化，相关的研究更是如火如荼的开展起来。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，其存在与基因的沉默与表达有着密切的联系。通常在甲基化转移酶的作用下甲基化发生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），接着TET家族酶处理后，5mC转化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），5hmC可以进一步氧化成5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），5caC被TDG酶切除，最后通过碱基缺失修复还原成胞嘧啶，这是一个完整的去甲基化过程。这些年来，5 mC得到广泛的研究，作为一种稳定且重要的表遗传修饰，参与基因表达调控、X-染色体失活、基因组印记、转座子的长期沉默和癌症的发生，被称为基因组第五碱基；而5hmC的存在，近年来应用了高精确的质谱分析和高通量测序方法，发现5hmC的形成与恶性血液肿瘤相关; 最新报导5fC的存在与RNA的转录酶Ⅱ的转录速率和底物特异性有着十分重要的联系。关于DNA甲基化检测的文章已经报导了很多，而作为2011年刚被发现的5fC却很少得到检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。

本发明提供的技术方案是：一种DNA中5-醛基胞嘧啶的检测方法，具体为：向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5%~20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数；

一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法，具体步骤为：

1）向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液，哌啶的体积浓度为5%~20%，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数；

2）将带荧光标记的DNA加入到高钌酸钾存在的氢氧化钠的水溶液中反应，分离出带荧光标记的DNA，然后加入哌啶的水溶液，加热后旋干溶剂，上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶位置和个数，与步骤1）中检测到的5-醛基胞嘧啶的位置和个数进行比较得到DNA中5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。

哌啶特异性的与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应，而经高钌酸钾氧化后的5-羟甲基胞嘧啶转化为5-醛基胞嘧啶，也可以与哌啶反应。通过比较变性胶中两个反应的DNA带可以清楚的看到5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。

本发明是通过哌啶与DNA中5-醛基胞嘧啶特异性的反应，经过哌啶的热处理会使DNA中5-醛基胞嘧啶的位置特异性的断裂，从而会在20%的DNA聚丙烯酰胺变性胶上看到特异性的DNA断裂带，从而确定DNA中5-醛基胞嘧啶在DNA序列中的位置。而对于含有5-羟甲基胞嘧啶的DNA，它会被高钌酸钾（KRuO₄）氧化成5-醛基胞嘧啶的DNA，同样经过哌啶处理后会在变性胶上显示出5-醛基胞嘧啶的位置。通过比较两条胶带可以看出经氧化剂氧化后新生成的DNA断裂带就是5-羟甲基胞嘧啶的位置。

本方法可以实现快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

附图说明

图1为实施例1~4的变性胶图结果比较，图中的泳道1代表实施例4中的对照实验的结果，2~5依次代表实施例1~4的结果。

图2为实施例5中步骤1）和步骤2）的照胶结果，其中，“-”代表步骤1）没有经过KRuO₄处理直接哌啶处理，“+”代表步骤2）经过KRuO₄处理后哌啶处理，图中的1234分别代表不同的DNA序列，其中，1代表只含有一个羟甲基胞嘧啶的DNA序列，2代表只含有一个甲基胞嘧啶的DNA序列，3代表只含有一个醛基胞嘧啶的DNA序列，4代表同时含有这三种特殊胞嘧啶的DNA序列；XYZ分别表示序列中的不同的位置。

具体实施方式

以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1：5-醛基胞嘧啶DNA与5% 哌啶的反应

取5-醛基胞嘧啶DNA（10 μM）2 μL加入93 μL的水和5 μL的哌啶， 90℃热处理0.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有10% 的5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

实施例2：5-醛基胞嘧啶DNA与10% 哌啶的反应

取5-醛基胞嘧啶DNA（10 μM）2 μL加入88 μL的水和10 μL的哌啶， 90℃热处理0.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有35%的 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

实施例3：5-醛基胞嘧啶DNA与15%哌啶的反应

取5-醛基胞嘧啶DNA（10 μM）2 μL加入83 μL的水和15 μL的哌啶， 90℃热处理0.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有50%的 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

实施例4：5-醛基胞嘧啶DNA与20%哌啶的反应

取5-醛基胞嘧啶DNA（10 μM）2 μL加入78 μL的水和20 μL的哌啶， 90℃热处理0.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有50% 的5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

作为对照，取5-醛基胞嘧啶DNA（10 μM）2 μL加入98 μL的水，直接90℃热处理0.5小时后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，无5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

比较实施例1~4的照胶结果，可以看出，5-醛基胞嘧啶DNA直接热处理是无法观察到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数的，经过哌啶处理后，可以清楚的看到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数，如图1所示，说明该方法快速、灵敏且有效。

实施例5：5-羟甲基胞嘧啶的检测

1）带有不同胞嘧啶的DNA与哌啶的反应

取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列1（10 μM）2 μL加入83 μL的水和15 μL的哌啶， 90℃热处理0.5 h后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，没有5-羟甲基胞嘧啶DNA发生断裂。

取5-甲基胞嘧啶DNA 序列2（10 μM）2 μL，处理方法同上，也没有出现5-甲基胞嘧啶DNA断裂。

取5-醛基胞嘧啶DNA 序列3（10 μM）2 μL，处理方法同上。有50%的5-醛基DNA发生了断裂。

取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4（10 μM）2 μL，处理方法同上。只有5-醛基胞嘧啶的位置发生了断裂。

2）带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO₄氧化然后与哌啶的反应

取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列1（10 μM）2 μL 加入NaOH溶液（50 mM）19 μL和KRuO₄(1.5mM) 4 μL，4℃反应1h后，除去KRuO₄. 再加入85 μL的水和15 μL的哌啶90℃热处理0.5 h后，旋干溶剂，上样至电泳槽，2 h后观察照胶结果，有51% 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。

取5-甲基胞嘧啶DNA序列2（10 μM）2 μL，处理方法同上。

取5-醛基胞嘧啶DNA序列3（10 μM）2 μL，处理方法同上。

取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4（10 μM）2 μL，处理方法同上。

通过比较实施例5中步骤1）和步骤2）的照胶结果，可以看出，带有不同胞嘧啶的DNA直接与哌啶反应：DNA序列1在X和Z的位置都是胞嘧啶，在Y的位置是5hmC；DNA序列2在X和Z的位置都是胞嘧啶，在Y的位置是5mC；DNA序列3在X和Z的位置是胞嘧啶，在Y位置是一个5fC；DNA序列4在X的位置是胞嘧啶，Y位置是5hmC，Z位置是5fC，从电泳图的结果可以清晰的看出5fC存在于DNA序列3和DNA序列4中，如图2所示。而带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO₄氧化然后与哌啶反应：DNA序列1在X和Z的位置是胞嘧啶，Y位置是一个5hmC，；DNA序列2在X和Z的位置是胞嘧啶，Y位置是5mC；DNA序列3在X和Z的位置是胞嘧啶，Y位置5fC； DNA序列4在X的位置是胞嘧啶，Y位置是5hmC，Z位置是5fC，如图2所示。对比图2左右两个图可以看到DNA序列1和DNA序列4在右图中出现了两条新的断裂带，此新增的断裂带刚好是预期的5hmC的位置。通过此种方法，我们可以达到分别检测5fC和5hmC的目标。

本实施例步骤2）中的哌啶水溶液的体积浓度替换为5%~20%中的任意浓度不影响本实施例的效果。