一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法

摘要

本发明提出一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法，重组表达载体步骤为：设计4条引物，分别加在pINA1296载体的启动子上游和终止子下游，分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，经回收纯化后，转化大肠杆菌XL10-Gold；验证重组子，得用于多拷贝解脂耶氏酵母表达载体pINA1296I。应用方法为：选择需表达的目的基因，将目的基因插入pINA1296I载体中，组成新的含有目的基因的单拷贝重组质粒pINA1296I-xxx-A1。再利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因，pINA1296I-xxx-A2，pINA1296I-xxx-A3，pINA1296I-xxx-A4等。本发明安全、简单、易操作，可以提高目的蛋白的表达量。

说明书

技术领域

本发明涉及离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的迅速发展，如何提高目标蛋白在宿主菌的表达量和稳定性受到了国内外的高度重视。尤其是一些具有生物活性的小分子多肽如抗菌肽受到高度的关注。但由于其分子量较小，表达量低，在细胞中的稳定性不好，因此易被宿主蛋白酶降解成没有活性的寡肽。另外，产物对宿主具有毒性如抗菌肽在表达过程中通常会抑制宿主菌的生长甚至直接杀死宿主菌，这些限制性因素被认为是制约抗菌肽表达量提高的直接原因。将多肽基因串联表达可有效解决以下问题：（1）串联增加目的基因数量，有利于提高表达量；（2）多聚体的串联表达能有效屏蔽宿主毒性；(3)随着多聚体聚合度增加，多聚体表达产物更稳定，多聚体半衰期不断延长。因此，通过构建多聚体方法对于提高小分子肽的表达量有突出优势。然而对于一些含有二硫键的多肽或分子量较大蛋白的表达或许将面临构象正确折叠和二硫键复性的棘手问题，随着串联单体增加，其构象折叠和二硫键复性情况也越来越复杂，同时也不易保持产物活性。而以含有目的基因的完整表达盒式结构为基本单元构建多拷贝重组载体，表达产物全部为目的蛋白单体，不但可以提高蛋白表达量而且能有效解决上述难题。

现有技术中，目标蛋白在宿主菌里的表达有很多种方法，酵母表达方法是人们常用的方法，酵母表达方法常用的有五种表达系统（酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、多形汉逊酵母和解脂耶氏酵母）。其中解脂耶氏酵母表达系统最好。

解脂耶氏酵母（Yarrowia  lipolyica）于1942年首次被分离得到的。由于解脂耶氏酵母能利用烷烃等多种比较常见的廉价物质作为底物来大量分泌代谢产物，在20世纪90年代将其开发成为一种优良的酵母表达系统。

解脂耶氏酵母没有天然质粒，也没有除基因组外的附加体质粒。解脂耶氏酵母表达载体包括整合型质粒和游离型的自我复制的质粒。整合型表达载体的元件包括：启动子、信号肽序列(分泌型表达载体)、多克隆位点、终止序列、选择性标记和抗性基因。解脂耶氏酵母常用的分泌型表达载体有pINA1291，pINA1293，pINA1296，pINA1297，pINA1313。比较常用的主要是：pINA1296，pINA1297。

但是，该表达系统也还存在表达量不十分理想和稳定性有待进一步提高的问题。

发明内容

本发明的目的是提出一离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法，对解脂耶氏酵母表达载体pINA1296进行改造，以优化克隆方式和提高目的蛋白的表达量。

具体做法如下：

1）根据NEB公司产品目录查找pINA1296载体的启动子和终止子区域及构成载体的其它元件，其中可以利用的同尾酶分别加在启动子上游和终止子下游，然后设计4条引物（5'agcaccAAGCTTGCTAGCgccgccgcaaggaatggt 3'、5'gaattcGGATCCTCTAGAggacacgggcatctcacttgca3'、5'TCTAGAGGATCCgaattctcatgtttgacagcttatcatcg3'、5'GCTAGCAAGCTTggtgctcaacggcctcaacctac 3'），分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，大片段和小片段大小分别为1065bp和6164bp左右（序列表对应NO 1、2），。通过PCR的方法获得两个大小不同的片段后，产物经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，再用DpnI 37°C消化3h以消除质粒背景，将两个片段混合通过无酶克隆的方式转化大肠杆菌XL10-Gold。

所述PCR方法的条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存。

2）转化的大肠杆菌XL10-Gold  37 °C生长12 h后，从平板随机挑取单菌落，小量提取质粒DNA与原始的pINA1296进行大小比对，初步确定为所需的重组子，命名为pINA1296I，该pINA1296I即为新改造构建的用于多拷贝解脂耶氏酵母表达载体（序列表对应NO 3）。

3）验证重组是否成功。

本发明的应用方法为：

1、选择需表达的目的基因（xxx），例如甘露聚糖酶、植酸酶等。

2、重组含目的基因的质粒。

首先，用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI酶切pINA1296I载体，产物为含有粘性末端的线性片段，琼脂糖凝胶回收纯化酶切产物；其次，分别用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI双酶切目的基因PCR产物，会产生与pINA1296I载体经酶酶切后互补的粘性末端，回收酶处理后的片段；最后，将双酶处理过的pINA1296I载体和甘露聚糖酶基因片段混合，在16 °C条件下，用TaKaRa公司的连接酶试剂盒Solution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，挑取17个转化子抽质粒，进行大小比对和PCR鉴定，随挑选2个鉴定为阳性的重组子送上海桑尼生物工程有限公司测序，测序结果显示两个重组子序列都是正确的，该重组质粒命名为pINA1296I-xxx-A1。

3、检测表达能力。   

4、利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因。在已构建好的单拷贝pINA1296I- -A1载体基础上，将其分成3份，首先利用两对限制性内切酶HindIII，XbaI和NheI，BamHI酶切单拷贝pINA1296I- xxx -A1表达载体，分别切下两个小片段，即一个表达盒式结构的大小，再利用表达盒式结构最两端的限制性内切酶HindIII，BamHI酶切第3份pINA1296I- xxx -A1表达载体得到一个大片段作为载体，由于NheI和XbaI是一对同尾酶，识别序列不同但可以产生互补的粘性末端，产生的混合位点不能被其中任何一种酶给识别，可以继续用于下一个组合，所以将切下的两个小片段和一个大片段载体三者按3：3:1比例混合，16°CSolution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，随机挑取几个转化子抽质粒（将其命名为pINA1296I- xxx -A2）与单拷贝pINA1296I- xxx -A1质粒进行大小比对，再用HindIII和XbaI限制性内切酶将pINA1296I- xxx -A2进一步酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳图检测，与预期理论大小相符合，则两拷贝pINA1296I- xxx -A2载体构建成功。依此类推，在两拷贝pINA1296I- xxx -A2质粒的基础上，通过不断的酶切连接，转化及抽质粒比对大小，相应的找到三拷贝pINA1296I- xxx -A3和四拷贝pINA1296I- xxx -A4质粒，然后再酶切鉴定已构建的载体大小是否与理论值相符合，拷贝次数可人为确定。

5、通过测定蛋白浓度和酶活来研究基因的剂量效应关系和确定最佳拷贝次数。分别将上述已构建好的两拷贝，三拷贝，四拷贝，五拷贝及六拷贝ppINA1296I- xxx -An (n为自然数1、2、3、4、5….)  NotI线性化后并回收，通过醋酸锂化学转化法将线性化的重组表达载体转化解脂耶氏酵母Polg。2-3天后挑取MD平板上生长的酵母菌落至含有0.5 %魔芋粉和0.03%的曲利苯兰的PPB平板上。根据含0.5 %魔芋粉和0.03%曲利苯兰PPB平板的筛选，依据水解圈的大小，每个拷贝分别挑选几个有较大水解圈的酵母转化子进行表达。首先，将酵母转化子在YPD平板上活化2天，然后接种于装有50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，28 °C，200 rpm。由单拷贝pINA1296I-man-An表达的PAGE胶可知，诱导第6天时蛋白量不再有明显的增加，所以将不同拷贝都在培养6天时取样，取样品60 μL加入15 μL 5×SDS凝胶加样缓冲液，100 °C加热10 min处理样品，每孔上样30μl，12 %的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达量。

本发明与其他表达载体相比具有明显的优势。

一、解脂耶氏酵母通过GRAS(generally recognized as safe)认证，安全性高，属于国际公认的食品级安全添加剂。

二、解脂耶氏酵母具有强启动子Hp4d，该启动子是由4个串联的pXPR2的UAS1和LEU2启动子(精简到只有TATA box)进行杂交而形成的强组成型启动子，对培养条件没有太严格的要求，一般在稳定期前期异源蛋白就得到了大量表达，因此能避免一些对宿主有毒害作用的外源蛋白对细胞的抑制作用。

三、改造后的解脂耶氏酵母载体利用体外串联构建多拷贝目的基因，在一定程度上可以提高某些蛋白的表达量，而且拷贝数可人为控制；筛选高表达量菌株，不需要进行大规模的筛选；也不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选。

附图说明：

图1为pINA1296I生物砖载体构建图。

图2为1-6拷贝man-An摇瓶诱导第6天上清的SDS-PAGE。M：Unstained Protein Molecular Weight Marker；Lane 0：Y.lipolyticaPolg/pINA1296I空白对照；Lane1-6：1-6拷贝man-A上清。 

具体实施方式

下面以实例对本发明进一步说明：

实施例1：制备重组载体pINA1296I。

1）根据NEB公司产品目录查找pINA1296载体的启动子和终止子区域及构成载体的其它元件，其中可以利用的同尾酶分别加在启动子上游和终止子下游，然后设计4条引物（5'agcaccAAGCTTGCTAGCgccgccgcaaggaatggt 3'、5'gaattcGGATCCTCTAGAggacacgggcatctcacttgca3'、5'TCTAGAGGATCCgaattctcatgtttgacagcttatcatcg3'、5'GCTAGCAAGCTTggtgctcaacggcctcaacctac 3'），分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，大片段和小片段大小分别为1065bp和6164bp左右。通过PCR的方法获得两个大小不同的片段后，产物经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，再用DpnI 37°C消化3h以消除质粒背景，将两个片段混合通过无酶克隆的方式转化大肠杆菌XL10-Gold。

所述PCR方法的条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存。

2）转化的大肠杆菌XL10-Gold  37 °C生长12 h后，从平板随机挑取单菌落，小量提取质粒DNA与原始的pINA1296进行大小比对，初步确定为所需的重组子，命名为pINA1296I，该pINA1296I即为新改造构建的多拷贝解脂耶氏酵母表达载体。

3）验证酶切位点是否发生突变。为了进一步验证几种酶切位点是否发生突变，从上面初步确定的转化子中随机挑选1个，接着分别用HindIII、XbaI、NheI、BamHI、KpnI、SfiI、NotI7种不同的限制性内切酶来酶切pINA1296I载体，线性化后的载体大小为7229bp。经比对，验证酶切位点是否发生突变。

4）进一步验证该载体上的其它组成元件是否有功能和LEU2序列上有没有引入突变。经上述验证表明各种限制性内切酶的识别序列若没有发生突变，为了保证该载体上的其它组成元件是否有功能，将该质粒用NotI线性化后转化解脂耶氏酵母，28°C培养两天，观察长出来的菌落是否正常。判断在PCR的过程中LEU2序列有没有引入突变，经过上面几轮的验证表明载体的主要部件没有发生改变，那么载体构建成功。参见附图1。

实施例2：

1、选择需表达的目的基因----甘露聚糖酶。

2、重组质粒。选取来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的甘露聚糖酶基因克隆到已改造好的pINA1296I载体上。

首先，用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI酶切pINA1296I载体，产物为含有粘性末端的线性片段，琼脂糖凝胶回收纯化酶切产物。其次，分别用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI双酶切甘露聚糖酶基因PCR产物，会产生与pINA1296I载体经酶酶切后互补的粘性末端，回收酶处理后的片段。最后，将双酶处理过的pINA1296I载体和甘露聚糖酶基因片段混合，在16 °C条件下，用TaKaRa公司的连接酶试剂盒Solution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，挑取17个转化子抽质粒进行大小比对和PCR鉴定为阳性的重组子随挑选2个送上海桑尼生物工程有限公司测序，测序结果显示两个重组子序列都是正确的，该重组质粒命名为pINA1296I-man-A1。

3、检测表达能力。将构建好的重组表达载体pINA1296I-man-A1，用限制性内切酶NotI线性化后并回收，用醋酸锂化学转化法将线性化的重组表达载体转化解脂耶氏酵母Polg。2-3天后挑取MD平板上生长的酵母菌落至含有0.5 %魔芋粉和0.03%的曲利苯兰的PPB平板上，24小时后看菌落周围是否会出现明显的水解圈。

根据含0.5 %魔芋粉和0.03%曲利苯兰PPB平板的筛选，依据水解圈的大小，挑选几个有较大水解圈的酵母转化子进行表达。首先，将酵母转化子在YPD平板上活化2天，然后接种于装有50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，28 °C，200 rpm。每隔24小时取一次样，取1 mL菌液样品于1.5 mL EP管中，12000 rpm离心1 min，为了确定最佳取样时间，分别取诱导1-7天的上清各60 μL加入15 μL 5×SDS凝胶加样缓冲液，100 °C加热10 min处理样品，12 %的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达。

4、多拷贝表达目的基因。利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因。在已构建好的单拷贝pINA1296I-man-A1载体基础上，将其分成3份，首先利用两对限制性内切酶HindIII，XbaI和NheI，BamHI酶切单拷贝pINA1296I-man-A1表达载体，分别切下两个小片段大小约为2153bp即一个表达盒式结构的大小，再利用表达盒式结构最两端的限制性内切酶HindIII，BamHI酶切第3份pINA1296I-man-A1表达载体得到一个大片段作为载体大小为6170bp，由于NheI和XbaI是一对同尾酶，识别序列不同但可以产生互补的粘性末端，产生的混合位点不能被其中任何一种酶给识别，可以继续用于下一个组合，所以将切下的两个小片段和一个大片段载体三者按3:3:1比例混合，16°CSolution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，随机挑取几个转化子抽质粒（将其命名为pINA1296I-man-A2）与单拷贝pINA1296I-man-A1质粒进行大小比对，再用HindIII和XbaI限制性内切酶将pINA1296I-man-A2进一步酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳图检测，切下的两个片段分别为4306bp和6170bp，与预期理论大小相符合，则两拷贝pINA1296I-man-A2载体构建成功。依此类推，在两拷贝pINA1296I-man-A2质粒的基础上，通过不断的酶切连接，转化及抽质粒比对大小，相应的找到三拷贝pINA1296I-man-A3和四拷贝pINA1296I-man-A4质粒，然后再酶切鉴定已构建的载体大小是否与理论值相符合。拷贝次数可人为确定。

5、通过测定蛋白浓度和酶活来研究基因的剂量效应关系和确定最佳拷贝次数。分别将上述已构建好的两拷贝，三拷贝，四拷贝，五拷贝及六拷贝ppINA1296I-man-An (n为自然数1、2、3、4、5….)  NotI线性化后并回收，通过醋酸锂化学转化法将线性化的重组表达载体转化解脂耶氏酵母Polg。2-3天后挑取MD平板上生长的酵母菌落至含有0.5 %魔芋粉和0.03%的曲利苯兰的PPB平板上。根据含0.5 %魔芋粉和0.03%曲利苯兰PPB平板的筛选，依据水解圈的大小，每个拷贝分别挑选几个有较大水解圈的酵母转化子进行表达。首先，将酵母转化子在YPD平板上活化2天，然后接种于装有50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，28 °C，200 rpm。由单拷贝pINA1296I-man-An表达的PAGE胶可知，诱导第6天时蛋白量不再有明显的增加，所以将不同拷贝都在培养6天时取样，取样品60 μL加入15 μL 5×SDS凝胶加样缓冲液，100 °C加热10 min处理样品，每孔上样30μl，12 %的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达量。

实施例2结果分析：

通过测定摇瓶表达上清中的蛋白浓度及酶活，结果表明man-An随着拷贝数的增加蛋白量及酶活性也逐渐增加。5拷贝时蛋白量及酶活达到最大，6拷贝开始下降(见图2)。该酶最适pH值为3.5，最适温度为65°C。70°C处理10分钟，活性仅剩余24%。pH2.0-8.0范围内室温处理1h，在pH3.0-6.5范围内最稳定，可保持95%以上的活性，所以利用生物砖的方法体外串联多拷贝基因在一定程度上可以提高目的蛋白的表达量。