一株产甘露醇的菌株及用该菌株发酵生产甘露醇的方法

摘要

一株产甘露醇的菌株及用该菌株发酵生产甘露醇的方法，属于食品生物技术领域。本发明方法提供了一株从甘蔗汁中筛选而来的近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）SK26.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2012491，并提供了一种利用该酵母菌株发酵生产甘露醇的方法，该方法包括：（a）在含葡萄糖的发酵培养基中对该菌株进行发酵，以得到含有甘露醇的发酵液；（b）从上述发酵液中分离纯化甘露醇。本发明生产的甘露醇安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产甘露醇，适于进行大规模生产，为甘露醇的工业化制备提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及能够生产甘露醇的一种近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003的筛选和利用该酵母菌株发酵生产甘露醇的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

甘露醇具有不吸湿、甜度适宜、热量低、无毒副作用，在人体内代谢与胰岛素无关、不提高血糖值、不致龋齿等特点，可用作糖尿病人、肥胖病人的甜味剂和功能性食品添加剂，还可用于麦芽糖、口香糖、年糕等食品的防粘，以及作为一般糕点的防粘粉。以甘露醇为原料还可以合成多种重要精细化工中间体。

由于近年来低热值食品的消费量急剧增加，目前，世界范围内甘露醇的消费量呈急剧增长趋势。至今为止，甘露醇的制造方法，主要有三种。

第一，自然提取法。在我国，从海藻、海带中提取甘露醇一直是工业化生产甘露醇方法之一，目前主要采用重结晶或者电渗析脱盐法从海藻、海带中提取甘露醇。该方法原理简单，但过程复杂，收率低能耗大，生产成本较高。

第二，化学催化法。化学催化法生产甘露醇是以蔗糖、淀粉或葡萄糖为原料通过镍催化加氢制备得到的。该法成本低，但是其收率较低，且有山梨醇副产物，增加后续分离纯化成本。

第三，生物转化法。用生物技术生产甘露醇的方法有酶法、发酵法等，总体上发酵法优于酶法。发酵法的优点是成本低，产量高，反应条件温和，副产物少，在产品的生产过程中没有有毒物质的产生，给产物后加工提供了方便，降低了成本，且适合大规模的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的微生物近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003菌株，它能以高浓度葡萄糖为原料且不必添加果糖，发酵生产甘露醇。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述近平滑假丝酵母菌株生产甘露醇的方法。

本发明的再一个目的是提供一种从含甘露醇的发酵液中分离纯化甘露醇的方法。

本发明的技术方案：从甘蔗汁中分离得到一株产甘露醇的菌株，根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16sRNA序列的测定得出其分类命名为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2012491。

利用所述的产甘露醇的菌株生产甘露醇的方法：用所述的微生物近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO:M 2012491为出发菌株，经种子培养、液体深层发酵生产甘露醇。具体步骤为：

（1）种子培养

种子培养基：葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，去离子水配制；

种子培养条件：于30-37℃，160-200rpm的转速下摇床培养10-24h。

（2）发酵培养

发酵培养基：葡萄糖100-500g/L，酵母膏10-40g/L，尿素1-10g/L，硫酸镁0-10g/L，氯化钠0-10g/L，氯化钙0-5g/L，磷酸二氢钾0-10g/L，调pH5-7；

发酵条件：接种量1%-10%，转速160-200rpm，温度30-37℃的条件下在发酵培养基中发酵3-5d。

（3）甘露醇的提取

将发酵液离心过滤，活性炭脱色后，利用阴阳离子交换柱进行脱盐；以钙型阳离子交换树脂为吸附剂，50-70℃以水洗脱，浓缩结晶后得到纯化的甘露醇。

本发明的有益效果：本发明涉及一株从甘蔗汁中筛选而来的近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012491。在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中经3-5d的发酵，残糖可达到5%以下，发酵液中的甘露醇浓度达到20-100g/L，为甘露醇的工业化制备提供了新的方法。本发明生产的甘露醇安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产甘露醇，适于进行大规模生产。

生物材料样品保藏：一株产甘露醇的菌株，其分类命名为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2012491，保藏日期2012年11月30日。

具体实施方式

以下是近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003进行发酵产甘露醇的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。

实施例1

将从甘蔗汁中分离得到的一株甘露醇生产菌送往中国典型培养物保藏中心测定该菌的形态特征、生理生化特性以及16sRNA基因序列分析，鉴定为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）SK26.003。

实施例2近平滑假丝酵母SK26.003菌株的发酵培养

在培养基A上将上述菌株于30℃培养48小时。用该培养物接种在含有100mL的种子培养基B中，30℃下通风培养24h，再转接于2L发酵培养基C中，30℃下发酵3d，搅拌速度200rpm。

培养基A：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，琼脂2%；

种子培养基B：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L；

发酵培养基C：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，尿素1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾2g/L，调pH6.5。

当终止发酵培养时，冷冻离心发酵液。用高效液相色谱法（HPLC）检测上清液中产生的甘露醇的浓度，浓度达30g/L。

实施例3  甘露醇的分离纯化

离心过滤：发酵液经冷冻离心后除去菌体，收集含甘露醇的上清液。

脱色：滤液中加入1%的活性炭，于40℃下保持40min，过滤分离直至滤液澄清；

除盐：将脱色液先后通过阳离子交换柱001×7和阴离子交换树脂313进行脱盐；

分离纯化：在分离温度为60℃，以钙型阳离子交换树脂为吸附剂、以水为洗脱剂的条件下，对甘露醇进行分离纯化，连续得到富含甘露醇的组分；

浓缩：通过旋转蒸发浓缩至固形物含量在70%以上；

结晶：在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，并加入甘露醇晶种，温度保持在4℃，静置一夜，即可结晶。将甘露醇结晶过滤，用少量乙醇冲洗，然后于40℃干燥10h，即得到甘露醇晶体。