17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3,19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的一次制备方法及其制备药物用途

摘要

本发明涉及一种17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)组合物，公开了该组合物的组成、组成物的一次制备方法，该组合物可用于制备解热、抗炎、抗病毒的药物途；用上述组合物制成药学上可以接受的剂型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的一次制备方法及其制备药物用途。 

背景技术

穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，化学成分和药理实验表明，穿心莲的活性成分是以穿心莲内酯为代表的二萜类化合物为主[国家中医药管理局.中华本草·第7册.上海：上海科学技术出版社，1999：439]，穿心莲内酯的结构为： 

分子式：C₂₀H₃₀O₅，为无色方型方型结晶，m.p.230-232℃，[α]₀²⁰-126°(c0.2，H₂O)。味极苦，可溶于甲醇、乙醇、丙醇、吡啶，微溶于氯仿、乙醚，难溶于水及石油醚。因此，口服制剂通常制片剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊；因穿心莲内酯不溶于水，给制备液体制剂带来了困难。 

现有技术中也没有特别有效、适于实际生产的提取有效成份的制备方法，尤其是当需要将两种有效成份共同使用配成组合物时，只能分别提取，然后再按比例混合，生产工艺复杂，生产成本高，严重制约了生产效率。 

发明内容

本发明提供了一种17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9- 去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的一次制备方法。 

该组合物是通过对穿心莲内酯磺化而获得的，制备方法如下： 

[1]在反应釜中加入溶剂，加入穿心莲内酯使其溶解，再加入磺化剂进行磺化反应，调节反应釜温度在5～38.5℃，磺化反应0.5～27.5小时； 

[2]穿心莲内酯溶液在搅拌的情况下采用缓缓滴加、喷雾或通气的方式加入磺化剂，并且当采用缓缓滴加或喷雾的方式加入磺化剂时，加入速度控制在1.35ml～4.9ml/min/1g穿心莲内酯，当采用通入气体的方式加入磺化剂时，通入速度控制在0.012升～0.26升/min/1g穿心莲内酯，将上述磺化反应物至饱和盐溶液中；或者用碱溶液调pH值至7，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)的混合物； 

[3]混合物经CG161大孔吸附树脂柱层析分离，上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶3.5～1∶20，树脂柱径高比为1∶4～1∶80，用水1～10倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用5％～35乙醇或甲醇4～10倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并含17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物；或者 

混合物经ODS柱层析分离，上样量与ODS比为1∶4～1∶18，树脂柱径高比为1∶6～1∶75，用水1.5～9.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用8％～38乙醇或甲醇3.5～9倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并含17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物；或者 

混合物经Sephadex LH-20柱层析分离，上样量与Sephadex LH-20比为1∶4.5～1∶18，树脂柱径高比为1∶7～1∶78，用水1～11倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用5％～35乙醇或甲醇3～11倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并含17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物； 或者 

混合物先后经过前述两种或两种以上步骤共同处理； 

得所述的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物，二者重量含量为：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-硫酸酯钠(或钾)94％～6％、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)6％～94％。 

优选的，在反应釜中加入的所述溶剂为醋酐或冰醋酸的一种或两种，1g穿心莲内酯用3g～12g所述溶剂溶解，优选的，1g穿心莲内酯用4g～9g所述溶剂溶解。 

优选的，所述溶剂为醋酐和冰醋酸，所述醋酐、冰醋酸由下列重量配比制成的：醋酐80％～20％、冰醋酸20％～80％，优选的，其中醋酐62％、冰醋酸38％。 

优选的，所述磺化剂采用浓硫酸和冰醋酸，1g穿心莲内酯用1g～10g浓硫酸冰醋酸进行磺化，所述浓硫酸和冰醋酸由下列重量配比制成的：浓硫酸80％～20％、冰醋酸20％～80％，优选的，1g穿心莲内酯用1.5g～5g浓硫酸冰醋酸，且浓流酸与冰醋酸重量比例为1∶1。 

优选的，所述磺化剂采用三氧化硫，1g穿心莲内酯通入0.2升～5升体积浓度为1％～3％的三氧化硫进行磺化，优选的，1g穿心莲内酯通入0.3升～3升体积浓度为1.5％～2.5％的三氧化硫进行磺化。 

优选的，所述磺化剂采用氯磺酸，1g穿心莲内酯用0.2g～5g氯磺酸进行磺化，优选的，1g穿心莲内酯用0.3g～3.5g氯磺酸进行磺化。 

优选的，所述的混合物经CG161大孔吸附树脂柱层析分离，上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5.5～1∶6.5；所述的混合物经ODS柱层析分离，上样量与ODS比为1∶6～1∶7；所述的混合物经Sephadex LH-20柱层析分离，上样量与Sephadex LH-20比为1∶5～1∶6。 

优选的，所述的混合物经CG161大孔吸附树脂柱层析分离，树脂柱径高比为1∶8～1∶22；所述的混合物经ODS柱层析分离，树脂柱径高比为1∶9～1∶23；所述的混合物经Sephadex LH-20柱层析分离，树脂柱径高比为1∶10～1∶25。 

优选的，所述的混合物经CG161大孔吸附树脂柱层析分离，用10％～20乙 醇或甲醇5～6.5倍柱体积洗脱；所述的混合物经ODS柱层析分离，用12％～25乙醇或甲醇4～5.5倍柱体积洗脱；所述的混合物经Sephadex LH-20柱层析分离，用15％～28乙醇或甲醇4～6倍柱体积洗脱。 

本发明的另一目的是提供了一种17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)的组合物制剂，该制剂以权利要求1～9任一项所述的制备方法获得的所述组合物为主要活性成分。 

本发明的另一目的是提供了一种所述的制备方法获得的所述组合物用于制备解热的药物的用途。 

优选的，所述组合物对内毒素致热的解热作用。 

优选的，所述组合物对干酵母致热的解热作用。 

本发明的另一目的是提供了一种所述的制备方法获得的所述组合物用于制备抗炎的药物的用途。 

优选的，所述组合物对败血症的药物作用。 

优选的，所述组合物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的的抗炎作用。 

优选的，所述组合物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的抗炎作用。 

本发明的另一目的是提供了一种所述的制备方法获得的所述组合物用于制备抗病毒的药物的用途。 

优选的，所述组合物用于抑制神经氨酸酶。 

优选的，所述组合物用于抑制流感病毒。 

优选的，所述组合物用于抑制流感病毒FM1。 

本发明所提供的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物的制备方法简单方便、条件温和、生产率高，可以方便地一次性同时制备出17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物。 

同时，本发明通过成千上百次创造性的劳动，最终确定了适宜的溶剂，以及具有创造性的磺化剂及其磺化反应的重要工艺参数，例如磺化剂的加工方式及加入速度之间的复杂关系的确定，以及适宜的数值范围的确定等，从而才最终获得了所需的反应物。 

在上述工作基础上，再进一步采用具有创造性的纯化技术进行纯化，分别采 用了CG161大孔吸附树脂柱层析分离，ODS柱层析分离，Sephadex LH-20柱层析分离，针对上述色谱填料不同特性，优化了不同色谱条件下的上样量与色谱填料比，色谱柱的径高比，洗脱溶剂的浓度范围和洗脱溶剂的用量，在高效液相色谱监测下，富集到17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物，从而本发明提供了可以在多种不同条件下制成本发明的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物制剂。 

本发明与现有技术对比表明：采用本发明制备方法制成的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物制剂，完全可以不改变穿心莲内酯原有的化学属性；并且本发明所采用的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物制剂与现有技术相比具有水溶性好、热稳定性高、溶血作用小等特点。最大限度地保证了穿心莲内酯纯天然药物的药理活性作用。 

本发明提供的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物制剂，在水中溶解度非常好、并且稳定性非常高，非常适合实际应用，可以应用于各种常用形式，如片剂、胶囊、软胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、缓释片、控释片、缓释胶囊、控释胶囊。当然也可以制成液体制剂如糖浆剂、注射液等，特别是制成注射剂克服了口服药物生物利用低的缺陷。 

本发明与现有技术经过实验数据对比可知： 

给内毒素1h后，空白对照组健康兔体温均值上升了，并持续上升3h后逐渐开始下降。与空白对照组比较，低剂量组40mg·kg^-1组合物1～2h表现出明显抑制兔温升高作用，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1组合物1-2h内表现出极强抑制兔体温升高作用，4h时还显示出抑制兔体温升高作用；3个药物实验组中以80mg·kg^-1剂量以上退热作用最好。表明40～160mg·kg^-1组合物制剂对内毒素导致的兔体温升高均有降温作用，取得了预料不到的技术效果。 

给予干酵母1h时使空白对照组健康大鼠体温持续上升第6h。与空白对照组比较，组合物制剂80，160mg·kg^-1在1～4h内表现出明显抑制大鼠体温升高作用，取得了预料不到的技术效果。 

组合物制剂各用药组、地塞米松组小鼠耳廓肿胀度明显小于对照组，取得了预料不到的技术效果。 

与对照组比，组合物制剂各剂量组与地塞米松组均对角叉菜胶所致大鼠脚肿胀有明显抑制作用，组合物制剂在160mg/kg时于给药30min即出现明显抑制作用并持续5小时，80mg/kg作用与地塞米松作用相当，组合物制剂三个剂量组之间在相同时间点对肿胀的抑制作用有一定量效关系，取得了预料不到的技术效果。 

穿心莲内酯和组合物制剂都可以显著改善LPS诱导的败血症小鼠的存活率，时间、剂量依赖性降低败血症小鼠血清中TNF-α，IL-1β，ALT，AST的含量，病抑制肝脏组织中炎症因子mRNA水平的升高。而且组合物制剂起效较穿心莲内酯快，效果更好。实验结果显示穿心莲内酯改造成磺化物后，其水溶性更好，给药起效快，对小鼠败血症的改善作用也得到增强，而且组合物制剂剂量更低，取得了预料不到的技术效果。 

组合物制剂能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；组合物制剂随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；组合物制剂能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知组合物制剂具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果，取得了预料不到的技术效果。 

经过实验数据对比可知，组合物制剂对流感病毒有显著的抑制作用，取得了预料不到的技术效果。 

医学和药学研究人员无法预先在不做相关实验的前提下，预先得知17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物制剂具有上述的良好用途。 

附图说明

图1：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠核磁共振氢谱图。 

图2：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠核磁共振碳谱图。 

图3：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠质谱图。 

图4：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠线性关系图。 

图5：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠核磁共振氢谱图。 

图6：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠核磁共振碳谱图。 

图7：17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠线性关系图。 

具体实施方式

本发明提供的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)组合物，其中所述17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(或钾)： 

R₁、R₂可以为钠或钾； 

所述17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(或钾)的分子式： 

R可以为钠或钾。 

实施例1 

取穿心莲内脂，加入5.3倍量醋酐(62％)与冰醋酸(38％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.2ml的速度，缓缓滴加4.3倍量等比例的硫酸冰醋酸，混匀，调节反应釜温度在15℃，放置90分钟使磺化，加入等量纯化水，再倒入饱和氯化钠溶液中，再经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水∶乙醇梯度洗脱，水的比例为80～20％，乙醇的比例为20～80％，分段收集洗脱液，合并相同组分，结晶，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠，其钠盐分子式：C₂₀H₂₈Na₂O₁₁S₂，分子量：554。 

反应式例： 

17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠理化性质及波谱数据： 

17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠：分子式C₂₀H₂₈Na₂O₁₁S₂，白色粉末；ESIMS m/z：531[M-Na]^-，HRESIMS：m/z m/z 531.1014[M-Na]^-(cald.for C₂₀H₂₈O₁₁S₂Na，531.0971)；¹H NMR和¹³C NMR数据。 

¹NMR(D₂O，600MHz)δ：1.75～1.83(m，1H，H-1α)，1.17(td，J＝13.6，3.5Hz，1H，H-1β)，1.75～1.83(m，1H，H-2α)，1.94～2.05(m，1H，H-2β)，3.97(dd，J＝12.0，4.5Hz，1H，H-3)，1.28(brd，J＝12.0，1H，H-5)，1.56(m，1H，H-6α)，175～1.83(m，1H，H-6β)，1.75～1.83(m，1H，H-7α)，1.94～2.05(m，1H，H-7β)，3.05(dd，J＝17.7，8.6Hz，1H，H-11α)，3.19(dd，J＝17.7，4.9Hz，H-11β)，6.81(ddd，J＝8.0，5.0，1.4Hz，1H，H-12)，5.13(dd，J＝6.0，1.8z，1H，H-14)，4.23(dd，J＝10.6，1.8Hz，1H，H-15α)，4.50(dd，J＝10.6，6.0Hz，1H，H-15β)，1.52(s，3H，H-17)，1.12(s，3H，H-18)，3.96(d，J＝10.0Hz，1H，H-19α)，4.20(d，J＝10.0Hz，1H，H-19β)，1.00(s，1H，H-20) 

¹³C-NMR(D₂O，150MHz)δ：32.2(C-1)，22.0(C-2)，84.7(C-3)，39.3(C-4)，49.5 (C-5)，17.5(C-6)，31.7(C-7)，128.1(C-8)，133.5(C-9)，36.0(C-10)，26.0(C-11)，148.6(C-12)，124.0(C-13)，63.0(C-14)，73.1(C-15)，171.0(C-16)，16.5(C-17)，19.7(C-18)，67.7(C-19)，16.5(C-20)。 

实施例2 

取穿心莲内脂，加入5.6倍量醋酐(60％)与冰醋酸(40％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.0ml的速度，缓缓滴加4.5倍等量硫酸冰醋酸，混匀，调节反应釜温度在18℃，放置100分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用36％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达82％以上，减压回收乙醇，水溶液经大孔吸附树脂、ODS柱层析分离，以水∶乙醇梯度洗脱，水的比例为80～20％，乙醇的比例为20～80％，收集洗脱液组分，合并相同组分，结晶，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠，其钠盐的分子式：C₂₀H₂₉NaO₈S，分子量：452。 

反应式例： 

¹H NMR和¹³C NMR数据。 

¹NMR(DMSO，600MHz)δ：1.04～1.07(m，1H，H-1α)，1.58～1.75(m，1H，H-1β)，1.58～1.75(m，2H，H-2)，3.18(m，1H，H-3)，1.11(brd，J＝12.6Hz，1H，H-5)，1.43(m，1H，H-6α)，1.58～1.75(m，1H，H-6β)，1.92～2.02(m，2H，H-7)，2.99(dd，J＝17.4，7.8Hz，1H，H-11α)，3.14(dd，J＝17.4，5.6Hz，H-11β)，6.46(ddd，J＝7.8，5.6，1.4Hz，1H，H-12)，4.96(brs，1H，H-14)，4.03(dd，J＝9.8，2.3Hz，1H，H-15α)，4.44(dd，J＝9.8，6.0Hz，1H，H-15β)，1.52(s，3H，H-17)，1.08(s，3H，H-18)，3.28(dd，J＝10.8，6.0Hz，1H，H-19α)，3.84(d，J＝10.9Hz，1H，H-19β)，0.92(s，1H，H-20)，4.96(br s，3-OH)，5.73(br s，1H，14-OH)，4.06(br d，J＝6.0Hz) 

¹³C-NMR(DMSO，150MHz)δ：35.0(C-1)，28.1(C-2)，77.7(C-3)，42.1(C-4)，52.1(C-5)，19.5(C-6)，34.5(C-7)，128.6(C-8)，137.4(C-9)，38.5(C-10)，27.9(C-11)，146.4(C-12)，128.9(C-13)，65.2(C-14)，74.7(C-15)，170.5(C-16)，19.7(C-17)，23.4(C-18)，63.4(C-19)，20.6(C-20)。 

实施例3 

取穿心莲内脂，加入6.2倍量醋酐(58％)与冰醋酸(42％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟1.8ml的速度，雾化加入2.2倍量氯磺酸，混匀，混匀，调节反应釜温度在16℃，放置110分钟使磺化，反应物倾入饱和氯化钠溶液中，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合溶液，减压浓缩，真空干燥，得混合物，混合物用少量水溶解，通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶5.5，Sephadex LH-20柱径高比为1∶23，用水2.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇9倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含35.07％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、64.15％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例4 

取穿心莲内脂，加入6.0倍量醋酐(60％)与冰醋酸(40％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟0.075升的速度，通入1.4升1.6％三氧化硫，调节反应釜温度在16℃，放置90分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用33％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解，通过ODS柱，上样量与ODS比为1∶5.5，ODS柱径高比为1∶19，用水3倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用30％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含74.98％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、24.52％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例5 

取穿心莲内脂，加入5.5倍量醋酐(59％)与冰醋酸(41％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.6ml的速度，缓缓滴加3.7倍量的硫酸(52％)与冰醋酸(48％)，混匀，调节反应釜温度在19℃，放置100分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用32％KOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合物，混合物用少量水溶解，通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶6，Sephadex LH-20柱径高比为1∶25，用水3倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用22％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含59.56％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、39.78％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例6 

取穿心莲内脂，加入5.4倍量醋酐(60％)与冰醋酸(40％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟1.8ml的速度，雾化喷加4.3倍量的硫酸(53％)与冰醋酸(47％)，混匀，调节反应釜温度在17℃，放置100分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用46％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解，通过ODS柱，混合物上样量与ODS比为1∶6.5，ODS柱径高比为1∶18，用水2.8倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用25％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含45.25％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、54.20％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例7 

取穿心莲内脂，加入5倍量醋酐(56％)与冰醋酸(44％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟0.085升的速度，通入1.6升1.8％三氧化硫，调节反应釜温度在18℃，放置100分钟使磺化。反应物倾入饱和氯化钠溶液中，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合 溶液，减压浓缩，真空干燥，得混合物，混合物用少量水溶解，通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶6，Sephadex LH-20柱径高比为1∶22，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用22％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含22.06％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、87.37％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例8 

取穿心莲内脂，加入5.9倍量醋酐(60％)与冰醋酸(40％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.5ml的速度，缓缓滴加3.2倍量氯磺酸，混匀，调节反应釜温度在14℃，放置100分钟使磺化，加入等量纯化水，搅匀，用37％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达82％以上，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5.2，树脂柱径高比为1∶19，用水2.3倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用15％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠混合物。混合物用少量水溶解，通过ODS柱，上样量与ODS比为1∶5.5，ODS柱径高比为1∶20，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用20％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含75.08％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、24.85％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例9 

取穿心莲内脂，加入5.8倍量醋酐(61％)与冰醋酸(39％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟0.095升的速度，通入1.4升2.0％三氧化硫，调节反应釜温度在16℃，放置90分钟使磺化，加入纯化水，搅匀。反应物倾入饱和氯化 钾溶液中，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合溶液；减压浓缩，真空干燥，得混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5，树脂柱径高比为1∶21，用水2.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用10％乙醇4倍柱体积洗脱，再用20％乙醇4倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含77.51％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、22.04％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例10 

取穿心莲内脂，加入5.5倍量醋酐(62％)与冰醋酸(38％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.0ml的速度，缓缓滴加4.8倍量的硫酸(52％)与冰醋酸(48％)，混匀，调节反应釜温度在24℃，放置120分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用33％KOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达84％以上，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶4.5，树脂柱径高比为1∶18，用水2.8倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用16％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾混合物。混合物用少量水溶解，再通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶5，Sephadex LH-20柱径高比为1∶24，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用22％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含16.52％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、83.05％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例11 

取穿心莲内脂，加入5.5倍量醋酐(56％)与冰醋酸(44％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.1ml的速度，缓缓滴加4.4倍量等比例的硫酸冰醋酸， 混匀，调节反应釜温度在12℃，放置100分钟使磺化，加入等量纯化水，再倒入饱和氯化钠溶液中，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合溶液；减压浓缩，真空干燥，得混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5，树脂柱径高比为1∶18，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用10％乙醇5倍柱体积洗脱，再用20％乙醇5倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含29.35％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、69.85％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例12 

取穿心莲内脂，加入5.6倍量等比例的醋酐与冰醋酸使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.1ml的速度，缓缓滴加2.8倍量氯磺酸，混匀，调节反应釜温度在20℃，放置90分钟使磺化，加入等量纯化水，搅匀，用32％KOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5，树脂柱径高比为1∶19，用水2.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用25％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含48.95％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、49.82％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例13 

取穿心莲内脂，加入5.6倍量醋酐(55％)与冰醋酸(45％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.1ml的速度，缓缓滴加2.4倍量氯磺酸，混匀，调节反应釜温度在22℃，放置90分钟使磺化，反应物倾入饱和氯化钾溶液中，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合溶液，减压浓缩，真空干燥，得混合物，混合物用少量水溶解，通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶6.5，Sephadex LH-20柱径高比为1∶20，用水3.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用26％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含26.48％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、73.16％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例14 

取穿心莲内脂，加入5.8倍量醋酐(62％)与冰醋酸(38％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟1.8ml的速度，缓缓滴加4.4倍量的硫酸(52％)与冰醋酸(48％)，混匀，调节反应釜温度在21℃，放置100分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用36％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达82％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解，通过ODS柱，上样量与ODS比为1∶5.8，ODS柱径高比为1∶21，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用26％乙醇8倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含68.42％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、31.08％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例15 

取穿心莲内脂，加入5.3倍量醋酐(58％)与冰醋酸(42％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟2.1ml的速度，缓缓滴加2.6倍量氯磺酸，混匀，调节反应釜温度在15℃，放置100分钟使磺化，加入等量纯化水，搅匀，用34％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达82％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解，通过ODS柱，上样量与ODS比为1∶6，ODS柱径高比为1∶19，用水2.6倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用28％乙醇7倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含18.57％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、81.17％的 17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例16 

取穿心莲内脂，加入6.0倍量醋酐(62％)与冰醋酸(38％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟0.08升的速度，通入1.5升1.6％三氧化硫，调节反应釜温度在21℃，放置110分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用32％NaOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达82％以上，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠等混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5.5，树脂柱径高比为1∶21，用水2倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用8％乙醇6倍柱体积洗脱，再用25％乙醇5倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含84.25％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠、17.11％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠组合物。 

实施例17 

取穿心莲内脂，加入4.5倍量醋酐(62％)与冰醋酸(38％)使溶解，在搅拌下，以1g穿心莲内酯每分钟0.09升的速度，通入1.4升2.2％三氧化硫，调节反应釜温度在18℃，放置120分钟使磺化。加入等量纯化水，搅匀，用32％KOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达80％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾混合物，混合物用少量水溶解后通过CG161大孔吸附树脂柱，混合物上样量与CG161大孔吸附树脂比为1∶5，树脂柱径高比为1∶20，用水2.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用10％乙醇5倍柱体积洗脱，再用20％乙醇5倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含62.55％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、37.12％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。 

实施例18 

取穿心莲内脂，加入5.5倍量等比例的醋酐与冰醋酸使溶解，在搅拌下，以 1g穿心莲内酯每分钟2.0ml的速度，缓缓滴加3.0倍量氯磺酸，混匀，调节反应釜温度在22℃，放置70分钟使磺化，加入等量纯化水，搅匀，用25％KOH调pH为7.0左右，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，滤过，滤液减压回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾等混合物，混合物用少量水溶解，通过ODS柱，上样量与ODS比为1∶5.2，ODS柱径高比为1∶19，用水2.6倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用25％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾混合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾混合物。混合物用少量水溶解，再通过Sephadex LH-20柱，混合物上样量与Sephadex LH-20比为1∶6，Sephadex LH-20柱径高比为1∶21，用水1.5倍柱体积洗脱，弃去洗脱液，用25％乙醇6倍柱体积洗脱，HPLC检测，合并17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物洗脱溶液，回收乙醇，真空干燥，得含49.42％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钾、49.98％的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钾组合物。17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠与17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠含量测定 

1.仪器与试药 

仪器：Agilent1100四元低压梯度泵系列，Chemstation化学工作站，DAD检测器；岛津LC-2010A型高效液相色谱仪，双通道紫外可变波长检测器；Sartoriuscp211D十万分之一电子天平。 

色谱柱：Diamonsil C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)； 

试剂：乙腈为色谱纯，水为Millipore制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。 

17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠对照品为自制，经纯度标化含量为99.06％。17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠对照品为自制，经纯度标化含量为99.68％。 

2.对照品溶液及供试品溶液的制备 

2.1对照品纯度检查及含量标化：取实施例1制备方法所获得的样品，分别采用 正丁醇-冰醋酸-水(4.5∶1∶1)、氯仿-甲醇-水-冰醋酸(8∶3∶1∶0.5)进行薄层色谱纯度检查，点样量分别为5、10、15、20、25μg，结果17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠均为一个斑点； 

取实施例2制备方法所获得的样品，分别采用正丁醇-冰醋酸-水(4∶0。5∶0.5)、氯仿-甲醇-水-冰醋酸(6.5∶2.5∶1∶0.5)进行薄层色谱纯度检查，点样量分别为5、10、15、20、25μg，结果17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠为一个斑点； 

用高效液相色谱，采用面积归一化法测定17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠含量，分别选择色谱柱：Diamonsil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g/L+庚烷磺酸钠1g/L)-乙腈(84∶16)和流动相：磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g/L+庚烷磺酸钠1g/L)-甲醇(77∶23)；流速：1ml/min；检测波长：225nm；柱温：25℃。每组流动相分别进出10μl、20μl各一次，共进样4次，测得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠4次平均含量为99.06％。 

用高效液相色谱，采用面积归一化法测定17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠含量，分别选择色谱柱：Diamonsil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g/L+庚烷磺酸钠1g/L)-乙腈(84∶16)和流动相：磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g/L+庚烷磺酸钠1g/L)-甲醇(76∶24)；流速：1ml/min；检测波长：225nm；柱温：25℃。每组流动相分别进出10μl、20μl各一次，共进样4次，测得17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠4次平均含量为99.68％。 

2.2对照品溶液制备：精密称取上述标化的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠对照品24.32mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，作为对照品母液，供方法学研究用。 

精密称取上述标化的17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠对照品23.62mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，作为对照品母液，供方法学研究用。 

2.3供试品溶液的制备：精密称取实施例6样品100mg，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得； 

3.色谱条件与系统适用性试验 

以乙腈为流动相A，以磷酸二氢钾缓冲液(每1000ml水中加入磷酸二氢钾1.361g与庚烷-1-磺酸钠1.0g)为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为225nm。理论板数按17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠计算应不低于10000。 

在上述条件下，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠在保留时间约5分钟有一色谱峰。17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸钠在保留时间约30分钟有一色谱峰。 

4、线性关系的考察 

各精密吸取17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠对照品母液1ml，分别置100ml、50ml、25ml、10ml、5ml量瓶中，分别加水稀释成以下浓度：0.02432mg/ml、0.0864mg/ml、0.09728mg/ml、0.19456mg/ml、0.38912mg/ml。精密吸取溶液10μl注入液相色谱仪，按3色谱条件与系统适用性试验项下色谱条件峰面积，分别以17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠峰面积积分值为纵坐标，各自对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠回归方程为y＝2340X-120.3，R²＝0.9999，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠在0.2432～3.8912μg之间呈良好线性。结果见表1，图4。 

表1.17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠线性关系结果 

各精密吸取上述17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸钠母液1ml，分别置100ml、50ml、25ml、10ml、5ml量瓶中，分别加水稀释成以下浓度：0.02362mg/ml、0.04724mg/ml、0.09448mg/ml、0.18896mg/ml、0.37792mg/ml。精密吸取溶液10μl注入液相色谱仪，按3色谱条件与系统适用性试验项下色谱条件峰面积，分别以17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠峰面积积分值为纵坐标，各自对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠回归方程为y＝2454.7x-105.4，R²＝0.9998，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠在0.2362～3.7792μg之间呈良好线性。结果见表2，图7。 

表2.17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠线性关系结果 

5.精密度试验 

取17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠对照品溶液，重复进样6次，结果17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠峰面积RSD为0.19％，结果见表3。 

表3对照品精密度试验结果 

取17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠对照品溶液，重复进样6次，结果17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠峰面积RSD为0.74％，结果见表4。 

表4.精密度试验结果 

6.稳定性试验 

取供试品溶液，照3色谱条件与系统适用性试验项下色谱条件测定，每隔一定时间进样一次，结果供试品溶液中17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠(以下简称3，19二硫酸酯钠)和17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠(以下简称19硫酸酯钠)在24小时内峰面积无明显变化，其峰面积RSD分别为1.18％和1.00％。结果见表5。 

表5稳定性试验结果 

7.重复性试验 

精密称取本发明样品，加水制成供试品溶液6份，照3色谱条件与系统适用性试验项下色谱条件测定，17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠平均含量为45.25％，RSD为0.53％。17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠平均含量为54.20％，RSD为0.26％，结果见表6。 

表6.重复性试验结果 

8.回收率试验 

采用加样回收试验，精密称取本发明样品溶液至50ml容量瓶中，共6份，分别精密加入17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠对照品溶液(0.946mg/ml)2ml和17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠对照品溶液(1.012mg/ml)2ml，加水稀释至刻度，摇匀。照3色谱条件与系统适用性试验项下方法测定，计算回收率，结果见表7、表8。 

表7.17-氢-9-去氢穿心莲内酯-3，19-二硫酸酯钠回收率试验结果 

表8.17-氢-9-去氢穿心莲内酯-19-硫酸酯钠回收率试验结果 

以下实验用“组合物”均取实施例12制备方法所获得的样品。其他实施例所获得的实验数据基本接近，不再赘述。 

实验数据2：组合物对内毒素致热的影响 

取日本大耳白兔，体重1.8～2.3kg，雌雄兼有，实验前1d，选取体温在38.0～39.4℃之间，当日体温变化不超过0.4℃的家兔作为实验用兔。实验当日，取上述合格兔，测定造模前基础体温，自家兔耳静脉注射细菌内毒素生理盐水溶液，剂量为1mL/kg(10EU/mL)，观察家兔体温变化，每30min记录1次。选取注射1h后体温上升超0.5℃的家兔，随机分成5组，每组8只。分别耳静脉注射给予0.9％氯化钠溶液，组合物低剂量组40mg·kg^-1，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1及注射用精氨酸阿司匹林100mg·kg^-1，分别于给药后1，2，3，4，5，6h测定各兔体温。以给药前体温均值为基数，计算各测定时间兔温变化值。见表9。 

表9.组合物对内毒素致热后的温度变化 

注：与空对照组比较※P＜0.05    ※※P＜0.01 

由表9可知，给内毒素1h后，空白对照组健康兔体温均值上升了，并持续上升3h后逐渐开始下降。与空白对照组比较，低剂量组40mg·kg^-1组合物1～2h表现出明显抑制兔温升高作用，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1组合物1-2h内表现出极强抑制兔体温升高作用，4h时还显示出抑制兔体温升高作用；3个药物实验组中以80mg·kg^-1剂量以上退热作用最好。表明40～160mg·kg^-1组合物对内毒素导致的兔体温升高均有降温作用。 

实验数据3：组合物对干酵母所致大鼠发热的影响 

实验用大鼠预先测体温3d，实验当日测定值为大鼠基础体温，筛选体温变化不超过0.3℃的动物，随机分成5组，每组8只。皮下注射20％干酵母混悬液5mL/kg， 致热后腹腔注射0.9％氯化钠溶液，组合物低剂量组40mg·kg^-1，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1及阿司匹林100mg·kg^-1，测量给药后1～6h的大鼠体温，每小时1次，以不同时间点体温值与基础值的差值作为观察指标，结果见表10。表10看出，给予干酵母1h时使空白对照组健康大鼠体温持续上升第6h。与空白对照组比较，组合物80，160mg·kg^-1在1～4h内表现出明显抑制大鼠体温升高作用。 

表10.干酵母致热后用药温度变化℃， 

注：与空对照组比较※P＜0.05    ※※P＜0.01 

实验数据4：组合物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 

取小鼠50只，随机分成5组。每日给组合物低剂量组40mg·kg^-1，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1 2次，连续3天，地塞米松磷酸钠注射液仅在致炎前给药。末次给药后1h，每只小鼠左耳廓内外侧滴涂0.1ml二甲苯致炎，右耳作为对照。致炎后2小时脱颈锥处死小鼠，并沿耳廓基线剪下鼠两耳，用直径6mm打孔器分别于左、右耳相同部分打下耳片，置电子天平上称重并记录数据。以左右耳片重量差值表示肿胀度。表11显示，组合物各用药组、地塞米松组小鼠耳廓肿胀度明显小于对照组。 

表11.对二甲苯致耳廓肿胀的影响 

注：与空对照组比较^※P＜0.05    ^※※P＜0.01 

实验数据5：组合物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响 

取大鼠40只，随机分为5组。每日给组合物低剂量组40mg·kg^-1，中剂量组80mg·kg^-1，高剂量组160mg·kg^-1 2次，连续3天，地塞米松磷酸钠注射液仅在致炎前给药。末次给药后，每只大鼠灌胃给予生理盐水8ml，30分钟后于大鼠足爪中部皮下注射0.15ml 1％角叉菜胶溶液，并于注入后30min、1h、2h、3h、4h、5h用千分尺测定其左后足爪厚度作为大鼠足肿胀程度指标。表12结果显示，与对照组比，组合物各剂量组与地塞米松组均对角叉菜胶所致大鼠脚肿胀有明显抑制作用，组合物在160mg/kg时于给药30min即出现明显抑制作用并持续5小时，80mg/kg作用与地塞米松作用相当，组合物三个剂量组之间在相同时间点对肿胀的抑制作用有一定量效关系。 

表12.对角叉菜致大鼠足趾肿胀的影响 

注：与空对照组比较^※P＜0.05    ^※※P＜0.01 

实验数据6：组合物对神经氨酸酶活性的抑制作用 

取组合物，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定组合物抑制神经氨酸酶(N1)的效价见表13。 

(1).标准曲线准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再分别加入0、1、2、5、7.5、10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～20μl Milli-Q水。 

(2).样品检测的准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再加入10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～10μl组合物样品；d.每孔再加入0～10μl Milli-Q水。 

(3).检测步骤： 

a.振动混匀约1min； 

b.37℃孵育2min使抑制剂和H5N1神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的 样品也一起孵育； 

c.每孔加入10μl神经氨酸酶荧光底物； 

d.再振动混匀约1min； 

e.37℃孵育20～30min后进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。 

(4).根据标准曲线计算出样品对于H5N1神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度曲线后计算出组合物对于H5N1神经氨酸酶的IC50。组合物达到对神经氨酸酶的抑制率IC50为0.25g/L。见表13。 

表13.组合物抑制神经氨酸酶的活性 

根据上述实验结果可以清楚地看到： 

(1).组合物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分； 

(2).组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关； 

(3).由上述实验可见，组合物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。 

医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。 

实验数据7：组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用 

取组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定组合物抑制 FM1流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。 

(1).将FM1流感病毒液接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，37℃孵育72h，观察并计算半数鸡胚感染量(EID50)。 

(2).组合物对鸡胚的毒性作用采用，无菌生理盐水对组合物作系列稀释后接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，每个浓度接种6胚，37℃孵育，观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚可存活96h的最大浓度作为药物的TD。 

(3).组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用采用，0.1ml的流感病毒液和不同稀释度的组合物混合，37℃作用2h，接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37℃孵育72h。病毒攻击量为50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算组合物对病毒抑制作用的半数有效剂量(ED50)。 

(1).FM1流感病毒对鸡胚的毒力经Reed-Muench法计算，其EID50为10^-4.86。 

(2).组合物接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96h鸡胚均存活。鸡胚给予组合物原液未见鸡胚死亡，所以可认为TD0为1.85g/L。 

(4).组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表14。 

表14.组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用 

与病毒对照组比较：*P＜0.05 

由表14可知，组合物在0.0625～0.50g/L对流感病毒有显著的抑制作用(P＜0.05)，ED₅₀为0.1107g±0.0106g/L，TI为60.17±2.55。 

实验数据8：组合物对FM1流感病毒影响 

取组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定组合物抑制FM1流感病毒毒力的能力。 

(1).FM1对狗肾传代细胞(MDCK)的毒力测定采用细胞半数感染量(TCID50)微量法。 

(2).组合物对MDCK细胞的毒性测定采用无血清的DMEM对组合物作系列稀释后接种于已形成单层的MDCK细胞孔中，每孔100μl，每个稀释度重复4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃、5％CO₂培养箱内培养，每日观察细胞病变(CPE)，连续观察3d，以“+～++++”记录结果，按Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。 

(3).组合物抑制FM1流感病毒作用测定：MDCK细胞5×10⁵/ml，每孔100μl，分别于96孔板中，37℃、5％CO₂培养箱内培养，次日吸去孔中培养液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μl，37℃吸附1h后吸去上清液。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，以药物的TD0为第1孔，再用无血清的DMEM液对组合物作系列稀释，分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组，37℃、5％CO₂温箱内培养，每日观察流感病毒产生的MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连续3d，计算出药物的50％抑制病变浓度(IC50)及治疗指数(TI)。TI的计算：TI＝TD50/IC50，TI值越大，表明药物的安全范围越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney检验法比较试验组与病毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变(CPE)的抑制率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。 

(4).FM1流感病毒对MDCK细胞的毒力经Reed-Muench法计算，其TCID50为10^-4.68。(2).组合物MDCK细胞的TD0分别为1.28g±0.057g/L。(3).将组合物作系列稀释后，对100TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效量IC50及TI值大小，结果见表15。 

表15.组合物对FM1流感病毒的IC₅₀(g/L)及TI(x±s) 

由表15可知，组合物的IC50低，TI高。组合物抑制FM1流感病毒致细胞病变 的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对CPE的抑制率进行的相关性分析表明，组合物的剂量与药物对CPE抑制率之间呈明显的正相关。 

实验数据9：组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的脾指数和肺指数的影响 

取组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用。 

(1)流感病毒FM1株病毒做10倍倍比稀释后分别接种每组10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种20μl。观察10d的小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50为10^-1.65。故确定实验所用的造模浓度为10LD50。 

(2)组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、组合物0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3d后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用10LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天，计算死亡率(死亡率＝每组死亡数/每组小鼠总数×100％)，结果见表16。 

(3)组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株肺指数的影响：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、组合物0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用1.0LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。于病毒感染后第8天处死小鼠，称体重，取肺称肺重，计算肺指数(肺指数＝肺质量/体质量×100％)；此外，取脾称脾重，计算脾指数(脾指数＝脾质量/体质量×100％)，结果见表17。 

表16.组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护结果 

注：※※P＜0.01VS流感病毒模型组    ※P＜0.05VS  流感病毒模型组 

表17.组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的脾指数和肺指数的影响 

注：#P＜0.05VS正常对照组    注：※※p＜0.001VS流感病毒模型组    ※p＜0.05VS流感病毒模型组 

由表16可知，组合物在0.2～0.8g/L对流感病毒感染小鼠有显著的保护作用(p＜0.01)。 

由表17可知，组合物在0.4～0.8g/L对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的作用(p＜0.01)。 

实验数据10：组合物对小鼠败血症的影响 

1.组合物能显著改善败血症小鼠存活率 

穿心莲内酯因水溶性极差，所以采用0.9％羧甲基纤维素钠水溶液配制成混悬液进行灌胃(30mg/kg)，组合物直接用PBS配成澄清溶液进行尾静脉注射(10mg/kg)。腹腔注射5mg/kg LPS进行造模，观察60h内小鼠存活只数，计算存活率。模型组小鼠在造模后16时出现死亡，60h后存活率为25％(如表18所示)，穿心莲内酯给药组存活率为50％，组合物给药组存活率为70％，相比较而言，组合物改善存活率的效果比穿心莲内酯组效果稍好，但其剂量更低。 

表18.组合物对LPS诱导的败血症小鼠存活率 

2.组合物显著抑制败血症小鼠血清中炎症因子的升高 

BALB/C小鼠腹腔灌胃给予穿心莲内酯30mg/kg，尾静脉注射组合物0.8、2.4、8mg/kg，同时腹腔注射5mg/kg LPS，在造模和给药后2，5，8，12h 4个时间点各处死3只小鼠，眼眶取血，测定血清中炎症因子TNF-α，IL-1β的含量，如表19所示。LPS注射2h后，模型组小鼠血清中TNF-α，IL-1β的含量即达到峰值，分别为4815pg/ml和391pg/ml，组合物给药2h即可显著抑制TNF-α至3398pg/ml，对在5h时对IL-1β的释放产生明显的抑制。穿心莲内酯作用8h才可显著抑制TNF-α的升高。实验结果表明相比于穿心莲内酯，组合物对败血症小鼠血清中炎症因子的抑制作用起效快，并且抑制效果更显著，剂量更低。 

表19.组合物时间、剂量依赖性降低LPS诱导的败血症小鼠血清中炎症因子 

TNF α(pg/ml) 

IL 1β(pg/ml) 

n＝3，*p＜0.05vs模型组，#p＜0.05vs穿心莲内酯组。 

3.组合物显著抑制败血症小鼠的肝脏损伤 

败血症是一种导致多脏器损伤的疾病，肝脏是其损伤的主要脏器之一。BALB/C小鼠灌胃给予穿心莲内酯30mg/kg，尾静脉注射组合物8mg/kg，同时腹腔注射5mg/kg LPS，分别于2h，5h，8h，12h眼眶取血，测定血清中ALT、AST的含量。如表20所示，给予LPS以后，模型小鼠血清中ALT和AST持续 升高，给予组合物2h后ALT/AST的含量即有所下降，至12h后与模型组ALT/AST有显著性差异，穿心莲内酯对ALT/AST的抑制效果比组合物效果稍差。RT-PCR测定肝脏组织中各炎症因子的小鼠RNA水平发现，LPS刺激下ifn-γ，il-6，tnf-α，il-β，cox-2mRNA都显著升高，组合物和穿心莲内酯给药5h和8h都可显著抑制ifn-γ，il-6，tnf-α，il-β，cox-2mRNA的升高。实验结果同样表明相比于穿心莲内酯，组合物对败血症小鼠肝损伤的抑制作用起效快，并且抑制效果更显著。 

表20.组合物对LPS诱导的败血症小鼠肝损伤的抑制作用 

AST(karmen units) 

ALT(karmen units) 

n＝3，*p＜0.05，vs模型组。 

4、小结 

穿心莲内酯和组合物都可以显著改善LPS诱导的败血症小鼠的存活率，时间、剂量依赖性降低败血症小鼠血清中TNF-α，IL-1β，ALT，AST的含量，病抑制肝脏组织中炎症因子mRNA水平的升高。组合物起效较穿心莲内酯快，效果更好。实验结果显示穿心莲内酯改造成磺化物后，其水溶性更好，组合物给药后起效快，对小鼠败血症的改善作用也得到增强，而且剂量更低。