基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法

摘要

本发明公开了一种基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法，针对流感病毒A、B型，副流感病毒1、3型，冠状病毒SARS-CoV、CoV-NL63、呼吸道合胞病毒A、B型，腺病毒B、E型，鼻病毒、人偏肺病毒、肠道病毒共十三种/型呼吸道病毒的特异性基因序列设计13对引物和相应的特异性探针，经多重PCR扩增及TSPE反应，X-TAG核酸片段、生物素分别标记相应基因片段，标记的片段与相应编码微球结合，悬浮芯片扫描仪检测。能正确检测13种呼吸道病毒及其亚型，各探针间无交叉反应，特异性好、灵敏度高。建立了高通量、快速、准确的可同时检测多种呼吸道病原的技术平台，为突发呼吸道传染病的病原体检测提供技术储备，有利于为应对传染病疫情爆发及时提供信息。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法。 

背景技术

SARS、H1N1甲型流感、新型冠状病毒感染和人感染H7N9禽流感疫情的相继爆发与流行，呼吸道感染的流行及造成的危害一直是公共卫生关注的焦点。引起人类呼吸道感染的病毒种类繁多，目前至少包括7个科30余种病毒及其亚型。由于一种（型）病毒可引起多种临床症状，同一临床症状又可由多种（型）病毒所引起，传统检验方法不能快速准确地确定病原体。病原体的快速准确检出是及时、准确预测、预报和预警的关键。当传染源得到及时隔离、并切断传播途径时，就避免了呼吸道感染在人群中的扩散，进一步缩小疫情范围甚至预防疫情的出现。因此，建立对多种呼吸道病毒快速筛查方法，对快速查明呼吸道传染病疫情的病原体具有重要意义。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种同时快速检测十三种/型呼吸道病毒及其亚型的模型，为及时应对呼吸道感染疫情提供重要信息的基于新型悬浮芯片技术的13种/型呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法。 

为实现上述目的，本发明基于新型悬浮芯片技术的13种/型呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法，具体为： 

1）根据解链温度、扩增片段大小、病毒种类，将13种呼吸道病毒及其亚型分为四组：第1组包括PIV3、SARS、Inf B、RSVA，第2组包括Inf A、NL63，第3组包括AdB、hMPV、HRV，第4组包括RSVB、AdE、PIV1、EnV； 

2）多重PCR引物、探针设计，上下游引物上分别标记有X-TAG和荧光素； 

3）进行PCR反应；PCR产物TSPE延伸； 

4）将PCR产物结合物分别与相应的编码微球杂交； 

5）磁性编码微球上分别偶联有anti-TAG，编码微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异性捕获PCR产物上的Tag序列； 

6）加入链霉亲和素－藻红蛋白，与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析； 

7）多重检测体系的建立及结果判读：以组为单位，混合编码微球，组成多重检测体系；Bio-Plex悬浮芯片系统读取MFI值，以对待检测物进行定性分析； 

其中，所涉及的引物探针序列为： 

。 

进一步，选择AdB和AdE的Hexon基因、Cov-229E、Cov-NL63、 SARS-Cov的nucleocapsid基因、EnV和HRV的5'NCR基因、hMPV的L-polymerase基因、InfA和InfB的matrix基因、RSVA和RSVB的fusion基因、PIV的hemagglutinin-neuraminidase基因，通过引物设计软件分析各引物Tm值以及各引物间二聚体的形成，确定所述引物序列。 

进一步，所述步骤3）中进行核酸外切酶处理PCR产物，其过程为：7.5μl的各组PCR产物分别加入3.0μl的Exo置于PCR仪器中37℃，30min，80℃，15min。 

进一步，所述步骤4）中杂交过程为： 

1）将1ml包装中的编码微球震荡20s，超声20s，直至编码微球分散； 

2）每种编码微球各取10μl至200μl EP管，8000rmp3min，小心吸出上清，留10μl于管内； 

3）编码微球重悬于35μl1×Tm杂交液中； 

4）加5μl TSPE产物，轻轻吹打混匀； 

5）96℃，90s，37℃，30min； 

6）向抽滤板各孔加100μl1×Tm杂交液，预润； 

7）现制一定浓度的SAPE溶液，避光保存； 

8）配制洗脱所需的1×Tm杂交液，至于37℃放置； 

9）第5）步完成后，轻轻抽滤第6）步中的1×Tm杂交液，不可全部抽滤完，将第5）步的产物全部移至抽滤板相应孔中，轻轻抽滤； 

10）各孔加入100μl1×Tm杂交液，轻轻抽滤；此步重复1次； 

11）每孔加入75μl一定浓度的SAPE溶液，轻轻吹打混匀； 

12）37℃，避光孵育15min-20min； 

13）用液相芯片系统读取各孔荧光值。 

进一步，所述编码微球为包被有anti-TAG的编码微球。 

进一步，所述TSPE的反应条件为：96℃,10min；94℃90s,55℃90s,74℃2min，40个循环。 

进一步，所述非诊断性检测方法采用的仪器和试剂为：悬浮芯片系统Bio-Plex，Bio-Rad；编码微球；ExoSAP-IT试剂盒；Platinum Tsp DNA polymerase,ASPE10X Buffer，50mM MgCl2，dNTPs，Biotin-14-dCTP Invitrogen；Triton X-100。 

本发明选择流感病毒（A、B型），副流感病毒（1、3型），冠状病毒（SARS、NL63）、呼吸道合胞病毒（A、B型），腺病毒（B、E型），鼻病毒、人偏肺病毒和肠道病毒作代表病原体，建立悬浮芯片同时快速检测十三种呼吸道病毒及其亚型的模型，为及时应对呼吸道感染疫情提供重要信息。TSPE技术检测呼吸道病毒，整个流程从PCR扩增到得到检测结果，共计7小时，具有快速、高通量、灵敏、特异、稳定等特点，可用于多种呼吸道病原的快速筛查。 

附图说明

图1为优化后第一组TSPE检测信号柱状图； 

图2为优化后第二组TSPE检测信号柱状图； 

图3为优化后第三组TSPE检测信号柱状图； 

图4为优化后第四组TSPE检测信号柱状图； 

图5为悬浮芯片多重检测体系Parainfluenza virus3反应曲线图； 

图6为悬浮芯片多重检测体系Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus反应曲线图； 

图7为悬浮芯片多重检测体系Human Metapneumovirus反应曲线图； 

图8为悬浮芯片多重检测体系Adenovirus B反应曲线图； 

图9为悬浮芯片多重检测体系Respiratory Syncytial Virus B反应曲线图； 

图10为悬浮芯片多重检测体系Adenovirus E;X-axis：Concentration（pg/test）;Y-axis:MFI反应曲线图。 

具体实施方式

下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。 

本发明选择流感病毒（A、B型），副流感病毒（1、3型），冠状病毒（SARS、NL63）、呼吸道合胞病毒（A、B型），腺病毒（B、E型），鼻病毒、人偏肺病毒和肠道病毒作代表病原体，建立悬浮芯片同时快速检测十三种呼吸道病毒及其亚型的模型，为及时应对呼吸道感染疫情提供重要信息。 

病毒核酸来源：查阅文献，选择各病毒的保守基因片段，在NCBI网站 上找出选定保守基因的片段序列。 

主要仪器和试剂：悬浮芯片系统（Bio-Plex，Bio-Rad）；编码微球（Luminex）；ExoSAP-IT试剂盒（USB）；Platinum Tsp DNA polymerase,ASPE10X Buffer，50mM MgCl2，dNTPs，Biotin-14-dCTP（Invitrogen）；Triton X-100（Sigma）。 

本发明基于新型悬浮芯片技术的13种/型呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法，具体为： 

1）多重PCR体系分组： 

根据解链温度、扩增片段大小、病毒种类，将13种/型呼吸道病毒及其亚型分为四组。第1组包括PIV3、SARS、Inf B、RSVA，第2组包括Inf A、NL63，第3组AdB、hMPV、HRV，第4组RSVB、AdE、PIV1、EnV。 

2）多重PCR引物设计：查阅文献，分别选择Ad的Hexon基因、Cov-229E、Cov-NL63、SARS-Cov的nucleocapsid基因、EnV和HRV的5'NCR基因、hMPV的L-polymerase基因、Inf的matrix基因、RSVA和B的fusion基因、PIV的hemagglutinin-neuraminidase基因，通过引物设计软件分析各引物Tm值以及各引物间二聚体的形成，最终确定引物序列。详见下表1： 

表1十三种呼吸道病毒引物及探针序列 

Table2The genus/species-specific primers and probes of thirteen Respiratory Viruses 

。 

3）多重PCR条件优化；通过单因素条件试验，分别对退火温度、引物对浓度进行优化。 

以两种病毒各选定基因为模板，PCR扩增，反应后以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。 

4）核酸外切酶（Exonuclease I，Exo）处理PCR产物：7.5μl的各组PCR产物分别加入3.0μl的Exo置于PCR仪器中37℃，30min，80℃，15min。 

5）探针设计：通过生物信息学及GenBank基因序列信息，应用分子生物学软件DNA Star设计病毒特异性探针。详见表1。 

6）TSPE反应条件优化：通过单因素条件试验，分别对探针浓度、退火温度、生物素化dCTP浓度、以及PCR产物加入量进行优化。 

7）杂交： 

（1）将1ml包装中的编码微球震荡20s，超声20s，直至编码微球分散； 

（2）每种编码微球各取10μl至200μl EP管，8000rmp3min，小心吸出上清，留10μl于管内； 

（3）编码微球重悬于35μl1×Tm杂交液中； 

（4）加5μl TSPE产物，轻轻吹打混匀； 

（5）96℃，90s，37℃，30min； 

（6）向抽滤板各孔加100μl1×Tm杂交液，预润； 

（7）现制一定浓度的SAPE溶液，避光保存； 

（8）配制洗脱所需的1×Tm杂交液，至于37℃放置； 

（9）第5）步完成后，轻轻抽滤第6）步中的1×Tm杂交液，不可全 部抽滤完，将第5）步的产物全部移至抽滤板相应孔中，轻轻抽滤； 

（10）各孔加入100μl1×Tm杂交液，轻轻抽滤；此步重复1次； 

（11）每孔加入75μl一定浓度的SAPE溶液，轻轻吹打混匀； 

（12）37℃，避光孵育15min-20min； 

（13）用液相芯片系统（Luminex-100或Luminex-200）读取各孔荧光值(MFI)。 

8）多重检测体系的建立及结果判读：以组为单位，混合包被有anti-TAG的编码微球，组成多重检测体系。Bio-Plex悬浮芯片系统读取MFI值，以本底荧光值（BFI）的3倍作为阳性判断值（cut-off）。 

灵敏度、特异性检测： 

灵敏度检测：测定各组待检病毒的模板DNA浓度，分别进行梯度系列稀释，PCR扩增后，以优化后TSPE体系进行检测，Bio-Plex Version4.0分析，得出剂量-反应曲线。 

以单一模板和体系内所有引物配对进行试验，多重PCR扩增、TSPE处理、杂交，进行特异性检测。 

以各组提取的质粒为模板，PCR扩增后，使用同一批连有anti-TAG的编码微球，对同一批PCR产物进行检测，重复10次，每次做两个平行样，取MFI均值进行计算。 

结果：优化后各组TSPE体系，反应条件：96℃,10min；94℃90s,55℃90s,74℃2min，40个循环。优化后各组TSPE检测信号柱状图如图1至图4。 

多重悬浮芯片检测体系的灵敏度： 

各病毒的检出限：副流感病毒3型(PIV3)为413.43pg/反应体系；副流感病毒1型(PIV1)为46pg/反应体系；流感病毒A型（InfA）为33.38pg/反应体系；流感病毒B型（InfB）为159.27ng/反应体系;冠状病毒SARS为9.5pg/反应体系；冠状病毒（NL63）为0.18pg/反应体系；呼吸道合胞病毒A型(RSVA)为400pg/反应体系；呼吸道合胞病毒B型(RSVB)为7.8pg/反应体系；腺病毒B型(AdB)为102.66pg/反应体系；腺病毒E型(AdE)为0.079pg/反应体系；人偏肺病毒(hMPV)为50.39pg/反应体系；鼻病毒(HRV)为6.25pg/反应体系；肠道病毒(EnV)为32pg/反应体系。详见见图5-图10。 

多重悬浮芯片检测体系的特异性：特异性实验结果显示为出现交叉反应，检测体系特异性良好。 

多重悬浮芯片检测体系的重复性：观察10次检测的MFI，以10次实验的（MFI-BFI）/BFI进行计算，检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性。 

人类基因组草图绘制完成，标志人类历史进入后基因组时代。大量基因信息的涌现，开发高通量核酸检测技术变得越发迫切。20世纪90年代中期，美国Luminex公司将流式细胞仪、数字信号处理器和激光检测装置相结合，开发出一种具有多指标同步分析(xMAP)功能的芯片技术，也称悬浮芯片技术(suspension array)或液态芯片技术(liquid chip)。该技术在细菌检测、病毒检测、SNP检测等领域中广泛应用。悬浮芯片技术具有高效、快速、稳定、准确、可同步、重复性好、抗干扰能力强等优点。Luminex公司基于TSPE技术开发研制的可同时检测鉴定12种特殊呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒检测板，由FDA于2008年1月批准在美国上市。 

本发明选择流感病毒（A、B型），副流感病毒（1、3型），冠状病毒（SARS、NL63）、呼吸道合胞病毒（A、B型），腺病毒（B、E型），鼻病毒、人偏肺病毒和肠道病毒作代表病原体，通过优化多重PCR扩增体系以及多重TSPE延伸体系，特异、灵敏地检测十三种呼吸道病毒及其亚型，并建立悬浮芯片同时快速多种呼吸道病原的模型。 

研究中，主要有以下几方面引起我们的注意：PCR的扩增效率、引物和探针的特异性是保证试验方法灵敏度和特异性的前提，因此引物和探针的设计非常重要。在引物设计上，应综合考虑引物自身二聚体、引物间的交叉配对以及引物解链温度等因素。实验共设计八对简并引物扩增十三种呼吸道病毒,在设计简并引物时，某位点的碱基简并数不要超过3个、同一引物简并位点不易太多，否则将影响多重PCR扩增效率。除设计引物外，并对各组多重PCR体系部分反应成分进行优化，以期在各体系中达到目的片段的最优扩增。运用TSPE技术，探针特异性识别处理后的PCR产物，并作为TSPE过程延伸的起始。探针的5′端链接TAG、3′端作为延伸起始端，因此在探针设计上，对3′端的碱基配对的要求尤为严格，可选择G+C%含量较高的部位作为探针3’端。A-T互补配对形成两个氢键，G-C互补配对形成三个氢键，G-C配对更为牢固，应避免连续三个以上的G或C出现。呼吸道病毒变异株多，需设计简并探针，在3’端尽量避免简并碱基，以免影响延伸效率。 探针长度一般为18～20bp，特殊情况下可长至22～24bp，探针不易过短，以免发生非特异性互补配对。TSPE技术对PCR产物大小无严格限制，因而在探针长度方面，应考虑PCR产物大小，适当延长探针长度。 

除引物和探针性质影响技术特异性和灵敏度外，还有其他影响因素。TSPE技术运用于样品检测，还需注意样品收集、运输、保存及样品核酸提取等过程均对方法灵敏度及特异性有一定影响。多重PCR过程中，样品核酸加入量不同也将影响检测灵敏度与特异性，需试验确定最佳加入量。检测样品时除对样品核酸浓度有高要求外，还需针对整个检测过程设计质控。设置以下对照：阴性对照，选择海洋生物Thermotoga maritima的核酸Mt7片段为阴性对照，该段核酸不存在呼吸道样品中，不发生非特异反应，获得低MFI；阳性质控，选择专门针对呼吸道病毒检测的RANasP；荧光质控是在Mt7核酸片段上加入荧光染料，监测杂交过程中生物素-亲和素反应是否正常。 

悬浮芯片结合X-TAG标记、TSPE技术联用检测呼吸道病毒，整个流程从核酸提取、PCR扩增到得到检测结果，共计7小时，具有快速、高通量、灵敏、特异、稳定等特点，可用于多种呼吸道病原的快速筛查，可应用与海关各种携带病毒物品、动物源食品等的检测。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国检验检疫科学研究院

 

<120>  基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法

 

<130>  发明

 

<160>  24    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  AdB-Hexon-f

 

<400>  1

CAGAAACTTCCAGCCYATGAG                                               21

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  AdB-Hexon-r

 

<400>  2

TGCACTCTGACCACGTCGAA                                                20

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  AdB

 

<400>  3

TCATCCATGGGATCCACCTCAAA                                             23

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  AdE-Hexon-f

 

<400>  4

CAACTTCTGGAACTGACACAG                                               21

 

<210>  5

<211>  23

<212>  DNA

<213>  AdE-Hexon-r

 

<400>  5

CAATATCTGGATCGTAGTTAGC                                              22

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  AdE

 

<400>  6

TCCTTTAGAGCTCTGCCTCCATA                                             23

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  NL63-nucleocapsid-f

 

<400>  7

TGATAACCAGTCGAAGTCACCT                                              22

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  NL63-nucleocapsid-r

 

<400>  8

CAACACCATTCTGAACAAGATCTG                                            24

 

<210>  9

<211>  23

<212>  DNA

<213>  NL63

 

<400>  9

CCTGGGTTGAGAAAGAGGCTTA                                              22

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  SARS-nucleocapsid-f

 

<400>  10

GTCTTGGTTCACAGCTCTCA                                                20

 

<210>  11

<211>  23

<212>  DNA

<213>  SARS-nucleocapsid-r

 

<400>  11

TTGCGGGTGCCAATGTGG                                                  18

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  SARS

 

<400>  12

GGTGTATTCAAGGCTCCCTCA                                               21

 

 

<210>  13

<211>  23

<212>  DNA

<213>  EnV-5'NCR-f

 

<400>  13

CCCTGAATGCGGCTAATC                                                  18

 

<210>  14

<211>  20

<212>  DNA

<213>  EnV-5'NCR-r

 

<400>  14

ATTGTCACCATAAGCAGCCA                                                20

 

<210>  15

<211>  23

<212>  DNA

<213>  EnV

 

<400>  15

GAAACACGGACACCCAAAGTAGT                                             23

 

<210>  16

<211>  20

<212>  DNA

<213>  HRV-5'NCR-f

 

<400>  16

TGAAGAGCCSCGTGTGCT                                                  18

 

 

<210>  17

<211>  23

<212>  DNA

<213>  HRV-5'NCR-r

 

<400>  17

AACACGGACACCCAAAGTAGT                                               21

 

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  HRV

 

<400>  18

GTTAGCCRCATTCAGGGGCC                                                20

 

<210>  19

<211>  23

<212>  DNA

<213>  hMPV-L-polymerase-f

 

<400>  19

AGAGARGAAGTAATAAGAACYGG                                             23

 

<210>  20

<211>  20

<212>  DNA

<213>  hMPV-L-polymerase-r

 

<400>  20

CTAGTACTGAATTGAGCATGYTCAG                                           25

 

 

<210>  21

<211>  23

<212>  DNA

<213>  hMPV

 

<400>  21

CATCACATCTTTCCATGTTAACAGTTG                                         27

 

<210>  22

<211>  20

<212>  DNA

<213>  RSVA-fusion-f

 

<400>  22

AGYAGCTCCGTTATCACATCT                                               21

 

<210>  23

<211>  23

<212>  DNA

<213>  RSVA-fusion-r

 

<400>  23

GATACATAATCRCACCCGTTAG                                              22

 

<210>  24

<211>  20

<212>  DNA

<213>  RSVA

 

<400>  24

TGCCATAGCATGACACAATGGCT                                             23

 

 

<210>  25

<211>  23

<212>  DNA

<213>  RSVB-fusion-f

 

<400>  25

GTCAAACAAAGGAGTAGATACTG                                             23

 

<210>  26

<211>  20

<212>  DNA

<213>  RSVB-fusion-r

 

<400>  26

TTCCACTTAGTTGGTCTTTGC                                               21

 

<210>  27

<211>  23

<212>  DNA

<213>  RSVB

 

<400>  27

ATGCATCAAACTCATCAGAAGGAAAC                                          26

 

<210>  28

<211>  20

<212>  DNA

<213>  InfA-matrix-f

 

<400>  28

ACTGCAGCGTAGACGCTTTGT                                               21

 

<210>  29

<211>  23

<212>  DNA

<213>  InfA-matrix-r

 

<400>  29

AGCRACCTCCATGGCYTC                                                  18

 

<210>  30

<211>  20

<212>  DNA

<213>  InfA

 

<400>  30

CATCCTGTTGTATATGAGKCCCAT                                            24

 

 

<210>  31

<211>  23

<212>  DNA

<213>  InfB-matrix-f

 

<400>  31

GAGAAGATGTGTGAGCTTTCAT                                              22

 

<210>  32

<211>  20

<212>  DNA

<213>  InfB-matrix-r

 

<400>  32

CATAGCTGAGACCATCTGCAT                                               21

 

<210>  33

<211>  23

<212>  DNA

<213>  InfB

 

<400>  33

ACAAAGCACAGAGCGTTCCTAGT                                             23

 

<210>  34

<211>  20

<212>  DNA

<213>  PIV1-hemagglutinin-neuraminidase-f

 

<400>  34

CTCATTATTACCYGGACCAAGT                                              22

 

 

<210>  35

<211>  23

<212>  DNA

<213>  PIV1-hemagglutinin-neuraminidase-r

 

<400>  35

TCCTGTTGTCGTTGATGTCATA                                              22

 

<210>  36

<211>  20

<212>  DNA

<213>  PIV1

 

<400>  36

GATGAATACGCATATATTGCATCACC                                          26

 

 

<210>  37

<211>  20

<212>  DNA

<213>  PIV3-hemagglutinin-neuraminidase-f

 

<400>  37

TGCACGTCTGGTCTTCCAT                                                 19

 

 

<210>  38

<211>  23

<212>  DNA

<213>  PIV3-hemagglutinin-neuraminidase-r

 

<400>  38

TCTTCTATCCCTGATGATGCAT                                              22

 

<210>  39

<211>  20

<212>  DNA

<213>  PIV3

 

<400>  39

TTAAGTCAGGTACCAAGTCTGAGTTTA                                         27