一种室内鉴定草莓是否抗炭疽病的方法

摘要

本发明提供一种室内鉴定草莓是否抗炭疽病的方法，该方法包括：切取草莓的匍匐茎，切取的长度为8-20厘米的茎段，茎段底用石腊封住断面，将顶端断面浸入摇动的5×10

说明书

技术领域

本发明是鉴定草莓品种对草莓炭疽病抗性的一种新方法，属于植物病害抗性鉴定技术。

背景技术

炭疽病是目前草莓上的主要病害之一，特别对红颊、章姬等目前市场上商品性最好草莓品种而言。草莓炭疽病是典型的高温高湿型病害。病菌以分生孢子在发病组织或病残体中越冬，次年分生孢子借雨水、操作工具、病叶、病果等传播。

草莓炭疽病主要发生在夏季草莓育苗期及随后的初秋草莓定植期,严重影响到草莓的产量和品质。草莓炭疽病主要为害匍匐茎、叶柄、叶片、托叶、花瓣，最能确认症状的部位是匍匐茎。发生危害初始产生纺锤形或椭圆形病斑，当病斑扩展成为环形圈时，病斑以上部分萎蔫枯死，湿度高时病部可见肉红色黏质孢子堆。该病除引起局部病斑外，还易导致草莓苗整株萎蔫死亡，随着病情加重，则全株枯死。根茎部横切面观察，可见自外向内发生局部褐变。

草莓生产中采用匍匐茎无性繁殖。草莓匍匐茎由新茎的腋芽当年萌发形成，是草莓主要的营养繁殖器官。匍匐茎细长柔软，节间长。抽生匍匐茎能力强的品种，每棵母株可产生100～150株匍匐茎苗。

草莓炭疽病一旦爆发后，基本无药可治，目前生产上主要采取发病前期药剂防治，发病后期拔除病株，控害的效果都不理想。因此，针对这一病害最经济有效的方法是选育抗病品种应用于生产。目前，抗病育种中多使用苗期活体接种鉴定，虽然抗性结果比较准确，但是由于接种后需要高温高湿条件，使可鉴定时期较短，而且费时事费力，另外也有通过叶片或叶柄离体鉴定，但是效果都不理想，而且也没有具体的可操作性的规范。由于炭疽病病毒的易扩散性和高危害性，只能在特定隔离的温室或大棚进行。这些都严重影响了草莓品种炭疽病抗性鉴定的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定草莓品种对草莓炭疽病抗性的新方法。本发明主要服务于针对草莓炭疽病开展抗病品种选育的各种单位，可对抗草莓炭疽病材料进行当代选择，有利于加快抗病品种的选育。同时该技术还可以在草莓抗炭疽病的遗传学和转基因研究工作中作为生物学检测方法应用，将大大加快研究进程。

本发明提供的对草莓炭疽病抗性的鉴定方法，是根据草莓匍匐茎繁殖的特性，采摘植株上抽发的匍匐茎，在可控条件下可以常年进行抗性鉴定，并根据匍匐茎的抗性表现，对整个植株的抗性进行评价。

本发明提供一种室内鉴定草莓是否抗炭疽病的方法，该方法包括：切取草莓的 匍匐茎，切取的长度为8-20厘米的茎段，底部用石腊封住断面，将顶端断面浸入摇动的5×10⁵个／m1的孢子悬浊液中，其中，浸入的深度为5-7厘米。

在一些优选的方式中，当切取的长度为8厘米的时候，浸入摇动的5×10⁵个／m1的孢子悬浊液的深度为5毫米。

在一些优选的方式中，当切取的长度为10厘米的时候，浸入摇动的5×10⁵个／m1的孢子悬浊液的深度为6毫米。

在一些优选的方式中，当切取的长度为20厘米的时候，浸入摇动的5×10⁵个／m1的孢子悬浊液的深度为7毫米。

在一些优选的方式中，把用孢子液体出的匍匐茎放入到放在垫有微湿吸水纸的培养皿内，在人工气候箱内中使其发病，培养7天后调查病斑长度。优选的，人工气候箱内90%以上的湿度保湿48小时后，然后保持湿度80%；温度和光照尽量模拟田间环境变化，条件如下：上午8：00－12：00，温度25℃，光照1500lux；中午12：00－15：00，温度30℃，光照4000lux；下午15：00－18：00，温度25℃，光照1500lux；晚上18：00－第二天上午8：00，温度20℃，黑暗。

在一些优选的方式中，将发病严重程度分按照下列的方式进行分级：0级：无病；1级：病斑平均长度≤15 mm；3级：病斑平均长度在15.1～20mm；5级：病斑平均长度在20.1～25mm；7级：病斑平均长度为25.1～30mm；9级：病斑平均长度>30mm。

有益效果

本方法较传统的苗期活体鉴定法具有以下优点：1、更适用于草莓炭疽病抗性品种的选育和遗传分析。传统田间活体鉴定的感病植株往往很快出现死苗，既无法获得后代子苗，也不利于采集叶片进行分子生物学分析，而本方法由于采用匍匐茎鉴定抗性，草莓植株整体得以保存，因此可进行当代选择，大大加快了品种选育和遗传研究的进程。

2、鉴定结果的准确性和精确性更高。同样是因为采用了匍匐茎鉴定，可以每株取多个匍匐茎进行重复试验，提高了鉴定结果的精确性。而当某一材料因其它因素导致未能鉴定出结果时，也可以通过再次取匍匐茎重新鉴定，提高结果的准确性。

3、拓宽了抗性鉴定的时间，增加了鉴定次数。草莓活体植株田间鉴定一般只能在夏季高温高湿时进行，而本方法的离体室内鉴定可以在草莓有匍匐茎的任何时节多次进行，包括夏季育苗期和冬季结果期。

具体实施方法

实施例1、草莓不同品种红颊、章姬、丰香、甜查理对草莓炭疽病的室内接种鉴定

鉴定方法如下：

1、          接种分生孢子的培养和悬菌液的准备。

接种用的草莓炭疽病菌是本发明小组自行从田间发病株上分离的菌株(C.gloeosporioides)，这是我国草莓生产上最多见的草莓炭疽病小种（2011年7月取自建德市航头镇的红颊草莓育苗基地，现保存在杭州市农业科学研究院生物所实验室）。25℃条件下，菌株在PDA培养基上常规培养7天后刮除菌丝，14天后刮取分生孢子堆用无菌水配成悬菌液，浓度调整为5×10⁵个／m1。

2、接种植物材料的准备。

草莓品种红颊、章姬、丰香、甜查理。每个草莓品种取苗各50株，移栽到营养钵中，待其抽发出匍匐茎时用如下方法进行匍匐茎离体鉴定。

3、接种鉴定

从每个品种的田间草莓植株上采集新抽发匍匐茎，每个品种选取匍匐茎，切取长度分别为6cm 、8cm、10 cm、20 cm左右的茎段，底部断面用石腊封住，将顶端断面浸入摇动的5×10⁵个／m1的孢子悬浊液中。

每个不同长度的匍匐茎浸入孢子悬浊液的深度分别为：

６厘米长匍匐茎的深度为1毫米、3毫米；

8厘米长匍匐茎的深度为2毫米、5毫米、7毫米；

10厘米长匍匐茎的深度为3毫米、6毫米、8毫米；

20厘米长匍匐茎的深度为5毫米、7毫米、10毫米。

接种后取出，放在垫有微湿吸水纸的培养皿内，在人工气候箱内中使其发病，调查病斑长度。每个不同的处理选取15个匍匐茎作为处理，并重复3次。

在所有以上处理接种后，人工气候箱内90%以上的湿度保湿48小时后，然后保持湿度80%。温度和光照尽量模拟田间环境变化，条件如下：上午8：00－12：00，温度25℃，光照1500lux左右；中午12：00－15：00，温度30℃，光照4000lux左右；下午15：00－18：00，温度25℃，光照1500lux左右；晚上18：00－第二天上午8：00，温度20℃，黑暗。

培养7天后观察并逐个记载匍匐茎发病的长度，将发病严重程度分为如下6级：

0级：无病；

1级：病斑平均长度≤15 mm；

3级：病斑平均长度在15.1～20mm；

5级：病斑平均长度在20.1～25mm；

7级：病斑平均长度为25.1～30mm；

9级：病斑平均长度>30mm。

调查处理后的发病率和病情指数：

发病率(DR)(％)=发病株数／调查株数×lO0；

病情指数(DI)= [∑(各级发病株数×病级数)／(最高发病级数×调查株数)]×l00

品种群体抗病性划分标准 DI=O：免疫；0<DI≤15:高抗（HR）；15<DI≤25:抗(R)；25<DI≤40:中抗(MR)；40<DI≤60:中感(MS)；60<DI≤80:感(S)； 80<DI≤100：高感(HS)。

4、匍匐茎离体鉴定结果

结果如下表所示，不同的处理获得不同的抗性结果。

表1：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长６厘米，浸入深度为1毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊86.765.7S章姬80.059.2ＭS丰香60.052.3ＭS甜查理33.317.6R

表2：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长６厘米，浸入深度为3毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊86.768.1S章姬86.759.9ＭS丰香60.053.4ＭS甜查理40.020.7R

表3：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长8厘米，浸入深度为2毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊86.767.3S章姬86.760.5S丰香53.352.2MS甜查理40.018.7R

表4：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长8厘米，浸入深度为5毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊93.383.3HS章姬86.784.1HS丰香60.055.6MS甜查理46.719.6R

表5：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长8厘米，浸入深度为７毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊100.086.8HＳ章姬100.087.4HＳ丰香80.060.2Ｓ甜查理73.330.9MR

表6：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长１０厘米，浸入深度为3毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊86.761.7HS章姬80.057.9MS丰香53.351.1MS甜查理33.316.9R

表7：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长１０厘米，浸入深度为6毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊93.383.9HS章姬93.383.1HS丰香66.755.9MS甜查理46.720.7R

表8：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长１０厘米，浸入深度为8毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊93.385.7HＳ章姬100.086.9HＳ丰香80.061.2Ｓ甜查理73.330.5MR

表9：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长２０厘米，浸入深度为5毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊86.780.4HS章姬86.779.8S丰香53.349.6MS甜查理40.018.5R

表10：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长２０厘米，浸入深度为7毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊93.382.8HS章姬86.781.7HS丰香66.753.2MS甜查理46.720.3R

表11：匍匐茎离体鉴定结果（匍匐茎长２０厘米，浸入深度为１０毫米）

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊10086.6HＳ章姬100.085.7HＳ丰香86.762.3Ｓ甜查理80.031.5MR

实施例２、草莓品种红颊、章姬、丰香、甜查理对草莓炭疽病的田间接种鉴定

草莓品种红颊和章姬、丰香、甜查理各50株无病害苗。每个草莓品种取苗各50株，移栽到营养钵中，长到5-6叶时进行苗期接种鉴定。

将5×10⁵个／m1孢子浓度的悬菌液对营养钵中的草莓苗进行喷雾接种，90%以上的相对湿度保湿48小时，在平均气温25℃的环境中培养显症，7天后调查植株匍匐茎或叶柄发病情况（王丰，马跃，高秀岩，等.草莓品种对炭疽病抗性的鉴定技术研究.果树学报，2008，25(4)：542-547.）。对不同草莓品种进行接种。

表12、田间实际鉴定结果如下

品种名称发病率病情指数抗性划分红颊96.081.8HS章姬94.080.4HS丰香80.043.2MS甜查理68.018.9R

实验结论：从以上田间实验可以明显看出，在用匍匐茎进行草莓炭疽病室内抗性筛选的时候，要想获得比较可靠的结果，匍匐茎的长度和浸入孢子溶液深度有很大的关系。当长度在６厘米的时候，浸入孢子溶液的深度为１-３毫米不能起到筛选的目的；当长度为８厘米的时候，浸入孢子溶液的深度至少在５毫米左右的深度可以到达筛选的目的；当长度为1０厘米的时候，浸入孢子溶液的深度至少在6毫米左右的深度可以到达筛选的目的；20厘米长的时候，浸入孢子溶液的深度至少在7毫米左右的深度可以到达筛选的目的。但是，如果浸入的太长也会影响筛选的结果。

实施例3 ，采用匍匐茎长为8厘米，浸入悬浮孢子的浓度5×10⁵个／m1对10个不同草莓品种对炭疽病进行室内鉴定，同时再在田间对室内鉴定的结果进行验证。除了供实品种不同外，具体实验方法和实施例1和2完全相同。结果发现在室内鉴定的1个高抗品种在田间也表现为高抗，在室内为鉴定为3个高感品种，在田间也为3个相同的高感品种，室内鉴定的结果和田间的鉴定结果均一致（具体实验数据略）。