促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基及其应用

摘要

本发明公开了一种促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化培养的培养基及其应用，以Invitrogen公司所公布的DMEM/F12配方为基础，并对培养基中的氨基酸组成成分进行了改进。本发明的培养基在对乳腺上皮细胞的活性要显著高于DMEM/F12培养基；与商品化DMEM/F12培养基相比乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表达显著上调(P＜0.05)，上调量分别达到了3.57倍和3.27倍，此外，本发明的培养基在奶牛乳腺上皮细胞增殖、泌乳相关基因表达和酪蛋白合成方无负面影响。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化 的培养基及其应用。

背景技术

随着生物学技术的发展，体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可作为一种较理 想的模型用来研究乳蛋白基因表达，但是在体外利用乳腺上皮细胞作为模型研究 氨基酸对乳蛋白合成的影响时遇到了问题，目前研究者在培养奶牛乳腺上皮细胞 时大都使用DMEM/F12培养基，在使用DMEM/F12培养基条件下在奶牛乳腺上皮 细胞CSN1S1、CSN3基因表达量较低，说明此种培养基促进奶牛乳腺上皮细胞体 外分化培养的效果不明显。本发明依据Invitrogen公司所公布的DMEM/F12配方 对培养基进行了改进，进而达到在体外促进奶牛乳腺上皮细胞分化的目的。

发明内容

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种氨基酸含量优化后促进奶牛乳 腺上皮细胞体外分化的培养基及其应用。

本发明的技术方案：

本发明一方面涉及一种促进奶牛乳腺上皮细胞体外分化的培养基，所述培养 基的配方如下：

在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基的pH值介于7.0-7.4之间。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的培养基中包括或者不包括除水以 外的其它组分。

本发明另一方面还涉及上述培养基在制备乳腺上皮细胞时上调该细胞 CSN1S1和/或CSN3基因表达中的制剂中的应用。

本发明的培养基与商品化DMEM/F12培养基相比乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3 基因表达显著上调(P＜0.05)，上调量分别达到了3.57倍和3.27倍，此外，本 发明的培养基在奶牛乳腺上皮细胞增殖、泌乳相关基因表达和酪蛋白合成方面无 负面影响。

附图说明

图1酶消化法所获得的不同时期细胞的形态；

图2培养的奶牛乳腺上皮细胞角蛋白免疫组化鉴定(×400)；

图3MTT法检测的两种培养基的细胞活性；

图4奶牛乳腺上皮细胞增殖培养基对乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表 达量的影响；

具体实施方式

1.1主要试剂

胎牛血清(Gibco10099-141)、0.25％Trypsin-EDTA(Gibco25200-056)、DMSO (Sigma D2650)、双抗(Gibco15140-122)、胰岛素转铁蛋白(Gibco51500-056)、 胶原酶II(Gibco17101-015)、EGF(Gibco PHG-0313)、DPBS(Hyclone  SH30028-01B)、MTT(AMRES10)、催乳素(Sigma L6520)、氢化可的松(Sigma  H0135)、L-谷氨酰胺(Sigma G-8540)、角蛋白18小鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠 IgG-FITC(上海生工)、SYBR Premix Ex Taq T M II(TaKaRa DRR081)、细胞总 RNA提取试剂盒(TIANGEN DP430)。

1.2原代乳腺上皮细胞的培养

选取泌乳中期的健康中国荷斯坦奶牛，采集乳腺深层组织适量(注意避开结 缔组织和脂肪组织)，放入加有双抗的DMEM/F12培养基中，放入保温盒中迅 速带回实验室。在超净台中用含有3倍双抗的DPBS溶液冲洗乳腺组织块3遍， 再放入75％的乙醇溶液中浸泡30s，再用含有1倍双抗的DPBS溶液冲洗至清澈。 在培养皿中使用眼科剪刀和镊子精细选取腺泡组织，放入5ml细胞冻存管中，再 次使用眼科剪刀将其剪碎，放入等体积0.05％II型胶原酶溶液，放置于37℃、5％ CO₂培养箱消化90min，期间每隔20min震荡一次。取出已消化完成的溶液，使 用80目网筛过滤，将滤液移入15ml离心管中，1500r/min离心3min，弃去上清 液，加入培养基后重新悬浮，接种于25cm²细胞培养瓶中，放入37℃、5％CO₂培 养箱内培养。

1.3乳腺上皮细胞鉴定

将纯化好的乳腺上皮细胞以2×10⁴个/mL接种到35mm培养皿中，待细胞 长成半汇合单层时进行免疫荧光染色，使用倒置荧光显微镜进行观察。

1.4奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基的配制

奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基成分及含量见表1。

表1奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基成分及含量

1.5奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基对乳腺上皮细胞增殖活力的影响

试验采用完全随机试验设计，对照组为DMEM/F12培养基，试验组为促分 化培养基。每组5个重复，试验重复3遍。将乳腺上皮细胞悬浮液以2×10⁴个/mL 接种于96孔培养板中(corning)，每孔200μl，然后将96孔板置于37℃、5％CO₂ 培养箱中培养2d。2d后吸出培养基，分别加入DMEM/F12和促分化培养基继续 培养24h和48h，于24h和48h分别测定OD值。培养结束前4h，每孔加20μl MTT 溶液，置于培养箱中孵育4h，终止培养，弃掉培养上清液，每孔加入200μlDMSO。 将96孔板置入酶标仪上，振荡10min，选择490nm波长，测出各孔的光吸收值， 记录结果。

1.6促分化培养基对乳腺上皮细胞泌乳相关基因表达的影响

试验采用完全随机试验设计，对照组为DMEM/F12培养基，试验组为促分 化培养基，每组3个重复，试验重复3遍。将乳腺上皮细胞悬液以2×10⁵个/ml 的浓度接种于六孔板中，每孔加入5ml培养基，培养直至细胞生长达80％-90％ 时，弃掉培养板中的培养基，分别添加DMEM/F12和促分化培养基继续培养36h 后提取细胞总RNA，然后立即用反转录试剂盒反转录成cDNA，应用实时定量 PCR仪进行定量分析，引物信息如表2所示。

表2Real-Time PCR所用引物

1.7数据分析

试验数据经Excel整理后，使用SAS9.0进行T检验分析，P＜0.05为差异 显著。

2结果与分析

2.1乳腺上皮细胞形态观察

运用倒置显微镜观察乳腺上皮细胞从原代培养到传代过程中细胞的形态。胶 原酶消化下来的细胞在接种后4-5d开始长出细胞，其中呈铺路石样生长的为乳 腺上皮细胞，细胞成岛屿状生长(图1左上)。经过纯化的F1代细胞与原代细胞 相比成纤维细胞明显减少，细胞呈鹅卵石状，细胞与细胞之间连接紧密且界限清 晰，单层生长且能见圆顶突起(图1右上)，在高倍镜下观察，可见细胞呈椭圆 形或者多角形，能见多个核仁。呈树权状的为成纤维细胞(图1左下)。胰蛋白 消化时乳腺上皮细胞呈圆形云雾状(图1右下)。

2.2乳腺上皮细胞特异性角蛋白检测

乳腺腺泡上皮中的细胞骨架蛋白主要以角蛋白7、角蛋白8和角蛋白18为 主，本试验是以角蛋白18作为一抗，采用荧光免疫细胞染色法对培养的乳腺上 皮细胞进行细胞角蛋白免疫组化鉴定，结果显示分离培养的乳腺上皮细胞角蛋白 18呈强阳性(图2-左)，而以PBS代替一抗的角蛋白为阴性(图2-右)，说明培 养的细胞为乳腺上皮细胞。

2.3促分化培养基对乳腺上皮细胞活力的影响(MTT法)

实验结果参见说明书附图3，由图3的结果可以看出，试验组与对照组间差 异显著(P＜0.0001)。24h时奶牛乳腺上皮细胞促分化培养基培养的细胞活性极 显著高于商品化DMEM/F12培养基，48h时促分化培养基对提高乳腺上皮细胞 的活性作用也显著高于DMEM/F12培养基。试验结果说明相对于DMEM/F12培 养基，促分化培养基对乳腺上皮细胞的活性更具有促进的作用。

2.4促分化培养基对乳腺上皮细胞泌乳相关基因表达的影响

由图4的结果可以看出，对照组(DMEM/F12)与试验组(促分化培养基)对 CSN1S1和CSN3基因表达量的影响差异显著(P＜0.05)，对照组相比试验组 CSN1S1、CSN3基因表达量分别上调了3.57和3.27倍。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。