一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用

摘要

一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用。其制备方法包括如下步骤：1）利用分散聚合法制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球；2）以聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球为基质制备高效疏水介质；高效疏水介质以20MPa压力装填于不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接液相色谱系统，用来纯化蛇毒降纤酶。本发明的优点在于产品纯度高、收率高、操作简便、达到产业化要求，利于推广。

说明书

技术领域

本发明属于生化领域，具体涉及一种高效疏水介质的制备方法及其在纯化蛇毒降纤酶中的应用。

技术背景

传统疏水介质的基质通常为琼脂糖、纤维素等软基质，这些基质具有生物相容性好、化学稳定性好、通透性好、非特异性吸附少等优点。但较差的机械性使它们无法运用于现代高效制备液相系统。近年发展起来的硅胶基质属于硬基质，以其为基础合成的疏水介质配合现代高效制备液相色谱仪使用，使疏水层析柱效获得了空前的提升，纯化效能大幅的提高。但由于硅胶自身较差的化学稳定性使其只能在低于pH8的条件下使用，当溶液pH值大于8时，硅胶容易发生溶解。当pH值大于10.7时，硅胶则完全溶解。此外硅胶表面未封闭的硅醇基容易产生非特异性吸附，这些都限制了硅胶成为一个合适的高效疏水层析基质。目前以硅胶为基质的疏水介质主要运用于化学合成小分子多肽的纯化。一个优秀的基质它必须具备以下性能：

1、 不溶性:基质在操作条件下不溶解于流动相。

2、 通透性:具有优良的水力学性能，流动相可以在适当的流速下通过。

3、 机械稳定性好:有合适的颗粒形状，不会发生压力形变，并有较长的使用寿命。

4、 无非特异吸附性:基质本身在层析操作条件下不会吸附蛋白质。

5、 化学稳定性好:在吸附、洗脱、再生的操作的条件下，分离介质的大分子链具有稳定的结构。

聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球是一种富含环氧基的功能高分子材料，既具备特定的物理结构。又有良好的化学反应性能，所以聚甲基丙烯酸环氧丙酯( PGMA) 微球的应用与研究已越来越受到人们的关注。中国科学院化学研究所的赵莹歆等以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)为基质, 利用还原氨化方法将肝素键合在其表面上, 得到一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料, 填料耐压可达20MPa以上。该填料对抗凝血酶Ⅲ的亲和容量为1.2 mg/g, 对抗凝血酶Ⅲ和人血清白蛋白的回收率分别为96.9%和94.4%。余晓等人以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)为基质,以胰蛋白酶抑制剂为配基合成了高效亲和色谱填料，该填料于20MPa下装填于制备色谱柱中，用于人血清白蛋白的纯化收率大于99%。杨春霞等聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质，合成一种新型弱酸性阳离子色谱填料。选用甲烷磺酸作淋洗液，在流速为1.0mL/min时，对6种无机阳离子(Li⁺)、(Na⁺)、(NH₄⁺)、(K⁺)、(Mg²⁺)、(Ca²⁺)和有机胺进行了良好分离，此色谱柱的分离效果与DionexIonPac                                                CS12A商品柱接近，但分析时间缩短了44min。因此聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)作为高效色谱填料基质应用前景广阔,效果良好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效疏水介质的制备方法，该方法制得的产品纯度高、收率高、操作简便。

本发明的另一目的在于提供该高效疏水介质在纯化蛇毒降纤酶中的应用，使其能够快速、高效的纯化高纯度蛇毒降纤酶。

本发明的目的是这样来实现的，其制备方法的步骤为：

1）   制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球

制备聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球采用的是分散聚合方法,其单体为甲基丙烯酸环氧丙酯( GMA),引发剂为偶氮二异丁腈( AIBN)或过氧化苯甲酰( BPO),稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮( PVP),反应介质为一元醇或这类醇与甲苯等其它溶剂组成的混合物。各原料组分为：甲基丙烯酸环氧丙酯50-100 g、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰1-2 g、聚乙烯吡咯烷酮5-20 g、乙醇600-800 ml、甲苯70-200 ml。

制备过程如下：将称量好的原料加入到适当的玻璃反应瓶中,使其充分溶解并通氮气除氧。然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上,于65-75摄氏度下聚合24-36h。反应结束后,用沉降方法除去溶剂,并用乙醇充分洗涤,即可得到颗粒分布基本呈现单分散的PGMA微球。

2）   以聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)微球为基质制备高效疏水介质

聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球富含环氧基基团，因此具有良好的化学反应性能，在催化剂（三氟化硼乙醚）作用下可以迅速的与醇、酚反应。得到高效疏水介质。根据配基的种类不同催化剂的加入量为0.01-0.03ml/g﹒PGMA，反应时间为30-50min，反应温度控制在45-50℃。以下是反应通式:

高效疏水介质在纯化蛇毒降纤酶中的应用：将上述合成所得高效疏水介质以20MPa压力装填于不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接于制备液相色谱系统，色谱柱平衡液为：20-50mmol/L磷酸盐、PH值为7-8.5、内含1-2mol/L硫酸铵；洗脱液为20-50mmol/L磷酸盐缓冲液、PH值为7-8.5。首先以平衡液将色谱柱平衡至基线平直，然后将降纤酶样品加入柱中， 接着以平衡液洗涤至基线平直；最后以平衡液为A相、洗脱液为B相进行梯度洗脱，得到高纯度降纤酶，活性回收大于90%。

本发明的优点在于本方法制得的产品纯度高、收率高、操作简便，非常适合工业化生产。

具体实施方式

下面以实例对本发明做进一步详细说明：

实施例一：

1）分别称取BPO 1g、PVP 5g、GMA 50g、乙醇 600ml、甲苯 70ml。将称量好的原料加入到适当的玻璃反应瓶中,使其充分溶解并通氮气除氧。然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上,于75摄氏度下聚合24h。反应结束后,用沉降方法除去溶剂,并用乙醇充分洗涤,真空干燥24h，即得到颗粒分布呈现单分散的PGMA微球。

2）将第一步所得PGMA微球50g,置于250ml玻璃反应器中（带水浴锅），加入二氧六环50ml，调节水浴温度为50℃，加入在催化剂（三氟化硼乙醚）0.5ml，搅拌5min，然后加入正丁醇5ml继续搅拌，反应时间为30min，收集微球，纯化水与二氧六环交替洗涤各三遍，最后用二氧六环洗涤两遍；干燥即得丁基聚合物微球（Butyl-PGMA）。

3）将上一步合成所得高效疏水介质Butyl-PGMA以20MPa压力装填于规格Ф2×25cm不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接于制备液相色谱系统，首先用纯化水冲洗色谱柱300ml，以去除柱内有机溶剂。然后用平衡液平衡色谱柱至基线平直（色谱柱平衡液为：20mmol/L磷酸盐、PH值为7.5、内含2mol/L硫酸铵）；取降纤酶中间体（降纤酶粗品经亲和层析所得产物，纯度80%左右，总活性198000U）0.5g，加平衡液溶解至20ml，搅拌约15min，离心取上清即为上样原液，将上样原液注入已平衡色谱柱中，接着以平衡液洗涤至基线平直；最后以平衡液为A相、洗脱液（洗脱液为20mmol/L磷酸盐缓冲液、PH值为7.5）为B相进行梯度洗脱。梯度：B%:0%-100%  60min，检测波长：220nm。收集主峰，得到降纤酶纯度为95.1%，总活性178660U。

实施例二：

1）分别称取BPO 15g、PVP 100g、GMA 750g、乙醇 7000ml、甲苯 1200ml。将称量好的原料加入到20L的玻璃反应瓶中,使其充分溶解并通氮气除氧。然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上,于70摄氏度下聚合30h。反应结束后,用沉降方法除去溶剂,并用乙醇充分洗涤,真空干燥24h，即得到颗粒分布呈现单分散的PGMA微球。

2）将第一步所得PGMA微球375g,置于1000ml玻璃反应器中（带水浴锅），加入二氧六环375ml，调节水浴温度为45℃，加入在催化剂（三氟化硼乙醚）3.75ml，搅拌5min后加入正辛醇40ml继续搅拌，反应时间为40min，收集微球，纯化水与二氧六环交替洗涤各三遍，最后用二氧六环洗涤两遍；干燥即得辛基聚合物微球（Octyl-PGMA）。

3）将上一步合成所得高效疏水介质Octyl-PGMA以20MPa压力装填于规格Ф5×25cm不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接于制备液相色谱系统，首先用纯化水冲洗色谱柱3000ml，以去除柱内有机溶剂。然后用平衡液平衡色谱柱至基线平直（色谱柱平衡液为：30mmol/L磷酸盐、PH值为8.5、内含1.5mol/L硫酸铵）；取降纤酶中间体（降纤酶粗品经亲和层析所得产物，纯度80%左右，总活性1188000U）3g，加平衡液溶解至100ml，搅拌约15min，离心取上清即为上样原液，将上样原液注入已平衡色谱柱中，接着以平衡液洗涤至基线平直；最后以平衡液为A相、洗脱液（洗脱液为30mmol/L磷酸盐缓冲液、PH值为8.5）为B相进行梯度洗脱。梯度：B%:0%-100%  60min，检测波长：220nm。收集主峰，得到降纤酶纯度为94.8%，总活性1069760U。

实施例三：

1）分别称取AIBN 15g、PVP 120g、GMA 650g、乙醇 6500ml、甲苯 1000ml。将称量好的原料加入到20L的玻璃反应瓶中,使其充分溶解并通氮气除氧。然后置反应瓶于带有旋转和加热装置的设备上,于75摄氏度下聚合36h。反应结束后,用沉降方法除去溶剂,并用乙醇充分洗涤,真空干燥24h，即得到颗粒分布呈现单分散的PGMA微球。

2）称取第一步所得PGMA微球375g,置于1000ml玻璃反应器中（带水浴锅），加入二氧六环375ml，调节水浴温度为50℃，加入在催化剂（三氟化硼乙醚）4ml，搅拌5min后加入液态苯酚40ml继续搅拌，反应时间为50min，收集微球，纯化水与二氧六环交替洗涤各三遍，最后用二氧六环洗涤两遍；干燥即得苯基聚合物微球（Phenyl-PGMA）。

3）将上一步合成所得高效疏水介质Phenyl-PGMA以20MPa压力装填于规格Ф5×25cm不锈钢色谱柱中，然后将柱子连接于制备液相色谱系统，首先用纯化水冲洗色谱柱3000ml，以去除柱内有机溶剂。然后用平衡液平衡色谱柱至基线平直（色谱柱平衡液为：50mmol/L磷酸盐、PH值为7.5、内含1.3mol/L硫酸铵）；取降纤酶中间体（降纤酶粗品经亲和层析所得产物，纯度80%左右，总活性1188000U）3g，加平衡液溶解至100ml，搅拌约15min，离心取上清即为上样原液，将上样原液注入已平衡色谱柱中，接着以平衡液洗涤至基线平直。最后以平衡液为A相、洗脱液（洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液、PH值为7.5）为B相进行梯度洗脱。梯度：B%:0%-100%  60min，检测波长：220nm。收集主峰，得到降纤酶纯度为99.5%，总活性1089890U。