一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法

摘要

本发明涉及一种植物生长发育菌液，即一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法。其步骤如下：（1）材料与处理：采集杜鹃花属植物的成熟须根，消毒，切成根段备用。（2）培养基和配置：1000mL培养基的含量为：KH2PO4380mg，MgSO4·7H2O149mg，维生素C26mg，泛酸钙67mg，烟酸1.4mg，蛋白胨3.0g，葡萄糖16.5g，琼脂粉8.5g，1.5%脱氧胆酸钠溶液4mL和0.05mg吲哚乙酸。（3）母液制备。（4）菌液制备。为长白山杜鹃花属和国内外其它种杜鹃的引种、人工繁育、栽培和育种等生产应用和基础研究提供技术方法。

说明书

技术领域　

本发明涉及一种植物生长发育菌液，即一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法。 

背景技术

在现有技术中，杜鹃是世界著名观赏植物，也是我国十大传统名花之一。我国杜鹃花资源十分丰富，是杜鹃花的重要资源和地理分布中心。但国内外对野生杜鹃花的引种、人工繁育、栽培和育种等研究开展缓慢，究其原因，大多因杜鹃花人工繁殖、栽培和生长发育等环节存在较大难点，特别是野生高山杜鹃尤为明显。长白山杜鹃花属植物包括牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)、短果杜鹃(Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜鹃(Rhododendron micranthum Turcz.)、小叶杜鹃(Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜鹃(Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)、迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)、毛毡杜鹃(Rhododendron confertissimum Nakai)和苞叶杜鹃(Rhododendron redowskianum Maxim.)等共有9个种，均为吉林省重点保护植物。

杜鹃花类菌根是真菌和杜鹃花属植物之间形成的一种共生体，它具有促进杜鹃花对营养元素的吸收、改良根际土壤，增强植物的长势、移栽成活率、抗旱和抗病力等作用。国内杜鹃花菌根真菌研究处于起步阶段，相关报道较少，大多处于基础研究阶段，一直未进入应用领域。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法，该菌液用于浸泡杜鹃花种子、浸泡组培苗根、浸泡移栽的杜鹃花根部。

本发明的技术解决方案是：一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法，其步骤如下：

（1）材料与处理：

采集杜鹃花属植物的成熟须根，消毒，切成根段备用。

（2）培养基和配置：

1000 mL培养基的含量为：KH₂PO₄380 mg，MgSO₄·7H₂O149 mg，维生素C26 mg，泛酸钙67 mg，烟酸1.4 mg，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16.5 g，琼脂粉8.5 g，1.5%脱氧胆酸钠溶液4 mL和0.05 mg吲哚乙酸。

（3）母液制备：

将步骤（1）中的根段切段后接种到培养皿中培养基表面，置于25±2 ℃的生化培养箱中培养。

待菌丝从根上发出，挑取横切面真菌菌丝，转接于新的培养基（步骤（2）中培养基）上继续培养，纯化，纯化后的菌株接种到试管内的斜面培养基上，置于3～5 ℃的低温设备中保存。

液体菌种母液的培养是将步骤（2）中培养基中的琼脂去掉后配置的液体培养基，将纯化的6个菌种Phialocephala fortinii，Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabilis，Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa分别在试管内培养至菌丝长满斜面后，分别取含有菌丝的琼脂块放入装有液体培养基的三角锥形瓶中，锡纸封住瓶口后置于恒温摇床上振荡培养15～20 d，收集500 mL培养液并以无菌水定容至1000 mL，并分装于500 mL的茶色容器中用锡纸封口后摇均，置于温度为25±2 ℃条件下保存7～10 d，期间每天摇动1～2次，每次20～30 min，即成液体菌种母液。

（4）菌液制备：

生产用菌液配置方法是液体菌种母液500 mL，红糖500 g溶解后，加水至50 L发酵7～10 d，闻到香味后即可使用。

本发明的优点是：1、本发明选取我国长白山区杜鹃花属9个品种杜鹃花的根系进行了菌根真菌的分离、纯化、初步鉴定，并完成了液体母种和生产用菌液的制备，为长白山杜鹃花属和国内外其它种杜鹃的引种、人工繁育、栽培和育种等生产应用和基础研究提供技术方法，同时，可促进杜鹃花的高效生产和推广应用。可用该菌液浸泡杜鹃花种子48 h，散播于已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土和蛭石，比例为3:1）中覆盖腐熟松针保湿，18 d可萌发，萌发率为92.1%，移栽成活率90.0%以上。杜鹃花组培苗出瓶后，用菌液浸泡组培苗根18～24 h后，将组培苗植于已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土、腐熟松针和蛭石，比例为3:2:1）中，覆盖透光性好的塑料薄膜保温保湿（炼苗）。可提高成活率至99.5%以上。杜鹃花移栽时，可将杜鹃花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12～18 h，可提高成活率至93.9%以上。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 

具体实施方式

一种利于杜鹃花属植物生长发育和菌根形成的菌液制备方法，其步骤如下：

1 材料与处理

于长白山区采集牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)、短果杜鹃(Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜鹃(Rhododendron micranthum Turcz.)、小叶杜鹃(Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜鹃(Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)、迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)、毛毡杜鹃(Rhododendron confertissimum Nakai)和苞叶杜鹃(Rhododendron redowskianum Maxim.)等9个种的杜鹃花纤细根。破土后剪取近粗根处生长健壮直径为1.0 mm以下的成熟须根，用软毛刷轻轻洗去泥土，流水冲洗过夜后剪成3～4 cm。在超净工作台下，用70%酒精（其中含有5%链霉素）消毒20 s，再用质量浓度为0.5%的次氯酸钠溶液消毒8 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干根表面水分，切除被杀毒灭菌剂损伤部分后并切成约2.0～3.0 cm左右的根段备用。

2 方法

2.1 培养基和配置

培养基成分及含量(1000 mL培养基的含量)为：KH₂PO₄380 mg，MgSO₄·7H₂O149 mg，维生素C26 mg，泛酸钙67 mg，烟酸1.4 mg，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16.5 g，琼脂粉8.5 g。

将以上组分混合均匀并溶化后分装于培养皿中，121℃湿热灭菌20～25 min取出，待溶液未凝固前，通过过滤灭菌每个培养皿中加入1.5%脱氧胆酸钠溶液4 mL和0.05 mg吲哚乙酸。

2.2 真菌的分离、纯化、初步鉴定、保存、母液和菌液制备

将步骤1中处理的根段切成0.5 cm（切口面要尽可能大）后接种到培养皿中培养基表面，每皿接3段，共10皿，置于(25±2) ℃的生化培养箱中培养。

待菌丝从根上发出，挑取横切面真菌菌丝，转接于新的培养基（步骤2.1中的培养基）上继续培养，每转接培养1次都需显微镜下观察菌株纯度，直至获得纯化菌株（形态一致）。纯化后的菌株接种到试管内的斜面培养基上，至于3～5 ℃的低温设备中保存。

采用形态学方法对纯化的菌种进行初步鉴定，将菌株接种于培养基中，至于(25±2) ℃条件下培养。并记录菌株生长速度，观察菌落特征。

液体母种的培养是将步骤2.1中培养基中的琼脂去掉后配置的液体培养基，分装到250 mL三角锥形瓶中（每瓶50～75 mL），将纯化的多个菌种分别在试管内培养至菌丝长满斜面后，分别取1.0 cm大小的含有菌丝的琼脂块放入装有液体培养基的三角锥形瓶中（每种各放1块），用适当尺寸的锡纸封住瓶口后置于恒温摇床上振荡培养15～20 d，收集500 mL培养液并以无菌水定容至1000 mL，并分装于500 mL的茶色容器中用锡纸封口后摇均，置于温度为(25±2) ℃条件下保存7～10 d（期间每天摇动1～2次，每次20～30 min）即成液体菌种母液。液体菌种母液防止于阴凉干燥处保存即可。

生产用菌液配置方法是液体菌种母液500 mL，红糖500 g溶解后，加水至50 L发酵7～10 d，闻到香味后即可使用（期间用干净的木棒每天搅拌2次）。

结果

3.1 菌根真菌的分离、纯化和初步鉴定

杜鹃花类菌根真菌生长及其缓慢，需要培养20～30天，生长稍快的菌落直径达5～7 cm，生长较慢的仅0.5～2.5 cm。

通过对9种野生杜鹃花科植物根部菌根真菌的分离培养、纯化和初步鉴定，共分离获得根内生真菌70余株，每种杜鹃花分离获得的真菌菌落形态上可以大致分为3～8种以上。

利用形态学方法鉴定得到9种杜鹃的6种杜鹃花类菌根真菌的优势种，分别为Phialocephala fortinii，Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabilis，Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa。

3.2 纯化后的菌根真菌母液和菌液制备

根据步骤2.2中方法，将含有6个菌种菌丝的琼脂块放入装有液体培养基的三角锥形瓶中进行混合培养，得到液体菌种母液。

生产用菌液配置方法是液体菌种母液500 mL，红糖500 g溶解后，加水至50 L发酵7～10 d，闻到香味后即可使用。

3.3 纯化后的菌根真菌、母液和菌液保存

纯化后的菌株接种到试管内的斜面培养基上，至于3～5 ℃的低温设备中保存。液体菌种母液防止于阴凉干燥处保存即可。

3.4 纯化后的菌根真菌菌液的应用范围及方法

应用以上真菌回接试验和菌液侵染春鹃、夏鹃、烈香杜鹃、鹿角杜鹃、羊踯躅、细叶杜香、笃斯越桔、各种盆栽杜鹃和高山杜鹃等120余种均不同程度或至少1种真菌于不同种杜鹃花形成菌根结构，但存在菌根形成快慢差异。

方法一：可用菌液浸泡杜鹃花种子48 h，散播于已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土和蛭石，比例为3:1）中覆盖腐熟松针保湿，18 d可萌发，萌发率为92.1%，移栽成活率90.0%以上。

方法二：杜鹃花组培苗出瓶后，用菌液浸泡组培苗根18～24 h后，将组培苗植于已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土、腐熟松针和蛭石，比例为3:2:1）中，覆盖透光性好的塑料薄膜保温保湿（炼苗）。可提高成活率至99.5%以上。

方法三：杜鹃花移栽时，可将杜鹃花粗根剪掉2/3，再用菌液浸泡12～18 h，可提高成活率至93.9%以上。