一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即氯霉素与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：辣根过氧化物酶标记的氯霉素单克隆抗体、氯霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的比色ELISA法比较，操作时间大幅度减少；可用作检测动物组织(猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼肉、虾肉)和牛奶中氯霉素残留检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测氯霉素的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物组织(猪肉、鸡 肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼、虾)、蜂蜜和牛奶中的氯霉素含量或残留量。属于免疫学检 测领域。

背景技术

氯霉素((Chloramphenicol，CAP)是一种廉价高效的广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细 菌都有很好的抑制作用，因此一度被广泛应用于农牧业中。但是动物源性食品随着食物链被 人体长期摄入，可引发多种疾病。轻者破坏人体内正常菌群的平衡状态，菌群失调，使人体 产生耐药菌珠，给今后患病使用抗生素治疗带来不良影响；抗生素过敏体质的人会出现过敏 反应，危及健康。严重时可干扰骨髓细胞蛋白质的合成，并抑制幼稚细胞DNA合成，导致 粒细胞减少，引发再生障碍性贫血、溶血、紫瘫等恶性疾病。

鉴于氯霉素的毒副作用，国际食品学界将其列为禁药，欧盟、美国等均在法规中规定氯 霉素残留限量标准为“零容许量”(Zerotolerance)，即不得检出，根据欧盟“2002/657/EC”标准规 定，动物源性食物中氯霉素的最大要求检出极限是0.3μg/kg。不久美国FDA也做出相应的规 定。我国农业部规定了CAP在所有食品动物的可食用组织中不得检出，并将其从《中国兽药 典》中删除，列为禁药。并相应制定了SN0219-93和SCT3018-2004行业标准，与国际接轨。

为适应更高的检测标准，检测技术水平必须相应的提高，近十年氯霉素检测技术一直是 国际专家学者研究的热门项目之一。氯霉素的检测方法分为物理化学法和免疫化学法，前者 有液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)， 检测的灵敏度均达到ppb(μg/kg)级别。当前主流的检测方法是LC-我国行业标准所使用的方 法，以及ELISA。近几年，国内外学者又研发出液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱 电喷雾电离质谱法(LC-EITMS)、微生物分析等物理检测新方法，对ELISA方法的应用也有了 进一步研究。

化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、 试剂稳定且有效期长(6～18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量 级。化学发光进口仪器与试剂性能较好，而国外的技术垄断导致化学发光仪、发光底物液和 试剂盒价格居高不下，而且试剂或试剂盒与仪器相匹配，进口试剂常常不能在国产仪器中使 用，造成化学发光免疫方法无法在基层普及。化学发光底物液是化学发光酶免疫检测方法的 关键试剂，配制出低成本且性能良好，适合国产仪器使用的的发光底物液，可降低化学发光 方法的使用成本，有利于在基层的普及。建立稳定的化学发光酶免疫分析方法，也是进行商 品化学发光试剂盒的研制的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵 敏度高、应用灵活、方便的特点。

本发明所述氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和 设在盒体内的酶标氯霉素单克隆抗体、氯霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤 液、化学发光液；其特征在于：

所述酶标板的各孔包被有以氯霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；其中所述包被抗原 浓度优选10μg/mL。

所述酶标板优选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

所述氯霉素系列标准溶液从氯霉素纯品中稀释得到，稀释液为含有10％甲醇的0.05m mol/L，pH＝7.4的PBS，氯霉素标准品浓度分别是0pg/mL，20pg/mL，60pg/mL，180pg/mL， 540pg/mL和1620pg/mL，所述百分比为体积百分比。

所述酶标氯霉素单克隆抗体是由氯霉素与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制 得的单克隆抗体，其工作浓度优选为1∶16000。

所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲 基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化 氢脲0.64mL的溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g的水溶液。

所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液(CB)，pH＝9.5。

所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也称鸡卵清白蛋白 或鸡卵白蛋白，由385个氨基酸残基组成，分子量约45kDa)且加入质量为5‰NaN₃的溶液， 所述百分比为质量百分比。

本发明溶液的配制：

本发明试剂盒中涉及的氯霉素标准溶液、酶标氯霉素单克隆抗体溶液、化学发光溶液及 洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制 方法是：

1、氯霉素标准溶液：以常规方法将氯霉素纯品用含有10％甲醇的0.05m mol/L，pH＝7.4 的PBS配制成浓度分别为0pg/mL，20pg/mL，60pg/mL，180pg/mL，540pg/mL和1620pg/mL 的氯霉素标准溶液，所述百分比为体积百分比。

2、酶标氯霉素单克隆抗体溶液：氯霉素单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单 克隆抗体，将所得氯霉素单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记标记后用洗涤溶液稀释成1∶16000 的工作浓度。

3、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟 甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧 化氢脲0.64mL的溶液。

4、浓缩磷酸盐缓冲液：NaH₂PO₄·2H₂O 6.52g、Na₂HPO₄·12H₂O 38.7g溶于1L去离子水中。

5、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05％将吐温-20的添加至pH＝7.5，0.1mol/L磷酸盐缓冲 液中。

6、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。

7、封闭溶液配制：10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN₃。

本发明酶标板的包被：

本发明中包被酶标板采用将CAP-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，以设定的浓度， 在37℃恒温箱中反应包被。

本发明采用的是pH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的 CAP-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包 被抗原浓度为10μg/mL。

包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN₃防止 变质。

酶标氯霉素单克隆抗体溶液的制备：

本发明中酶标氯霉素单克隆抗体溶液是决定本发明中氯霉素酶联免疫测试试剂盒测定范 围及灵敏度的重要因素。

本发明中涉及的酶标氯霉素单克隆抗体溶液可以用洗涤溶液稀释成1∶16000的工作浓 度。

按照上述酶标氯霉素单克隆抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准 线范围可以达到0pg/mL～1620pg/mL)和很好的灵敏度(20pg/mL)。

化学发光溶液的配制：

本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。

所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲 基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化 氢脲0.64mL的溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶 催化底物的化学发光反应检测产物浓度。

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统 的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在动物性食品(如动物组织、水产 品、蜂蜜、牛奶)中的氯霉素残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为氯霉素半抗原合成反应式。

图2为本发明化学发光反应式。

图3为本发明氯霉素抗体的工作曲线。

具体实施方式

实施例1：免疫原、包被原及酶标单克隆抗体的制备

(1)氯霉素半抗原制备

A，将氯霉素溶于甲醇中，加入5％的Pd/C，通入氢气，保持一定压力，室温反应2h， 过滤除去Pd/C，蒸干溶剂得到淡黄色黏稠液体，既得氯霉素半抗原。Pd/C与氯霉素的摩尔比 为1∶10。将上述得到的目标物在0～5℃下，用盐酸调pH值为1～2，搅拌下滴加0.1～1mol/L 的NaNO₂溶液，使淀粉碘化钾试纸变蓝，再滴加0.1～1mol/L尿素溶液，使淀粉碘化钾试纸变 浅蓝，再加0.1～1mol/L的NaOH溶液调pH值为7～9，得到清液作为溶液A备用。

B，量取溶液A21.8mL加入DMF 3mL中，4℃预冷10min，加入三丁胺，混匀；并加入 氯甲酸异丁酯，4℃搅拌20min。称取71.5mg BSA溶于50％的DMF 10mL中，4℃预冷。用 1M NaOH调BSA的pH至8。将配制好的溶液A液迅速加人BSA中，4℃搅拌反应4h。

(2)免疫原合成

A，取氯霉素半抗原30mg用1.5ml水溶解；取50％的GA10μl加入1中，室温下搅拌反 应18h；

B，取BSA100mg用1.5ml水稀释后加入1中；反应过夜后加入24mgNaBH₄反应3h；用 三蒸水透析48小时，即得免疫原。

按上述步骤反应，取氯霉素半抗原30mg，OVA100mg，合成CAP-OVA，供包被用。

(3)酶标氯霉素单克隆抗体的制备

A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(CAP-BSA)按150μg/只，以生理盐水溶解免疫复 合物与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第 7、14、28天以免疫复合物与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以 免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤 细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基 悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5 天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法 筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包 被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠 IgG-HRP和IgM-HRP，邻苯二胺进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法 筛选，先将细胞上清与100pg/mL的氯霉素等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被 好的酶标板中。同时用PBS取代氯霉素作对照，其余步骤同上。若经氯霉素阻断后的OD450nm 值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法 进行亚克隆化。

D，单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间 接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日 后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻 存备用。

E，酶标单克隆抗体制备：称取5mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL去离子水中，加入新鲜 配制的0.06M NaIO₄水溶液0.5mL，混匀置冰箱30min，取出加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL， 于室温放置30min后加入含5mg纯化单克隆抗体的水溶液1mL，混匀并装透析袋对0.05M、 pH＝9.5碳酸缓冲液缓慢搅拌透析6h使之结合，然后吸出加NaBH₄溶液0.2mL，置冰箱2h。

将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸按，冰箱放30分钟后离心，将所得沉淀物溶于 少许0.02M、pH＝7.4PBS中，并对之透析过夜，次日再离心除去不溶物，即得酶-抗体结合物， 用0.02M、pH＝7.4PBS加至5mL进行测定后冷冻干燥保存。

实施例2：ELISA检测方法的建立

(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

纵向用每种包被抗原按160.0μg/mL，80.0μg/mL，40.0μg/mL，20.0μg/mL，10.0μg/mL， 5.0μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL的系列稀释度包被酶标板，100μL/孔，置于37℃恒温箱 2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入 50μL/孔一系列稀释的酶标氯霉素单克隆抗体(1∶1000至1∶512000)，室温(20～25℃)孵育 15min，洗板五次，最后一次拍干；加入100μL/孔的化学发光液，测定发光值。以发光值随 包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

(2)抗体灵敏度的测定

根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1∶16000， 包被抗原浓度为10μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：

A，包被：用0.05M pH＝9.6的碳酸盐包被溶液将包被抗原配成10μg/mL的溶液，每个 聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。

B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一 次，拍干。

C，加样：加不同浓度的氯霉素溶液50μL/孔和稀释的酶标氯霉素单克隆抗体((1∶16000) 50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温(20～25℃)避光孵育15min，然后洗板五次，最后 一次拍干。

D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发 光免疫分析仪检测。

E，检测结果以抑制率计算：

相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU₀是空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。

计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。

实施例3：检测氯霉素的化学发光酶联免疫试剂盒

(1)检测氯霉素的化学发光酶联免疫试剂盒的组成

A，包被有包被原(CAP-OVA)的固相载体(酶标板)；

B，氯霉素标准溶液：0pg/mL，20pg/mL，60pg/mL，180pg/mL，540pg/mL和1620pg/mL。

C，酶标氯霉素抗体溶液：用人工免疫抗原(CAP-BSA)免疫动物制备所得的单克隆抗 体，将所得氯霉素抗体用辣根过氧化物酶标记后用洗涤溶液稀释成1∶16000工作浓度。

D，发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲 基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化 氢脲0.64mL的溶液。使用前A液与B液按1∶1混匀。

E，浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g的水溶液。

F，浓缩洗涤溶液：含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

(2)酶标板的制备

用包被液将包被抗原稀释成10μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被 液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一 次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例4：检测氯霉素的化学发光酶联免疫试剂盒的应用

(1)试剂的配制

A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1∶19倍稀释后使用。

B，磷酸盐缓冲液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1∶1倍稀释后使 用。

C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1∶1混匀。

(2)样品前处理

A，动物组织(猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼、虾等)：

——用均质器均质组织样本；

——称取3.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用振荡器 振荡10min，3000g以上，室温(20～25℃)离心10min；

——移取4mL上层有机相(约相当于2g的样本)至10mL干净玻璃试管中，于50～60 ℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动1min 转入2mL离心管中，3000g以上，室温(20～25℃)离心15min；

——除去上层有机相，取下层50μL用于分析。

B，牛奶：

——取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；

——取5mL去除脂肪牛奶样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入250μL0.36M二水合亚 硝基铁氰化钠溶液和250μL1M七水合硫酸锌溶液充分混合，3000g以上，4～12℃离心10min；

——移取2.2mL上层液至另一个10mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL乙酸乙酯上下振荡 10min；

——3000g以上，室温(20～25℃)离心10min；

——移取2mL乙酸乙酯上层有机相，至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流 下吹干；

——加入0.5mL磷酸盐缓冲液，涡动2min溶解干燥的残留物；

——除去上层有机相，取50μL用于分析。

(3)检测步骤

A，加样：向酶标板微孔中加入氯霉素系列标准浓度溶液或样品溶液50μL，然后加入酶 标氯霉素抗体溶液50μL，室温(20～25℃)恒温孵育15min；

B，洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250μL，洗涤5次，拍干；

C，加发光溶液：每孔加入发光溶液100μL，反应3min；

D，检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

(4)结果判断

所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准((0标准)的发光值再乘以100，以 抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲 线上读出。

相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU₀是空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。

实施例5：试剂盒特异性试验

用于抗体交叉反应性研究的药物均为与氯霉素结构或者功能相似的药物：氯霉素-葡萄糖 苷酸、棕榈氯霉素、甲砜氯霉素、氟甲砜霉素、己酰氯霉素。按试剂盒程序操作，但加入的 竞争物分别为不同的氯霉素类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓 度(IC50)。交叉反应率(％CR)即为抗体对氯霉素的IC₅₀与抗体对竞争物的IC₅₀之比的百分数， 按下式进行计算：

结果列于表1：

表1氯霉素试剂盒特异性试验

  竞争物   IC₅₀(pg/mL)   交叉反应率(％)   氯霉素   59.911   100   氯霉素-葡萄糖苷酸   66567.778   ＜0.1   棕榈氯霉素   85587.143   ＜0.1   甲砜氯霉素   119822.000   ＜0.1   氟甲砜霉素   74888.750   ＜0.1   己酰氯霉素   299555.000   ＜0.1

实施例6：试剂盒精密度和准确度试验

分别以不同浓度的氯霉素添加猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝、鱼肉、虾肉和牛奶样本进行添 加回收试验，计算不同药物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添 加两个浓度，每个浓度添加6个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。

根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。

表2氯霉素药物试剂盒准确度试验

从上述测定结果看，猪肉样本的回收率在84.1～96.8％之间、鸡肉样本的回收率在 88.6～95.2％之间、猪肝样本的回收率在86.6～106.8％之间、鸡肝样本的回收率在80.2～99.1％ 之间、鱼肉样本的回收率在83.9～102.8％之间、虾肉样本的回收率在87.0～94.5％之间、牛奶 样本的回收率在77.4～99.2％之间。总体回收率在75～110％之间，表明本试剂盒有很好的准确 度。