含有芳基位阻基团的二价铂配合物、制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一类以含有芳基位阻基团的手性反式1,2-环己二胺衍生物为配体的抗肿瘤铂(II)配合物，其结构式如式I或式II所示：

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤的铂配合物，具体涉及以含有芳基位阻基团的手性反式1,2-环己二胺衍生物为配体的抗肿瘤铂(II)配合物，还涉及该铂配合物的制备方法及应用。

背景技术

包括顺铂、卡铂和奥沙利铂在内的多个抗肿瘤铂类药物已被广泛应用于临床，用于治疗相关的癌症。但这类铂药物有一些缺陷：一是表现出相应的毒性，主要是肾脏毒性和骨髓毒性；二是用药后产生的耐药性。这些不足在一定程度上限制了这些铂类药物的应用。

最近十几年，基于对铂配合物耐药机理的深入了解，有关铂药物的研究已不再局限于顺铂的经典构效关系，人们开始探索新的途径研发新型铂类药物。迄今已设计出多种不同于原有构效关系的非经典铂类药物，其中之一就是具有空间位阻的铂配合物。反式1,2-环己二胺，特别是其手性异构体(1R,2R)-1,2-环己二胺，作为载体配基，经常被用于制备抗肿瘤铂类配合物。研究人员希望在反式1,2-环己二胺的基本结构上进行修饰，设计和制备含有空间位阻的二价铂配合物，利用空间位阻的作用，使其与DNA的作用不同于传统的顺铂类药物，从而获得低毒，与顺铂类药物无交叉耐药或具有选择性治疗作用的候选药物。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供含有芳基位阻基团的手性反式1,2-环己二胺衍生物为配体的抗肿瘤二价铂配合物，本发明还提供了该铂配合物的制备方法，以及该铂配合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

技术方案：本发明所述的含有芳基位阻基团的二价铂配合物，其结构式如式I或式II所示：

式I中X为H、OCH₃或F，处于苯环中N-亚甲基的邻位、间位或对位，Y为氯离子或碘离子；式II中，X为H、OCH₃或F，处于苯环中N-亚甲基的邻位、间位或对位，Z为草酸根、丙二酸根、1,1-环丁二酸根或3-羟基-1,1-环丁二酸根；反式1,2-环己二胺基团中两个手性碳原子为同一立体构型，均为R或S构型。

制备式I所述的铂配合物，采用如下的制备方法：将等摩尔的的反式-1,2-环己二胺衍生物配体与四卤合铂(II)酸钾混合于蒸馏水中，在20-60℃度下避光搅拌12-48小时，有大量黄色沉淀生成，将沉淀过滤，分别用蒸馏水、无水乙醇、乙醚反复洗涤，干燥后所得固体即为式I所示的铂配合物。

所述的反式-1,2-环己二胺衍生物配体由式III所示的以单Boc保护的反式1,2-环己二胺为起始物通过路线I合成制得；

其中Boc代表叔丁氧羰基，两个手性碳原子均为R构型或S构型，式III所示的化合物为具有1R,2R-构型或1S,2S-构型的手性异构体；路线I如下所示：

具体合成步骤为：

（1）室温下在装有160mL甲苯的500mL圆底烧瓶中，加入10.7g（50mmol）单Boc保护的反式1,2-环己二胺和60mmol芳醛，加热回流5h，减压除溶剂，残余物用二氯甲烷和石油醚（60℃-90℃）在4℃重结晶，析出白色针状席夫碱，过滤，石油醚洗涤固体，干燥；

（2）在装有250mL甲醇的500mL圆底烧瓶中加入步骤（1）所得的席夫碱，缓慢分批加入4.75g(125mmol)硼氢化钠，控制温度不超过25℃；加毕后，室温搅拌4h，蒸干溶剂，加入150mL水和150mL乙酸乙酯，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，每次100mL，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂；

（3）步骤（2）的残留物用100mL乙醚溶解，加入4M氯化氢的乙酸乙酯溶液150mL，室温搅拌6h，逐渐有白色沉淀，将沉淀过滤，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得白色固体，该白色固体为盐酸盐形式的反式1,2-环己二胺衍生物配体；

（4）将盐酸盐形式的反式1,2-环己二胺衍生物配体与碱性物质在水中作用，即可得到所述的反式-1,2-环己二胺衍生物配体。

所述的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。

芳醛中的芳香基为苯基或取代的苯基；当芳香基为取代的苯基时，取代基为氟原子或甲氧基，取代基可以在芳环的任意位置。

制备式II所述的铂配合物，有两种制备方法。

方法一：

在避光条件下，将上述制得的式I所示的铂配合物悬浮于蒸馏水中，加入相当于反式-1,2-环己二胺衍生物配体两倍摩尔量的银离子，在室温下搅拌过夜，过滤除去生成的卤化银，然后加入草酸、丙二酸、1,1-环丁二酸或3-羟基-1,1-环丁二酸的碱金属盐，在20-60℃度下搅拌反应12-48小时，浓缩反应液后得到式II所示的铂配合物。

方法二：

在避光条件下，将上述制得的式I所示的铂配合物悬浮于蒸馏水中，加入相当于反式-1,2-环己二胺衍生物配体摩尔量的草酸银、丙二酸银、1,1-环丁二酸银或3-羟基-1,1-环丁二酸银，在20-60℃度下搅拌反应12-48小时，过滤除去生成的卤化银，浓缩滤液后得到式II所示的铂配合物。

对于上述手性二胺配体形成的铂(II)配合物而言，仲胺上的N原子由于与Pt(II)离子配位成为手性中心，使的所得到的金属配合物有可能成为该手性N原子的单一对映体或外消旋体。

按本发明方法制备的铂配合物已经红外光谱、核磁氢谱和质谱确定了化合物的分子结构。配合物质谱中，准分子离子峰均出现铂元素的多个同位素峰。

式I和式II所示铂配合物对一些人肿瘤细胞具有显著的抑制作用，有的具有较高的选择性，可应用于制备抗癌药物，癌包括肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和乳腺癌。

有益效果：

将配合物用人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HepG-2和人胃癌细胞SGC-7901测试，顺铂和奥沙利铂及卡铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况。配合物1-4的实验数据见表1，配合物1-4具有良好的抗肿瘤活性，除对HepG-2肿瘤细胞外，对人肺癌细胞A549，人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞SGC-7901都有显著的抑制作用，有的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂。配合物8-23的实验数据见表2，配合物20对HCT-116、HepG-2、SGC7901呈现了较好的体外活性，配合物10-16、21-23对人胃癌细胞SGC-7901的选择性抑制较强，细胞毒活性与卡铂相当。配合物5-7和25-35的实验数据见表3。含有氯离子配位的配合物5-7针对4种肿瘤细胞都表现出很好的抑制活性，特别是人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7，这些化合物的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂。与含氯离子配位的配合物5-7相比，对应的含双羧酸根配位的配合物25-35都表现出一定的生物活性，有的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂，如配合物26对人肝癌细胞HEPG-2显示了很强的抑制能力。

以上结果表明，本发明的配合物具有良好的抗肿瘤活性，配合物1-4对人肺癌细胞A549，人结肠癌细胞HCT-116，人胃癌细胞SGC-7901都有显著的抑制作用，配合物5-7针对4种肿瘤细胞都表现出很好的抑制活性；本发明的部分配合物对部分肿瘤细胞具有显著的抑制作用，具有较高的选择性，可应用于制备抗癌药物，如配合物10-16、21-23，显示了对人胃癌细胞SGC-7901的选择性抑制，配合物26对人肝癌细胞HEPG-2显示了很强的抑制能力；本发明的配合物细胞毒活性较低，大多配合物细胞毒活性优于顺铂和奥沙利铂，部分配合物细胞毒活性与卡铂相当。

具体实施方式

本发明由下述实施例进一步的说明，但这些说明并不限制本发明。除特别指出外，二卤二胺合铂(II)均采用公知的方法制备，已在说明书中说明。核磁氢谱数据中，DACH代表反式1,2-环己二胺的骨架。

（一）化合物的制备

实施例1.配合物1的制备(分子式：C₁₃H₂₀Cl₂N₂Pt)

将四氯合铂酸钾(5.00mmol)和配体(N-苄基-1R,2R-环己二胺,5.00mmol)混合于80mL水中，于30℃避光搅拌24小时，有大量黄色沉淀生成，过滤，用水反复洗涤，用少量乙醇洗涤，干燥得黄色粉末，产率：86%。IR(KBr,cm^-1):3466(br),3120,2935,2860,1580,1452,751,702；¹H-NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.09-2.01(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.12-2.25(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.91-4.54(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.11-6.16(dd,2H,CHNH₂),δ7.29-7.31(m,1H,CH₂NH),δ7.38-8.11(m,5H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=435(100%)。

注1：用四碘合铂酸钾代替四氯合铂酸钾可得到对应于配合物1的二碘配合物，实施例2-7所述的配合物2-7的二碘配合物也可由同样的方法制备。

注2：用N-苄基-1S,2S-环己二胺代替N-苄基-1R,2R-环己二胺可得到配合物1的光学对映体，对应于实施例2-7所述的配合物2-7采用N-苄基-1S,2S-环己二胺代替N-苄基-1R,2R-环己二胺也可得到配合物2-7的光学对映体。

实施例2.配合物2的制备(分子式：C₁₃H₁₉Cl₂FN₂Pt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(2-氟苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为50℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：97%。IR(KBr,cm^-1):3138(br),2933,2862,1579,1494,1451,1229,1187,1139,763；¹H-NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ0.80-1.85(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.11-2.23(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.89-4.40(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.96-5.47(dd,2H,CHNH₂),δ6.75-7.45(m,4H,Ar-H),δ8.89-8.93(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=453(100%)。

实施例3.配合物3的制备(分子式：C₁₃H₁₉Cl₂FN₂Pt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(3-氟苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为60℃，避光搅拌12小时得浅黄色粉末，产率：85%。IR(KBr,cm^-1):3267(br),3188,3100,2938,1587,1451,1258,1147,791,753；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ0.76-1.98(m,8H,CH₂ of DACH),δ1.98-2.23(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.67-4.58(m,2H,NHCH2Ph),δ5.01-5.48(dd,2H,CHNH₂),δ6.72-7.86(m,4H,Ar-H),δ8.25-8.27(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=453(100%)。

实施例4.配合物4的制备(分子式：C₁₃H₁₉Cl₂FN₂Pt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(4-氟苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为20℃，避光搅拌48小时得浅黄色粉末，产率：79%。IR(KBr,cm^-1):3142(br),3142,2939,2866,1598,1509,1452,1220,1152,976,827,773；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ0.76-2.20(m,8H,CH₂of DACH),δ2.12-2.25(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.67-4.58(m,2H,NHCH₂Ph),δ5.02-5.48(dd,2H,CHNH₂),δ6.70-7.86(m,4H,Ar-H),δ8.25-8.28(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=453(100%)。

实施例5.配合物5的制备(C₁₄H₂₂Cl₂N₂OPt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(2-甲氧基苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为40℃，避光搅拌18小时得浅黄色粉末，产率：88%。IR(KBr,cm^-1):3523(br),3251,3191,3122,2934,2858,1592,1496,1454,1248,1030,759；¹H-NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ0.90-2.04(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.15-2.43(m,2H,CHNH₂and CHNH),δ3.82(s,3H,CH₃OPh),δ3.78-4.02(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.98-8.21(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=464(100%)。

实施例6.配合物6的制备C₁₄H₂₂Cl₂N₂OPt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(3-甲氧基苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：82%。IR(KBr,cm^-1):3490(br),3247,3186,3119,2937,2860,1595,1454,1264,1162,1039,790,747；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ0.86-1.93(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.19-2.35(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.83(s,3H,CH₃OPh),δ3.62-3.91(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.92-8.01(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=464(100%)。

实施例7.配合物7的制备(C₁₄H₂₂Cl₂N₂OPt)

参照实施例1所述方法制备，配体为N-(4-甲氧基苄基)-1R,2R-环己二胺，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：80%。IR(KBr,cm^-1):3502(br),3133,2930,2855,1608,1512,1453,1251,1180,1032,844,814；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ0.77-1.93(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.11-2.29(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.78(s,3H,CH₃OPh),δ3.75-3.84(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.95-8.01(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-Cl]⁺=464(100%)。

实施例8.配合物8的制备(分子式：C₁₅H₂₀N₂O₄Pt)

将配合物1(1.00mmol)悬浮于100mL水中，加入硝酸银(0.34g，2.00mmol)，于38℃下避光反应24小时后过滤。滤液中加入草酸钠(1.00mmol)的15mL水溶液，然后于35℃下避光反应，反应过程中析出大量固体，12小时后固体不再明显增加，将溶液经硅藻土辅助过滤，用水反复洗涤，真空干燥，得浅黄色粉末，产率：65%。IR(KBr,cm^-1):3433(br),3237,3048,2933,2859,1621,1447,1291,780,745；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.04-1.93(m,8H,CH₂ ofDACH),δ1.93-2.15(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ2.89(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.01-4.13(dd,2H,CHNH₂),δ5.72(m,1H,CH₂NH),δ6.93-7.51(m,5H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=486(100%)。

注：采用配合物1的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物8的光学对映体。同理实施例9-11。

实施例9.配合物9的制备(分子式：C₁₆H₂₂N₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物1为原料，二羧酸盐为丙二酸钾，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：67%。IR(KBr,cm^-1):3417(br),3241,3140,3048,2931,2858,1581,1445,1347,745；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.13-1.94(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.16-2.60(m,2H,CHNH and CHNH₂),δ2.74(s,2H,(COO)₂CH₂),δ3.98-4.17(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.83(m,1H,CH₂NH),δ5.43(dd,2H,CHNH₂),δ6.93-7.60(m,5H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=502(100%)。

实施例10.配合物10的制备(C₁₉H₂₆N₂O₄Pt)

将配合物1(1.00mmol)悬浮于100mL水中，加入1,1-环丁二酸银(3.56g，1.00mmol)，于40℃下避光反应24小时，然后过滤除去产生的氯化银。滤液经旋转蒸发析出大量固体，用冷水反复洗涤，真空干燥，得浅黄色粉末，产率：59%。IR(KBr,cm^-1):3419(br),3232,2935,2860,1648,1579,1361,1448,1379,1237,1119,747；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.07-2.29(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.32-2.78(m,2H,NHCH andNH₂CH),δ4.01-4.17(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.75-7.07(m,5H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=542(100%)。

实施例11.配合物11的制备(C₁₉H₂₆N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物1为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为60℃搅拌反应12小时得浅黄色粉末，产率：50%。IR(KBr,cm^-1):3418(br),3200,3100,2934,2860,1582,1446,1382,1036,747,662；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.14-2.24(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.43-2.63(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.99-4.22(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.65-4.85(m,1H,CHOH),δ6.80-7.49(m,5H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=556(100%)。

实施例12.配合物12的制备(C₁₅H₁₉FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物2为原料，二羧酸盐为草酸钠，反应温度为40℃搅拌反应24小时，得浅黄色粉末，产率：48%。IR(KBr,cm^-1):3439(br),3439,3239,2935,2861,1601,1451,1384,1292,1230,1124,1062,1037,875,778,714；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.04-2.37(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.65-2.89(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.97-4.32(m,2H,NHCH₂Ph),δ5.24-5.78(dd,2H,CHNH₂),δ6.82-7.33(m,4H,Ar-H),δ7.83(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=504(100%)。

注：采用配合物2的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物12的光学对映体。同理实施例13-15。

实施例13.配合物13的制备(C₁₄H₂₁FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物2为原料，二羧酸盐为丙二酸钾，反应温度为45℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：46%。IR(KBr,cm^-1):3237(br),2934,2860,1596,1450,1348,1231,1161,1124,1037,875,778,716；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.15-2.11(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.22-2.64(m,2H,CHNH and CHNH₂),δ2.75(s,2H,(COO)₂CH₂),δ3.86-4.33(m2H,NHCH₂Ph),δ4.92-5.03(dd,2H,CHNH₂),δ5.49(m,1H,CH₂NH),δ6.84-7.32(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=520(100%)。

实施例14.配合物14的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₄Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物2为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，反应温度为60℃搅拌12小时，得浅黄色粉末，产率：63%。IR(KBr,cm^-1):3436(br),3237,3140,2938,2862,1595,1563,1451,1381,1228,778；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.16-2.34(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.65-2.86(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.97-4.36(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.97(dd,2H,CHNH₂),δ5.53(m,1H,CH₂NH),δ6.85-7.42(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=560(100%)。

实施例15.配合物15的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物2为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为50℃，避光搅拌12小时得浅黄色粉末，产率：23%。IR(KBr,cm^-1):3241(br),2936,2861,1713,1599,1452,1383,1231,1126,1038,874,779；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.15-2.28(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.42-2.66(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ4.30-4.37(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.65(m,1H,CHOH),δ6.84-7.40(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=574(100%)。

实施例16.配合物16的制备(C₁₅H₁₉FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物3为原料，二羧酸盐为草酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：24%。IR(KBr,cm^-1):3445(br),3234,2133,2935,2861,1616,1450,1384,1295,1229,778；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.14-2.22(m,8H,CH₂ ofDACH),δ2.65-2.92(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ4.09-4.28(m,2H,NHCH₂Ph),δ5.17-5.94(dd,2H,CHNH₂),δ6.77-7.49(m,4H,Ar-H),δ7.68(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=504(100%)。

注：采用配合物3的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物16的光学对映体。同理实施例17-19。

实施例17.配合物17的制备(C₁₆H₂₁FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物3为原料，二羧酸盐为丙二酸钾，反应温度为45℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：35%。IR(KBr,cm^-1):3445(br),3241,3133,2934,2861,1718,1593,1450,1384,1278,1230,1214,778；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.12-2.06(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.17-2.61(m,2H,CHNH and CHNH₂),δ2.74(s,2H,(COO)₂CH₂),δ4.00-4.25(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.92-5.66(dd,2H,CHNH₂),δ7.61(m,1H,CH₂NH),δ6.71-7.51(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=520(100%)。

实施例18.配合物18的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₄Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物3为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，反应温度为50℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：59%。IR(KBr,cm^-1):3444(br),3248,3133,2938,2863,1721,1592,1450,1384,1277,1230,1213,778；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.12-2.53(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.63-2.85(m,2H,NHCH andNH₂CH),δ4.03-4.27(m,2H,NHCH₂Ph),δ5.13(dd,2H,CHNH₂),δ5.74(m,1H,CH₂NH),δ6.74-7.51(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=560(100%)。

实施例19.配合物19的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物3为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：23%。IR(KBr,cm^-1):3308(br),2936,2861,1709,1590,1449,1382,1211,1146,1038,780,666；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.07-2.27(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.40-2.63(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ4.03-4.27(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.45(m,1H,CHOH),δ6.70-7.51(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=574(100%)。

实施例20.配合物20的制备(C₁₅H₁₉FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物4为原料，二羧酸盐为草酸钾，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：28%。IR(KBr,cm^-1):3435(br),3314,3243,2936,1622,1591,1449,1384,1293,770；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.08-2.18(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.65-2.83(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.97-4.19(m,2H,NHCH₂Ph),δ5.32-5.78(dd,2H,CHNH₂),δ6.81-7.29(m,4H,Ar-H),δ7.71-7.92(m,1H,CH₂NH)；ESI-MS:m/z[M-H]⁺=504(100%)。

注：采用配合物4的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物20的光学对映体。同理实施例21-23。

实施例21.配合物21的制备(C₁₆H₂₁FN₂O₄Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物4为原料，二羧酸盐为丙二酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：19%。IR(KBr,cm^-1):3434(br),3240,2935,2860,1590,1449,1384,1350,1243,1174；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.14-1.71(m,8H,CH₂ ofDACH),δ1.93-2.19(m,2H,CHNH and CHNH₂),δ2.74(s,2H,(COO)₂CH₂),δ3.98-4.19(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.88(s,2H,CHNH₂),δ5.46(s,1H,CH₂NH),δ6.81-7.30(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=502(100%)。

实施例22.配合物22的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₄Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物4为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，反应温度为50℃，避光搅拌12小时得浅黄色粉末，产率：28%。IR(KBr,cm^-1):3420(br),3240,2938,2862,1568,1459,1383,1243,1204；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.23-2.28(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.30-2.38(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.98-4.19(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.83-7.60(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺=560(100%)。

实施例23.配合物23的制备(C₁₉H₂₅FN₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物4为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：30%。IR(KBr,cm^-1):3401(br),2936,2861,1569,1453,1383,1242,1206,1037,881；¹H-NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.15-2.28(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ3.97-4.28(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.97-4.28(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.27-4.30(m,1H,CHOH),δ6.76-7.86(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=574(100%)。

实施例24.配合物24的制备(C₁₆H₂₂N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物5为原料，二羧酸盐为草酸钾，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：70%。IR(KBr,cm^-1):3350(br),3237,2933,2861,1620,1454,1249,1254,1041,776；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.03-2.14(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.67-2.84(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.57(s,3H,CH₃OPh),δ3.65-3.81(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.27-4.30(m,1H,CH₂NH),δ5.29-5.84(dd,2H,CHNH₂),δ6.64-8.31(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=516(100%)。

注：采用配合物5的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物24的光学对映体。同理实施例25-27。

实施例25.配合物25的制备(C₁₇H₂₄N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物5为原料，二羧酸盐为丙二酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：65%。IR(KBr,cm^-1):3424(br),3245,3140,2932,2859,1602,1454,1316,1250,1155,1042,774,721；¹H NMR(d₆-DMSO/TMS,ppm):δ1.04-2.20(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.60-2.79(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ2.67(s,2H,(COO)₂CH₂),δ3.69(s,3H,CH₃OPh),δ3.72-3.85(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.27-4.31(m,1H,CH₂NH),δ4.82-5.42(dd,2H,CHNH₂),δ6.68-7.51(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=530(100%)。

实施例26.配合物26的制备(C₂₀H₂₈N₂O₅Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物5为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，反应温度为50℃，避光搅拌12小时得浅黄色粉末，产率：70%。IR(KBr,cm^-1):3443(br),3240,3147,2937,2863,1710,1569,1456,1356,1253,1156,1042,773；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.05-2.28(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.63-2.81(m,2H,NHCH andNH₂CH),δ3.72(s,3H,CH₃OPh),δ3.67-3.81(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.62-7.55(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=570(100%)。

实施例27.配合物27的制备(C₂₀H₂₈N₂O₆Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物5为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为40℃，避光搅拌24小时得浅黄色粉末，产率：58%。IR(KBr,cm^-1):3302(br),3153,2936,2862,1710,1568,1455,1380,1253,1147,1040,776；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.05-2.38(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.59-2.61(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.72(s,3H,CH₃OPh),δ3.57-3.85(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.22-4.31(m,1H,CHOH),δ6.62-7.52(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=586(100%)。

实施例28.配合物28的制备(C₁₆H₂₂N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物6为原料，二羧酸盐为草酸钾，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：59%。IR(KBr,cm^-1):3241(br),2934,2861,1649,1446,1384,1260,1035,779；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.03-2.10(m,8H,CH₂of DACH),δ2.66-2.85(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.67(s,3H,CH₃OPh),δ3.42-3.75(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.42-7.40(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=516(100%)。

注：采用配合物6的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物28的光学对映体。同理实施例29-31。

实施例29.配合物29的制备(C₁₇H₂₄N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物6为原料，二羧酸盐为丙二酸钠，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：65%。IR(KBr,cm^-1):3448(br),3245,2934,2861,1715,1591,1448,1378,1239,1156,777；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.03-2.14(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.68(s,2H,(COO)₂CH₂),δ2.55-2.82(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.66(s,3H,CH₃OPh),δ4.01-4.15(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.47-7.40(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=530(100%)。

实施例30.配合物30的制备(C₂₀H₂₈N₂O₅Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物6为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，在20℃下搅拌反应12小时，得浅黄色粉末，产率：55%。IR(KBr,cm^-1):3445(br),3245,3141,2937,2862,1712,1588,1449,1377,1280,1236,1152,777；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.09-2.27(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.83(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.70(s,3H,CH₃OPh),δ4.02-4.11(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.45-7.39(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=570(100%)。

实施例31.配合物31的制备(C₂₀H₂₈N₂O₆Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物6为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：43%。IR(KBr,cm^-1):3442(br),3249,2936,2861,1589,1448,1379,1239,1148,1039,778,672；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.03-2.39(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.84(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.67(s,3H,CH₃OPh),δ4.04-4.31(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.24-4.31(m,1H,CHOH),δ6.47-7.39(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=586(100%)。

实施例32.配合物32的制备(C₁₆H₂₂N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物7为原料，二羧酸盐为草酸钾，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：56%。IR(KBr,cm^-1):3449(br),3244,3137,2934,2862,1626,1458,1286,1222,1042,872,782；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.04-2.09(m,8H,CH₂ of DACH),δ2.63-2.81(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.65(s,3H,CH₃OPh),δ3.61-3.76(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.41-7.53(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=516(100%)。

注：采用配合物7的光学对映体为原料，用同样的方法可制备配合物32的光学对映体。同理实施例33-35。

实施例33.配合物33的制备(C₁₇H₂₄N₂O₅Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物7为原料，二羧酸盐为草酸钾，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：50%。IR(KBr,cm^-1):3444(br),3239,3138,2934,2861,1723,1585,1459,1379,1226,1175,1041,807,722；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.05-2.17(m,8H,CH₂of DACH),δ2.69(s,2H,(COO)₂CH₂),δ2.50-2.90(m,2H,CHNH₂ and CHNH),δ3.65(s,3H,CH₃OPh),δ3.96-4.10(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.61-7.13(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=530(100%)。

实施例34.配合物34的制备(C₂₀H₂₈N₂O₅Pt)

参照实施例10所述方法制备，配合物7为原料，二羧酸银盐为1,1-环丁二酸银，反应温度为50℃搅拌反应24小时，得浅黄色粉末，产率：55%。IR(KBr,cm^-1):3432(br),3240,3144,2937,2861,1710,1581,1461,1381,1223,1042,805；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.05-2.26(m,14H,CH₂ of DACH and CH₂ of cyclobutyl),δ2.73(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.65(s,3H,CH₃OPh),δ3.92-4.11(m,2H,NHCH₂Ph),δ6.59-7.52(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=570(100%)。

实施例35.配合物35的制备(C₂₀H₂₈N₂O₆Pt)

参照实施例8所述方法制备，配合物7为原料，二羧酸盐为3-羟基-1,1-环丁二酸钠，反应温度为40℃，得浅黄色粉末，产率：78%。IR(KBr,cm^-1):3440(br),3244,3150,2936,2862,1711,1580,1460,1377,1255,1151,1040,872,802；¹H NMR(d₆-DMSO+D₂O/TMS,ppm):δ1.16-2.39(m,12H,CH₂ of DACH and cyclobutyl),δ2.754(m,2H,NHCH and NH₂CH),δ3.65(s,3H,CH₃OPh),δ3.97-4.10(m,2H,NHCH₂Ph),δ4.21-4.26(m,1H,CHOH),δ6.59-7.54(m,4H,Ar-H)；ESI-MS:m/z[M-H]^-=586(100%)。

(二)配合物的体外细胞毒活性测试

试验例1

本试验例采用CCK-8方法对本发明的一部分配合物以及市面常用抗癌铂药物进行了细胞毒活性测试。

CCK-8法：在试验中96孔培养板每孔5000个左右细胞，过夜培养，待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组，阳性对照组和阴性对照组。待测的配合物用DMSO或5%的葡萄糖水溶液配制成贮液，临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设3个复孔。加药后培养48小时，加10μl浓度为5mg/ml的CCK-8试剂，37℃孵育4小时，去上清。30min内，用酶标仪450波长测定OD值，并计算抑制率。

本试验例采用CCK-8法对几种肿瘤细胞（人肺癌细胞A549，人结肠癌细胞HCT-116，人肝癌细胞HepG-2，人胃癌细胞SGC-7901）测试了配合物1、2、3和4的细胞毒活性，以顺铂、奥沙利铂和卡铂作为阳性对照。由于配合物水溶性较差，故采用DMSO溶液测定。将配合物先溶解在少量DMSO中，再用5%的葡萄糖水溶液稀释至测定所需浓度，结果见表1。

表1 配合物1-4的IC₅₀值(μM)*

*.DMSO溶液;nd代表没有测定。

由表1中的数据可以看出，配合物1-4除对HepG-2肿瘤细胞外，对其它3个肿瘤细胞都有显著的抑制作用，有的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂，如配合物2对人结肠癌细胞HCT-116和人胃癌细胞SGC-7901显示了很强的抑制能力，配合物3对人肺癌细胞A549和人胃癌细胞SGC-7901也表现出强的生物活性。

试验例2

虽然配合物1-4具有良好的抗肿瘤活性，但它们的水溶性不佳，所以在试验例1的基础上，对相关配体和双羧酸根配位的铂配合物进行了活性测定。采用CCK-8法进行了体外活性研究，测试的肿瘤有：人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HepG-2和人胃癌细胞SGC-7901，顺铂和奥沙利铂及卡铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价化合物的细胞毒活性，结果见表2。

表2 配合物8-23的IC₅₀值(μM)*

*.DMSO溶液。

上表中，配合物20对3个肿瘤细胞呈现了较好的体外活性，而配合物8、9、17、18和19对4个肿瘤细胞则基本无活性。除此之外，其它配合物却显示了对人胃癌细胞SGC-7901的选择性抑制，它们的细胞毒活性与卡铂相当。

试验例3

本试验例采用MTT方法对本发明的一部分配合物以及市面常用抗癌铂药物进行了细胞毒活性测试。

MTT法：取对数生长期的细胞计数，接种于96孔培养板内，每孔约8000-10000个细胞。过夜培养，待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组，阳性对照组和阴性对照组。待测的配合物用DMSO或5%的葡萄糖水溶液配制成贮液，临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中DMSO的终浓度不超过4‰。每个浓度设3个复孔。加药后培养48小时，加20μl浓度为5mg/ml的MTT，37℃孵育4小时，去上清，加入150μl的DMSO溶解甲瓒。用酶标仪在490波长下测定每孔的OD值，并计算抑制率，做浓度-抑制率曲线计算IC₅₀值。

采用MTT法测试了配合物5-7和与之对应的双羧酸根配位的配合物25-35对人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116、人肝癌细胞HEPG-2和人乳腺癌细胞MCF-7的体外抗肿瘤活性，顺铂和奥沙利铂作为阳性对照。观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC₅₀值来评价药物的细胞毒活性，结果见表3。

表3 配合物5-7和25-35的IC₅₀值(μM)*

*.DMSO溶液。

由表3结果可知，含有氯离子配位的配合物5-7针对4种肿瘤细胞都表现出很好的抑制活性，特别是人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7，这些化合物的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂。与含氯离子配位的配合物5-7相比，对应的含双羧酸根配位的配合物25-35都表现出一定的生物活性，有的细胞毒活性甚至优于顺铂和奥沙利铂，如配合物26对人肝癌细胞HEPG-2显示了很强的抑制能力。