谷氏菌素生物合成相关蛋白系统及其编码基因簇与应用

摘要

本发明公开了一种谷氏菌素生物合成相关蛋白系统及其编码基因簇与应用。本发明提供的蛋白组，由蛋白1-蛋白25组成；本发明还提供了基因簇，其核苷酸序列可为序列表中序列1所示的DNA分子，本发明的实验证明，本发明提供了与谷氏菌素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，有助于阐明与理解谷氏菌素及相关核苷肽类抗生素家族生物合成的分子机理，从而为进一步利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质，从分子水平上阐明谷氏菌素的生物合成机理，进而可以实现谷氏菌素等核苷肽类抗生素的途径改造优化、产量提高和利用合成生物学手段获得生物活性更高的衍生物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种谷氏菌素生物合成相关蛋白系统及其编码基因 簇与应用。

背景技术

微生物可产生种类繁多的次级代谢产物，其中最重要的是抗生素。在目前所知的15000 多种微生物来源的天然抗生素中，约60％是由链霉菌产生的，这个数据无疑凸现了链霉菌在 抗生素产业中所处的主导地位。已知的抗生素从结构上可大致分为：大环内酯类、四环素类、 多肽类、糖肽类、β-内酰氨类、核苷类、氨基糖苷类等。核苷肽类抗生素是属于核苷类抗生 素的一个类群，包括一类结构多样、活性各异的抗生素，从结构上来看，它们具有一个共同 的特征，即都包括三个不同的结构元件：杂环碱基、氨基糖、稀有氨基酸或肽基部分；杂环 碱基与氨基糖以N-C糖苷键相连，肽基部分与氨基糖之间以肽键相连。这类抗生素包括：谷 氏菌素(gougerotin)，宁南霉素(ningnanmycin)，尼可霉素(nikkomycin)，多氧霉素 (polyoxin)，杀稻瘟菌素(blasticidin)，灭粉霉素(mildiomycin)，嘌呤霉素(puromycin) 等。

谷氏菌素(又称星霉素asteromycin、云谷霉素yungumycin)是一种胞嘧啶核苷肽类抗 生素，1962年由日本科学家从谷氏链霉菌中分离得到，1968年确定了其化学结构，由胞嘧啶、 氨基己糖和肌氨酰丝氨酸二肽三个部分组成。研究发现谷氏菌素具有抗革兰氏阳性和阴性细 菌的活性，还具有抗支原体和抗病毒作用。关于作用机制的研究表明，谷氏菌素是蛋白合成 的特异抑制子，对于非细胞系统的蛋白质合成有很强的抑制作用，其作用方式与嘌呤霉素类 似，特异性抑制氨基酸的参入，而对完整蛋白链从核糖体的释放没有影响，其作用靶位是核 糖体的肽基转移酶。我国科学家陆续从谷氏链霉菌、禾粟链霉菌和小白链霉菌中分离得到谷 氏菌素，研究发现谷氏菌素还具有与5-氟尿嘧啶相当的抗肿瘤活性，其水解产物云南霉素具 有较弱的抗细菌活性和更强的抗肿瘤活性，与5-氟尿嘧啶相比，其体内的抑瘤作用相近，细 胞毒性较弱，表明其作为新抗肿瘤抗生素，有可能应用于肿瘤治疗。谷氏菌素的对映异构体 宁南霉素，对水稻白叶枯病，白粉病，水稻稻瘟病等植物病原真菌和烟草花叶病毒的防治具 有良好效果，表明谷氏菌素具有作为农用抗生素开发应用的前景。此外谷氏菌素还具有驱虫 和杀螨等活性。

对于抗生素的途径改造优化、产量提高及组合生物合成等研究，都是以抗生素在微生物 体内本来的生物合成为前提的，所以研究抗生素的生物合成，阐明其生物合成途径是一切工 作的重要基础。但是目前关于谷氏菌素等类似化合物的研究一直集中在生物活性上，有关生 物合成及其途径的工作至今未见报道。

核苷肽类抗生素中，还有杀稻瘟菌素、嘌呤霉素和链丝菌素的生物合成基因簇已经报道。 其中杀稻瘟菌素与谷氏菌素具有类似的核苷部分，2003年，美国科学家报道了其生物合成基 因簇，其中结构基因、调控基因和抗性基因在基因组上连锁存在。对于负责核苷部分合成的 关键基因blsD，已经通过体外的生化研究证明了其功能，BlsD负责将胞嘧啶和UDP-葡萄糖 醛酸进行缩合。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与谷氏菌素合成相关蛋白组。

本发明提供的蛋白组，由蛋白1-蛋白25组成；

所述蛋白1为序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列2所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列2衍生的蛋白质；

所述蛋白2为序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列3所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列3衍生的蛋白质；

所述蛋白3为序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列4所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列4衍生的蛋白质；

所述蛋白4为序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列5所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列5衍生的蛋白质；

所述蛋白5为序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列6所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列6衍生的蛋白质；

所述蛋白6为序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列7所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列7衍生的蛋白质；

所述蛋白7为序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列8所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列8衍生的蛋白质；

所述蛋白8为序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列9所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相关 的由序列9衍生的蛋白质；

所述蛋白9为序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列10所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列10衍生的蛋白质；

所述蛋白10为序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列11所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列11衍生的蛋白质；

所述蛋白11为序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列12所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列12衍生的蛋白质；

所述蛋白12为序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列13所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列13衍生的蛋白质；

所述蛋白13为序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列14所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列14衍生的蛋白质；

所述蛋白14为序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列15所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列15衍生的蛋白质；

所述蛋白15为序列表中序列16所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列16所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列16衍生的蛋白质；

所述蛋白16为序列表中序列17所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列17所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列17衍生的蛋白质；

所述蛋白17为序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列18所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列18衍生的蛋白质；

所述蛋白18为序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列19所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列19衍生的蛋白质；

所述蛋白19为序列表中序列20所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列20所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列20衍生的蛋白质；

所述蛋白20为序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列21所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列21衍生的蛋白质；

所述蛋白21为序列表中序列22所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列22所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列22衍生的蛋白质；

所述蛋白22为序列表中序列23所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列23所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列23衍生的蛋白质；

所述蛋白23为序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列24所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列24衍生的蛋白质；

所述蛋白24为序列表中序列25所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列25所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列25衍生的蛋白质；

所述蛋白25为序列表中序列26所示的氨基酸序列组成的蛋白质或将序列表中序列26所 示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷氏菌素合成相 关的由序列26衍生的蛋白质。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白组的基因簇也是本发明保护的范围。

上述基因簇是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与谷氏菌素合成相关蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、 至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％ 同源性且编码与谷氏菌素合成相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS 和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述基因簇的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述基因簇插入pSET152载体中，得到表达上述蛋白组的重组载体。

上述重组菌为将上述的重组载体导入宿主菌中，得到的重组菌；所述宿主菌具体为天蓝 色链霉菌M1146。

扩增上述基因簇全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述的蛋白组、上述基因簇、上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在合成 谷氏菌素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种合成谷氏菌素的方法。

本发明提供的方法，为发酵上述的重组菌，收集发酵产物，即得到谷氏菌素。

本发明的实验证明，本发明提供了与谷氏菌素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，有 助于阐明与理解谷氏菌素及相关核苷肽类抗生素家族生物合成的分子机理，从而为进一步利 用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质，从分 子水平上阐明谷氏菌素的生物合成机理，进而可以实现谷氏菌素等核苷肽类抗生素的途径改 造优化、产量提高和利用合成生物学手段获得生物活性更高的衍生物，也可以用来查找和发 展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。

附图说明

图1为谷氏菌素和杀稻瘟菌素的化学结构

图2为推断的谷氏菌素的生物合成途径

图3为谷氏菌素的¹H-NMR

图4为谷氏菌素的¹³C-NMR

图5为gouH基因破坏后的突变株的发酵产物

图6为谷氏菌素在天蓝色链霉菌M1146中的异源表达

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、谷氏菌素生物合成基因簇的获得及鉴定

一、谷氏菌素生物合成基因簇的获得

谷氏菌素与杀稻瘟菌素，都属于胞嘧啶核苷肽类抗生素，具有非常类似的核苷部分(图 1)，所以推测谷氏菌素核苷部分采取与杀稻瘟菌素生物合成中相同的合成途径。

杀稻瘟菌素的生物合成基因簇已经报道，其核苷部分的合成涉及到如下步骤：在BlsD催 化下，由胞嘧啶和UDP-葡萄糖醛酸合成胞嘧啶基葡萄糖醛酸，氨基转移酶BlsH负责对葡萄 糖的4位进行氨基化。

在谷氏菌素的产生菌禾粟链霉菌的基因组上发现一个blsD的同源基因，其附近还存在一 个氨基转移酶与blsH同源。根据blsD同源基因的核苷酸序列设计一对PCR引物 (5‘-GTACCTGGCACTGGTGGAGCG-3和5‘-TGTCGGCAGATGAGGACTTGG-3)，对禾粟链霉菌的基因 组文库进行筛选，获得了fosmid质粒D6-4H，通过对D6-4H的端基测序并与基因组序列比对， 发现D6-4H涵盖染色体上28737bp的DNA区域(序列1)，共包含25个开放型阅读框，因此 推测序列1为谷氏菌素生物合成基因簇，该区域的25个开放型阅读框编码的蛋白为谷氏菌素 生物合成相关蛋白系统(序列2-26)。

25个开放型阅读框如下：

1)负责谷氏菌素生物合成的结构基因gouA，gouB，gouD，gouF，gouG，gouH，gouI， gouJ，gouK，gouL，gouN，即共11个基因：

gouA位于基因簇序列1的自5’末端第7301-8341碱基，长度1041碱基对，编码氧化还 原酶，346个氨基酸(序列9)；

gouB位于基因簇序列1的自5’末端第10169-8382碱基处，长度1788碱基对，编码天门 冬酰胺合成酶，595个氨基酸(序列10)；

gouD位于基因簇序列1的自5’末端第12616-11669碱基处，长度948碱基对，编码糖基 转移酶，315个氨基酸(序列12)；

gouF位于基因簇序列1的自5’末端第14543-13350碱基处，长度1194碱基对，编码胞 嘧啶基葡萄糖醛酸合成酶(cytosylglucuronic acid synthase)，397个氨基酸(序列14)；

gouG位于基因簇序列1的自5’末端第15706-14540碱基处，长度1167碱基对，编码磷 酸甘油醛变位酶，388个氨基酸(序列15)；

gouH位于基因簇序列1的自5’末端第16875-15715碱基处，长度1161碱基对，编码氨 基转移酶，386个氨基酸(序列16)；

gouI位于基因簇序列1的自5’末端第17807-16872碱基处，长度936碱基对，编码氨基 转移酶，311个氨基酸(序列17)；

gouJ位于基因簇序列1的自5’末端第18912-17794碱基处，长度1119碱基对，编码酰基 -辅酶A氮-酰基转移酶，372个氨基酸(序列18)；

gouK位于基因簇序列1的自5’末端第19583-18909碱基处，长度675碱基对，编码含辅 酶A结合结构域的蛋白，224个氨基酸(序列19)；

gouL位于基因簇序列1的自5’末端第20685-19876碱基处，长度810碱基对，编码3-羟 基异丁酸脱氢酶，269个氨基酸(序列20)；

gouN位于基因簇序列1的自5’末端第22950-23669碱基处，长度720碱基对，编码甲基 转移酶，239个氨基酸(序列22)；

2)负责谷氏菌素生物合成的调控基因，即gouR共1个基因：

gouR位于基因簇序列1的自5’末端第6536-7222碱基处，长度687碱基对，编码TetR 家族转录调控蛋白，228个氨基酸(序列8)；

3)负责转运的基因，即gouM共1个基因：

gouM位于基因簇序列1的自5’末端第22088-20760碱基处，长度1329碱基对，编码转 运蛋白，442个氨基酸(序列21)；

4)功能未知基因，即gouC，gouE，orf(-1)，orf(-2)，orf(-3)，orf(-4)，orf(-5)，orf(-6)，orf1， orf2，orf3，orf4共12个基因：

gouC位于基因簇序列1的自5’末端第11570-10269碱基处，长度1302碱基对，编码未 知功能蛋白，433个氨基酸(序列11)；

gouE位于基因簇序列1的自5’末端第13353-12613碱基处，长度741碱基对，编码未知 功能蛋白，246个氨基酸(序列13)；

orf(-1)位于基因簇核苷酸序列第5244-6455碱基处，长度1212碱基对，编码RNA聚合酶， 403个氨基酸(序列7)；

orf(-2)位于基因簇序列1的自5’末端第4876-5247碱基处，长度372碱基对，编码YCII 相关蛋白，123个氨基酸(序列6)；

orf(-3)位于基因簇序列1的自5’末端第4566-3064碱基处，长度1503碱基对，编码主要 易化家族蛋白，500个氨基酸(序列5)；

orf(-4)位于基因簇序列1的自5’末端第2072-2995碱基处，长度924碱基对，编码双磷脂 酰甘油合成酶，307个氨基酸(序列4)；

orf(-5)位于基因簇序列1的自5’末端第1678-1280碱基处，长度399碱基对，编码假想蛋 白，132个氨基酸(序列3)；

orf(-6)位于基因簇序列1的自5’末端第1054-701碱基处，长度354碱基对，编码假想蛋 白，117个氨基酸(序列2)；

orf1位于基因簇序列1的自5’末端第26284-24080碱基处，长度2205碱基对，编码过氢 化酶，734个氨基酸(序列23)；

orf2位于基因簇序列1的自5’末端第26710-26318碱基处，长度393碱基对，编码肌动 蛋白，130个氨基酸(序列24)；

orf3位于基因簇序列1的自5’末端第26840-27256碱基处，长度417碱基对，编码铁摄 取调节蛋白，138个氨基酸(序列25)；

orf4位于基因簇序列1的自5’末端第27429-28571碱基处，长度1143碱基对，编码截短 的膜内在蛋白，380个氨基酸(序列26)。

上述基因簇的发现过程具体如下：

1、禾粟链霉菌AS4.506基因组DNA的获得

提取谷氏菌素产生菌禾粟链霉菌AS4.506(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心)的基因组DNA，具体如下：

将谷氏菌素产生菌禾粟链霉菌AS4.506接种于MS(甘露醇2％，豆粉2％，琼脂1.8％)上产 孢，接种孢子至5ml YEME(酵母提取物0.3％，胰蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，蔗糖20％， 每100ml使用前加入以下灭过菌的溶液，2.5M MgCl₂ 200μl，50％葡萄糖2ml，10％甘氨酸5ml) 中28度培养2-3天，离心收集菌体，500μl溶菌酶缓冲液(蔗糖15％；Tris-HCl，pH8.0， 25mM；EDTA 25mM，pH＝8.0)洗涤，离心，去上清；重复上述步骤。将菌体用500μl溶菌酶 溶液(5mg/ml)悬浮，37℃水浴30-60min。至菌液呈均一状态后，加入250μl 3％SDS， 小心混匀呈澄清。加入150μl的中性酚/氯仿，小心混匀约10min，离心，取上清，加l/10 体积的3M NaAc(pH 4.8)，2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，吸出沉淀块；70％乙醇洗涤一遍， 待乙醇挥发之后用500μl TE(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH＝8.0)溶解沉淀，加RNase A 至终浓度50μg/ml，37℃作用30min。加150μl中性酚/氯仿，小心混匀，离心，取 上清；如中间层多可重复此步骤至无中间蛋白层，加150μl氯仿，混匀，离心，取上清； 加1/10体积的3M NaAc(pH 4.8)，加2倍体积的无水乙醇，混匀，吸出沉淀块；加适量70％ 乙醇，将沉淀移至另一管。将离心管室温开盖放置至可见的痕量乙醇挥发，但不要使DNA沉 淀完全干燥，否则极难溶解，也可将管放入约60℃的水浴中作用15min使乙醇挥发，加 入适量TE溶解沉淀(可放入37℃水浴中加快溶解)，得到基因组DNA。

2、谷氏菌素产生菌禾粟链霉菌AS4.506基因组文库的构建与谷氏菌素生物合成基因簇的 筛选：

使用EPICENTRE biotechnologies公司的Cat.No.CCFOS110 CopyControl^TM Fosmid  Library Production Kit with pCC1FOS^TM Vector构建禾粟链霉菌的基因组文库。将禾粟链 霉菌的基因组DNA机械剪切成约40kb大小，末端补平并磷酸化。用低熔点胶分离补平的DNA 并回收纯化30-40kb大小的DNA，将处理好的基因组DNA与试剂盒所带的pCC1FOS^TM Vector 连接，包装，转染E.coli EPI300-T1^R细胞(试剂盒所带的)，涂布于LB(氯霉素)平板，37 度培养过夜。

利用PCR(聚合酶链式反应)来筛选基因组文库，首先将每块平板上的菌落先转移至另外 一块新的LB平板，将两块平板在37度继续培养10小时。将原来的平板上的菌落合并，煮沸 裂解作为模板然后进行PCR反应，先将阳性信号定位于每块平板。再将有阳性信号平板上的 菌落(用新转移的平板)转移至96孔板上培养，将每排和每列上的克隆混合，煮沸裂解作为模 板进行PCR反应，将阳性信号定位于点，得到有阳性信号的克隆，即为含有谷氏菌素生物合 成基因簇的fosmid质粒。通过对fosmid的端基测序和生物信息学分析，认为D6-4H能够包 含谷氏菌素完整的生物合成基因簇。D6-4H为将序列1插入pCC1FOS^TM Vector中得到的重组 质粒。

3、推测的谷氏菌素生物合成途径

如图2所示，gouG编码磷酸甘油醛变位酶，将3-磷酸甘油醛转化为2-磷酸甘油醛，然 后可能在gouI和gouL的催化下生成丝氨酸，为谷氏菌素的合成提供底物。胞嘧啶和UDP-葡 萄糖醛酸在GouF催化下生成胞嘧啶基葡萄糖醛酸，氧化还原酶GouA对葡萄糖醛酸的4-羟基 进行氧化，再由氨基转移酶GouH将其氨基化。天门冬酰胺合成酶GouB将葡萄糖醛酸的6-羧 基转化为酰胺。糖基转移酶GouD，含辅酶A结合结构域的蛋白GouK和辅酶A氮-酰基转移酶 GouJ可能负责了糖基与丝氨酸和甘氨酸之间肽键的生成。最后甲基转移酶GouN对甘氨酸的 氨基进行甲基化，得到谷氏菌素。

二、禾粟链霉菌AS4.506发酵产物的鉴定

将禾粟链霉菌AS4.506接种于MS(甘露醇2％，豆粉2％，琼脂1.8％)上产孢，接种一环 孢子至10ml YEME(酵母提取物0.3％，胰蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，蔗糖20％，每100ml 使用前加入以下灭菌的溶液，2.5M MgCl₂ 200μl，50％葡萄糖2ml)中28度培养2天至对数生 长期后期。然后按照10％的比例接种于发酵培养基中(葡萄糖2％，可溶性淀粉1％，酵母粉0.5％， 蛋白胨0.5％，NaCl 0.3％，黄豆粉1％，50ml/500ml三角瓶)28度220rpm培养96hr，收集发 酵液。

首先6000rpm 5min离心发酵液，收集上清液；用草酸调产物的pH值至3.0，煮沸10min， 6000rpm 5min离心去除沉淀，收集上清液1；将上清液1过强酸性阳离子交换树脂Dowex 50WX 2(H+，100-200mesh，Sigma)，0.3M氨水洗脱(洗脱速度为1ml/min，收集磷钨酸阳性反应 馏分(磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被还原成蓝色，将磷钨酸用水溶解制成2％的水溶液， 1∶1混合出现蓝色沉淀)。旋转蒸发浓缩(≤40℃)至小体积，乙酸调pH值至4.5，加入8倍 体积的预冷的95％乙醇，4℃过夜。13000rpm离心20min，收集沉淀并将其晾干，乙醇洗涤， 用水重新溶解沉淀。2.2μm微孔滤膜过滤，收集滤液，通过HPLC进行进一步的纯化，HPLC 分离的条件：试剂A：H₂O(1‰三氯乙酸)；试剂B：甲醇。洗脱条件：流速1ml/min，92％水 (1‰三氯乙酸)和8％甲醇恒定梯度。仪器：Agilent 1100HPLC；半制备柱：Agilent公司 的ZORBAX SB-C18(9.2×250mm，5μm)，并使用Agilent公司的相应的预柱，紫外检测波长 为276nm。收集保留时间约为6.5min的峰对应的产物，浓缩即为纯化的产物。

将上述纯化的产物进行MS分析，[M+H]⁺＝444.2，核磁分析结果如图3和图4所示，可以 看出该纯化的产物即为谷氏菌素。可以说明在上述HPLC条件下，禾粟链霉菌AS4.506发酵产 物中保留时间约为6.5min的峰对应的产物为谷氏菌素。

三、gouH基因破坏突变体的获得及发酵产物的鉴定

为了验证所克隆到的生物合成基因簇(序列1)与谷氏菌素的生物合成相关，对其中的 一个编码氨基转移酶的基因gouH进行了体内的破坏实验。GouH推测负责对胞嘧啶基葡萄糖 醛酸的C-4位进行氨基化，是谷氏菌素生物合成中的关键基因。

1、gouH基因破坏突变体的构建

将载体pKC1139(Liao Guojian，Li Jine，Li Lei，Yang Haihua，Tian Yuqing，and Tan Huarong. 2009.Selectively improving nikkomycin Z production by blocking the imidazolone biosynthetic  pathway of nikkomycin X and uracil feeding in Streptomyces ansochromogenes.Microb Cell Fact. 8：61，doi：10.1186/1475-2859-8-61，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)以SacI酶切， 回收大小为5822bp的DNA片段，与相同酶切的包含红霉素与卡那霉素抗性基因的2685bp DNA 片段(序列27)连接，获得质粒pKC1139EK。将EcoRV酶切线性化的pKC1139EK质粒DNA片段电 击转化导入大肠杆菌BW25113/pKD20/D6-4H(将D6-4H转化BW25113/pKD20获得，BW25113/pKD20 记载在Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.2000.One-step inactivation of chromosomal genes in  Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640-6645中，公众可从 中国科学院微生物研究所获得。)中，利用pKC1139与D6-4H在多克隆位点两侧的lacZα同源序 列，同源重组后获得含有重组质粒pKC1139EK::D6-4H的大肠杆菌 BW25113/pKD20/pKC1139EK::D6-4H。

用SphI/HindIII双酶切pSET152(Li Jine，Li Lei，Tian Yuqing，Niu Guoqing，and Tan  Huarong*.(2011)Hybrid antibiotics with the nikkomycin nucleoside and polyoxin peptidyl  moieties.Metab Eng.13：336-344，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)，回收3162bpDNA 片段，Klenow大片段聚合酶平端化后自连，获得重组质粒pSET152SV。

以禾粟链霉菌AS4.506基因组DNA为模板，用gouHUpF(5’-AAT TCT AGA ACC GGC CGA CCG AAC CCC-3)/gouHUpR(5’-AAT AGA TCT CAT GAG GGT CGT CCA ATC TTG ACG AG-3)和gouHDnF (5’-AAT AGA TCT TAA CCA CCC CGA TGA ACC GCA TC-3)/gouHDnR(5’-AAT GAA TTC GCT CGG GAC ACC TCG ACG A-3)引物分别PCR扩增得到分别为约2kb的gouHUp和gouHDn片段。用 XbaI/BglII和BglII/EcoRI分别酶切gouHUp和gouHDn，得到酶切后gouHUp和酶切后gouHDn；将 酶切后gouHUp和酶切后gouHDn分别与经过XbaI/EcoRI酶切的pSET152SV得到的3128bpDNA片段 连接，得到pSET152SV::gouHDM。

将BglII酶切的含有安普霉素和硫链丝菌素抗性基因的2378bp的DNA片段(序列28)，连入 相同酶切的pSET152SV::gouHDM，获得重组质粒pSET152SV::gouHTA。

以pSET152SV::gouHTA为模板，用引物gouHUpF/gouHDnR通过PCR扩增得到6419bp的DNA 片段，通过电击转化将该片段导入大肠杆菌BW25113/pKD20/pKC1139EK::D6-4H中，利用gouH 上下游约2kb的同源序列，通过同源重组获得重组质粒pKC1139EK::D6-4H::gouHTA(见图5A)。

将重组质粒pKC1139EK::D64H::gouHTA转化E.coli ET12567/pUZ8002(Li Jine，Li Lei， Tian Yuqing，Niu Guoqing，and Tan Huarong＊.(2011)Hybrid antibiotics with the nikkomycin  nucleoside and polyoxin peptidyl moieties.Metab Eng.13：336-344，公众可从中国科学院微生物 研究所获得。)，菌液涂布在含有安普霉素、卡那霉素和氯霉素(终浓度分别为100μg/ml， 100μg/ml与25μg/ml)的LB固体培养基上。挑取单克隆于3ml含有抗生素的LB液体培养基中， 37℃，220rpm培养过夜，次日按1∶100比例转接至10ml含有抗生素的LB中，37℃，220rpm培 养至OD₆₀₀值在0.4-0.6之间。4000rpm，5min收集菌体，弃去上清，用等体积液体LB洗涤2次后， 用0.5ml LB悬浮菌体备用。以2×YT液体培养基收集禾粟链霉菌AS4.506孢子，并用孢子收集 器过滤除去菌丝体，剩余孢子悬浮于0.5ml 2×YT液体培养基中，50℃水浴10min，取出冷 却至室温。混合大肠杆菌细胞和链霉菌孢子，涂布于含有MgCl₂(终浓度10mM)的MS固体培养 基，28℃培养16h后，用含有萘啶酮酸以及硫链丝菌素的无菌水涂布MS固体培养基(萘啶酮 酸终浓度为25μg/ml，硫链丝菌素25μg/ml)，28℃继续培养5天。转化子转接至含有萘啶酮 酸(终浓度25μg/ml)的MS固体培养基，长出的转化子再转接至含有硫链丝菌素(终浓度 25μg/ml)的MS固体培养基。选择在含硫链丝菌素的MS固体培养基长出的若干个菌落抽提基 因组DNA，PCR证实已转入质粒pKC1139EK::D64H::gouHIA后，扩大培养，以10％甘油收集孢子。 将收集到的孢子悬液以无菌水稀释10⁴、10⁵、10⁶倍，各取150μl稀释后的孢子悬液均匀涂布 于含有硫链丝菌素(终浓度25μg/ml)的MS固体培养基，38℃培养3至5天。温敏促使游离的 质粒丢失。挑取单菌落分别接种于含有红霉素(终浓度20μg/ml)的MS固体培养基以及含有 硫链丝菌素(终浓度25μg/ml)的MS固体培养基，28℃培养5天。选取在含有红霉素固体培养 基上不生长而在含有硫链丝菌素的固体培养基上生长的单菌落。

提取单菌落的基因组DNA，以gouHinF/gouHinR和tsrF/tsrR两对引物(gouHinF： 5’-GCGCGGGGCGACACGTCGGA-3；gouHinR：5’-GCGCCGTGCCGAAGGAACAG-3。tsrF： 5’-AATT GCATGC GTGATTGCCGGTCAGGGCAG-3；tsrR：5’-AATT AAG CTT AGGTCCGGTGAGCCCACAAC-3)进行PCR验证，分别扩增得到1794bp和2528bp的DNA 片段，符合的即为gouH基因破坏突变体。

2、gouH基因破坏突变体发酵产物的鉴定

接种gouH基因破坏突变体至10ml YEME(酵母提取物0.3％，胰蛋白胨0.5％，麦芽提取 物0.3％，蔗糖20％，每100ml使用前加入以下灭过菌的溶液，2.5M MgCl₂ 200μl，50％葡萄糖 2ml)中28度培养2天至对数生长期后期。然后按照10％的比例接种于发酵培养基中(葡萄糖 2％，可溶性淀粉1％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.3％，黄豆粉1％，50ml/500ml三角 瓶)28度220rpm培养120hr，得到发酵产物，离心收集gouH基因破坏突变体上清液。以禾粟 链霉菌AS4.506为对照。

结果如图5B所示，可以看出，从上述二的实验看出禾粟链霉菌AS4.506发酵产物中保留 时间约为6.5min的峰对应的即为谷氏菌素，因此看出，在同样的发酵和HPLC检测条件下， gouH基因破坏突变体没有该峰，说明gouH基因破坏突变体不产生谷氏菌素。

进一步说明基因簇与谷氏菌素合成相关，如果破坏了基因簇中的gouH基因，则不能合成 谷氏菌素。

实施例2、谷氏菌素基因簇的应用

为了证明已经克隆到完整的谷氏菌素生物合成基因簇，在天蓝色链霉菌中进行了异源表 达实验，进行如下实验：

1、重组菌株S.coelicolor M1146-pGou的获得

1)重组质粒pGou的获得

制备序列表中的序列1，将序列表中的序列1通过同源重组插入pSET152中得到的载体 命名为重组质粒pGou。

具体如下：

(1)将fosmid质粒D6-4H通过电击转化导入菌株E.coli BW 25113/pKD20(Datsenko， K.A.& Wanner，B.L.2000.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，6640-6645.，公众可从中国科学院微生物研 究所获得。)中，得到重组菌E.coli BW 25113/pKD20/D6-4H。

(2)将载体pSET152以EcoRV酶切，形成的线性DNA片段电击转化进入上述重组菌E.coli  BW 25113/pKD20/D6-4H中，同源重组，通过安普霉素筛选，得到转化子。

提取转化子的质粒，用HindIII酶切，得到28466bp、4006bp、1081bp、969bp的片段， 用EcoRI酶切，得到18067bp、8059bp、5788bp、2608bp的片段，符合的为阳性质粒，将该 质粒命名为pGou，该质粒为将序列表中的序列1插入pSET152中得到的重组载体(图6A)。

2)重组菌株S.coelicolor M1146-pGou的获得

将上述1)得到的pGou转化E.coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞，通过大肠杆菌和链 霉菌间的接合转移，将pGou导入天蓝色链霉菌M1146(Streptomyces coelicolor，记载在Katrin  Flinspach，Lucia Westrich，Leonard Kaysser，Stefanie Siebenberg，Juan Pablo Gomez-Escribano， Mervyn Bibb，Bertolt Gust，Lutz Heide，2010，Heterologous expression of the biosynthetic gene  clusters of coumermycin A(1)，clorobiocin and caprazamycins in genetically modified Streptomyces  coelicolor strains.Biopolymers.93(9)：823-832，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)中。 利用安普霉素筛选转化子，转化子在MS培养基(甘露醇2％，豆粉2％，琼脂1.8％)上产孢，收 集孢子，得到重组菌。

将重组菌提取基因组DNA，以gouRupF/gouRupR和gouHupF/gouHupR两对引物(gouRupF： 5’-CCG GGA TCC GAC GAC TCG CTG GTG CTG C-3；gouRupR：5’-AAT GAA TTC CAC GGT ACA CCC GTT GTG-3。GouHupF：5’-CCG GGA TCC GCG GAC CGG GCC GCC CTC-3；gouHupR：5’-AAT GAA TTC CAT GAG GGT CGT CCA ATC TTG AC-3。)进行PCR验证，分别扩增得到得到约1kb的 片段，符合的为阳性重组菌，将该重组菌命名为S.coelicolor M1146-pGou，其为异源表 达重组菌株天蓝色链霉菌。

2、重组菌株S.coelicolor M1146-pGou的发酵

接种一环重组菌株S.coelicolor M1146-pGou孢子至10ml YEME(酵母提取物0.3％， 胰蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，蔗糖20％，每100ml使用前加入以下灭过菌的溶液，2.5M MgCl₂ 200μl，50％葡萄糖2ml)中28度培养2天至对数生长期后期。然后按照10％的比例接 种于发酵培养基中(葡萄糖2％，可溶性淀粉1％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.3％，黄 豆粉1％，50ml/500ml三角瓶)28度220rpm培养120hr，收集M1146-pGou发酵液。

采用同样的方法将禾粟链霉菌AS4.506和M1146进行发酵，收集发酵液分别作为AS4.506 发酵液和M1146发酵液；

采用同样的方法将空载体pSET152转入M1146中，得到M1146-pSET152，采用同样的方法 发酵，收集发酵液为M1146-pSET152发酵液。

3、发酵产物的鉴定

先6000rpm 5min离心上述M1146-pGou发酵液，收集上清液经HPLC分析，HPLC分析的 条件：试剂A：H₂O(1‰三氯乙酸)；试剂B：甲醇。洗脱条件：流速1ml/min，92％水(1‰三 氯乙酸)和8％甲醇恒定梯度。仪器：Agilent 1100HPLC；分析柱：Agilent公司的ZORBAX SB-C18 (4.6×250mm，5μm)，并使用Agilent公司的相应的预柱。紫外检测波长为276nm。以上述 的AS4.506发酵液、M1146发酵液和M1146-pSET152发酵液为对照。

结果如6B所示，可以看出，由实施例1看出禾粟链霉菌AS4.506发酵产物中保留时间约 为6.5min的峰对应的即为谷氏菌素，因此，仅有AS4.506发酵液和M1146-pGou发酵液存在 保留时间约为6.5min的峰，即为谷氏菌素。

进一步将禾粟链霉菌AS4.506发酵液和M1146-pGou发酵液中保留时间约为6.5min的峰 收集，进行MS-MS分析(液相色谱/三重四极杆串联质谱联用仪，Agilent 1260/6460)，结果 如图6C所示，进一步证明，得到谷氏菌素，从而证明基因簇可以异源表达谷氏菌素。