胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用

摘要

本发明提供了一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。本发明以自身免疫调节因子Aire序列中由C末端的部分氨基酸序列组成的多肽偶联载体蛋白KLH作为免疫原，制备的Aire多克隆抗体，以及直接以胚胎干细胞作为免疫原制备的兔单克隆抗体Glut3和/或GM-CSFRα，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。包含上述Aire多克隆抗体、兔单克隆抗体Glut3和/或GM-CSFRα的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学及免疫学领域，具体地说，涉及胚胎干细 胞特异性标志物Aire及其应用。

背景技术

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES cells）是指从胚胎内细胞 团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有 三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能 力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标 志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究， 有着十分重要的意义。目前常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因 子OCT4、NANOG、REX1等；表面标志物SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60、 CD9等；这些胚胎干细胞标志物相应抗体，已被广泛应用于干细胞检 测试剂盒，用于干细胞的鉴定与分离。

目前大量研究结果表明，大部分已应用于检测试剂盒的胚胎干细 胞特异性标志物抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的，例如SSEA-1、 SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体 是从小鼠胚胎免疫获得；OCT4、NANOG这些转录因子的抗体则直接 使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。而且这些标志物的特异性有 一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一 定表达，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，开发 更灵敏、特异性更高的胚胎干细胞鉴定试剂意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Aire 及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物 Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该 序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨 基酸序列。

为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物 Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该 序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨 基酸序列。

本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物Glut3（葡萄糖转运 蛋白3），其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失 或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα（粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子受体α链），其氨基酸序列如SEQ ID No.4所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。

本发明直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫兔子，分离兔子脾脏 细胞，与骨髓瘤细胞融合，分别筛选出产生Glut3兔单克隆抗体和 GM-CSFRα兔单克隆抗体的杂交瘤细胞，应用于干细胞的鉴定与分 离。

本发明还提供一种鉴定胚胎干细胞的方法，以Aire、Glut3和 GM-CSFRα中的至少一种作为鉴定胚胎干细胞的标志物。Aire只在胸 腺组织的极少量细胞中被检测到，其他标志物Nanog、Oct4等在许多 肿瘤细胞上均能被检测到。Aire作为胚胎干细胞鉴定标志物，相比 Nanog、Oct4等常规标志物，特异性更好。Glut3可作为胚胎干细胞功 能性鉴定标志物。Glut3和GM-CSFRα兔单克隆抗体识别天然构象表 位，除鉴定胚胎干细胞全能性以外，可同时用于检测干细胞活性。

本发明还提供胚胎干细胞特异性标志物Aire、Glut3和/或 GM-CSFRα在鉴定胚胎干细胞中的应用，用Aire单克隆抗体、Aire多 克隆抗体、Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体中的至少一种 通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。所述Aire多克隆抗体 的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个 氨基酸组成的多肽（其序列为ILQWAIQSMSRPLAETPPFSS）以及由 SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽（其序列 为QSMARPAAPFPS）；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗 原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后， 每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗 体。所述Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体分别由杂交瘤细 胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301）和ZJUESRMAB29 （保藏号CGMCC NO.7302）产生。检测抗原抗体相互作用的方法， 例如免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。

还可以通过检测细胞中Aire基因、Glut3基因和/或GM-CSFRα基因 的表达量来鉴定胚胎干细胞。

本发明进一步提供一种胚胎干细胞检测试剂盒，所述试剂盒任选 包含Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体中的 至少一种。所述Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体分别由杂 交瘤细胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301）和 ZJUESRMAB29（保藏号CGMCC NO.7302）产生。

本发明还提供产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ZJUESRMAB39，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号 CGMCC NO.7301，保藏日期2013年2月5日。

本发明还提供产GM-CSFRα单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ZJUESRMAB29，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号 CGMCC NO.7302，保藏日期2013年2013年2月5日。

本发明还提供由所述Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和/或 GM-CSFRα单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。

本发明以自身免疫调节因子Aire序列中由C末端的部分氨基酸序 列组成的多肽偶联载体蛋白KLH作为免疫原，制备的Aire多克隆抗 体，以及直接以胚胎干细胞作为免疫原制备的兔单克隆抗体Glut3和/ 或GM-CSFRα，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高， 且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。

本发明的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能 性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。

附图说明

图1为本发明实施例2中ICC染色结果。

图2为本发明实施例2中RT-PCR结果。

图3为本发明实施例2中干扰Aire基因的实验结果；其中，A为细 胞培养观察结果，干扰Aire基因，mES的克隆形成率明显降低；B为 敲除Aire基因前后，mES克隆形成率数据统计。

图4为本发明实施例3中流式数据的统计结果；其中，A、C为阴 性抗体对照；B为未分化的mES，D为经10μmol/L at RA诱导分化的 mES。

图5为本发明实施例3中IP实验结果；其中，A表示细胞经条件I 处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进行IP实验，无法检测到Glut3 蛋白；Ｂ表示细胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进 行IP实验，可检测到Glut3蛋白。

图6所示为本发明实施例3中经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大 小的变化。

图7为本发明实施例4中IHC染色结果示意图。

图8为本发明实施例4中ICC染色结果示意图；其中，ZjuESrMab29 为筛选到的GM-CSFRα兔单克隆抗体。

图9所示为本发明实施例4中免疫沉淀（IP）实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1兔多克隆抗体的制备

1.1材料及试剂

载体蛋白KLH购自Thermo Fisher。多肽交由杭州中肽生化有限公 司合成。

1.2兔多克隆抗体的制备

分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组 成的多肽以及由SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组 成的多肽；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗 原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强 免疫；四免后取全血，用多肽-层析柱分离纯化Aire兔多克隆抗体。

实施例2Aire作为胚胎干细胞标志物的应用

1.1Aire基因维持胚胎干细胞的自我更新和分化能力

ICC染色：培养细胞用4%甲醛（Sigma）于37℃固定1.5小时；然 后用封闭液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）于37℃封闭1小时； 封闭后的细胞用一抗（实施例1中制备的Aire兔多克隆抗体）于37℃ 孵育1小时；PBS洗涤；洗涤后细胞加二抗37℃避光孵育45分钟；最 后用0.5μg/ml Hochest33258(Sigma)核染色5分钟；荧光显微镜 (Olympus IX-70)下观察并拍照。ICC染色结果如图1所示，Aire和 SSEA-1双染色阳性，证明Aire在未分化胚胎干细胞上的表达。

RT-PCR实验：利用TRIzol试剂（Invitogen），从培养的未分化ES 细胞和分化不同时间的ES细胞中提取总RNA，利用逆转录酶合成第 一条cDNA；PCR扩增目的基因；目的基因引物利用Primer Premier5 software(PREMIER Biosoft International,Palo Alto CA)设计。引物序列 为：Aire(Mu)Sense5′-GACCAATCTCCGCTGCAAA-3′和Anti-sense 5′-ACATAGAAGTGACTTTAATTCCAGGAT-3′。扩增条件：95℃预 变性2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

RT-PCR结果显示（图2）：随着细胞的分化，ES细胞经典标志物 Oct4和Nanog表达量显著下降，同时Aire的表达量也降低，证明Aire 可作为胚胎干细胞标志物。

1.2干扰Aire基因，明显降低mES的克隆形成率

干扰实验：合成编码shRNA的DNA序列 5′-CCGGCCAGTGGCAATTTGAAGAACACTCGAGTGTTCTTCAAA  TTGCCACTGGTTTTTG-3′，插入到pLKO.1TRC-cloning质粒中，将 构建好的质粒命名为shAire质粒。用shAire质粒与PsPAX2质粒、 pMD2.G质粒共转染293T细胞，包装Aire干扰慢病毒，并感染ES细胞。 按500个细胞／24孔接种细胞，ALP染色检测克隆形成率，结果显示 （图3）干扰Aire后，ES细胞的克隆形成率显著下降。

实施例3Glut3作为胚胎干细胞标志物的应用

1.1Glut3兔单克隆抗体的制备

以小鼠胚胎（mES）干细胞作为免疫原，用1×10⁸个mES免疫3 月龄新西兰大白兔，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2（购 自Epitomics公司）融合，筛选出产生Glut3兔单克隆抗体的杂交瘤细 胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301），应用于干细胞的鉴 定与分离。

1.2Glut3兔单克隆抗体识别天然构象表位，可用于胚胎干细胞的 流式筛选

流式数据的统计结果表明Glu3的表达随ES细胞分化显著下降。

如图4所示：70%完整的mES可被实施例中制备的Glut3兔单克隆 抗体阳性染色，而经10μmol/L at RA（维甲酸）诱导分化的mES细胞 只有3%被阳性染色。

流式细胞术（FC）：无饲养层未分化和经10μmol/L at RA诱导分 化的mES细胞被分离成单个细胞；分别与Glut3兔单克隆抗体和阴性 对照抗体混合孵育；加入FITC-羊抗兔二抗孵育；PBS洗涤；流式读 数观测。

IP实验结果如图5所示。其中，A表示细胞经条件I处理后，利用 Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，无法检测到Glut3蛋白。Ｂ表示细 胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，可检测到 Glut3蛋白。

条件I：Glut3兔单抗1μg和50%(w/v)蛋白A纤维素凝胶（Protein  A-Sepharose bead slurry，GE，USA）20μL于4℃过夜孵育；将2×10⁷个mES用细胞裂解液(1%Triton X-100,50mmol/L Tris-HCl pH7.4, 300mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF)处理；离心后，上 清分成两等分；一份与ProA-Glut3兔单抗凝胶混合，一份与ProA-阴性 抗体混合；蛋白A纤维素凝胶颗粒用洗脱液(0.1%Triton X-100,50 mmol/L Tris-HCl pH7.4,300mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA)清洗， SDS-PAGE电泳，银染显色。

条件II：向2×10⁷个mES中加入0.05mmol/L EDTA，将其分离成 单个细胞，用含有1μg Glut3兔单克隆抗体的细胞培养液1ml重悬细胞， 于37℃反应1h，细胞用PBS清洗3次，再用细胞裂解液裂解；细胞裂 解液经离心后，上清与蛋白A凝胶混合，显色步骤与条件I相同。

1.3经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大小和细胞形成率均明显降 低

向细胞培养液中加入Glut3兔单抗，终浓度为5μg/mL，37℃，5% CO₂培养3天，克隆明显减小，如图6.a所示。而向细胞培养液中加入 阴性抗体，则不影响细胞增殖，见图6.b，图6.c为正常mES细胞培养， 未加入任何抗体。

实施例4GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用

1.1兔单克隆抗体的制备

以小鼠胚胎干细胞（mES）作为免疫原，每次用1×10⁸个mES免 疫3月龄新西兰大白兔，免疫4次，前后两次免疫间间隔3周。四次免 疫后取血清，免疫细胞化学检测阳性后静脉注射1×10⁸个mES细胞加 强，加强3天后分离兔脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2（购自 Epitomics公司）融合，筛选出产生GM-CSFRα兔单克隆抗体的杂交瘤 细胞株ZJUESRMAB29(保藏号CGMCC NO.7302)，应用于干细胞的鉴 定与分离。

1.2GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用

GM-CSFRα的表达将减少细胞的分化，在成体组织中局限表达， 可作为新的胚胎干细胞鉴定标志物。

IHC染色实验：准备好各组织冷冻切片；将各组织冷冻切片置于 3%过氧化氢中10分钟，使内源性过氧化物酶失活；冷冻切片用封闭 液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）37℃封闭1小时；加入一抗（实 施例1中制备的GM-CSFRα兔单克隆抗体）37℃孵育1小时；然后加入 羊抗兔-HRP二抗37℃孵育1小时；最后用新鲜配制的3,3′ -diaminobenzidine(DAB)于37℃显色5分钟，观察读片。结果如图7所 示。IHC染色结果显示：GM-CSFRα在小鼠睾丸中高表达，在肾脏和 脾脏中弱表达，在脑、心、肝和肺中无表达，特异性高。

1.3GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用

ICC染色实验证明GM-CSFRα兔单抗可应用于胚胎干细胞的鉴定 与分选。

ICC实验：培养细胞用4%甲醛（Sigma）于37℃固定1.5小时；然 后用封闭液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）37℃封闭1小时；封 闭后的细胞加入一抗（实施例1中制备的GM-CSFRα兔单克隆抗体） 37℃孵育1小时；PBS洗涤；洗涤后的细胞加入二抗37℃避光孵育45 分钟；最后用0.5μg/ml Hochest33258(Sigma)核染色5分钟；荧光显微 镜(Olympus IX-70)下观察并拍照。结果如图8所示。GM-CSFRα兔单 抗ICC染色结果显示：未分化的mES细胞与培养3天后分化的细胞对 比，未分化的mES染色阳性，分化的mES染色阴性。

1.4GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用

活细胞结合－免疫沉淀实验证明GM-CSFRα兔单抗识别天然构 象抗原。

采用两种方法进行免疫沉淀（IP）实验：

1.4.1经典IP（Classic IP）

10⁸个ES细胞采用RIPA裂解液裂解，与实施例1中制备的 GM-CSFRα兔单抗充分混合，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物， 经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。

1.4.2活细胞IP（Live cell IP)

10⁸个ES活细胞与实施例1中制备的GM-CSFRα兔单抗充分混合， 然后采用RIPA裂解液裂解，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物， 经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。

结果显示：只有在活细胞IP条件下可以获得特异性条带，证明 GM-CSFRα兔单抗识别天然构象表位。（图9）

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。