抑癌基因FBXW7在制备预防或治疗乳腺肿瘤药物中的应用、表达载体和诊断药物

摘要

本发明公开了一种抑癌基因FBXW7在制备预防或治疗乳腺肿瘤药物中的应用、表达载体和诊断药物，属于医药生物技术领域，内容包括抑癌基因FBXW7在制备预防或治疗乳腺肿瘤药物中的应用，由FBXW7基因和pcDNA3.1载体构建而成的表达载体及其制备方法，至少包括一对特异性扩增FBXW7基因的引物、所述的引物由上游引物和下游引物组成的乳腺肿瘤诊断药物。该抑癌基因FBXW7的表达与乳腺癌分子分型密切相关，在恶性程度高的乳腺癌中特异性低表达，并且具有抑制乳腺癌细胞生长的作用。因此筛选低表达该基因的乳腺癌，对乳腺癌的预后预测具有重要意义，特异性恢复该抑癌基因在乳腺癌细胞中的表达，能为乳腺癌的靶向个体化治疗提供一种新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体是抑癌基因FBXW7在乳腺癌制备预防、诊断及治 疗乳腺肿瘤药物中的应用及其表达载体。

背景技术

肿瘤细胞基本特征是细胞生长失控和分化受阻。这种细胞生长失控和分化受阻是由于 多种基因缺陷积累的结果，主要表现在两个方面：一是癌基因的激活或过度表达，另一方 面是肿瘤抑制基因的失活。正常情况下，肿瘤抑制基因能够抑制细胞的恶性转化，对正常 细胞的增殖其负调节作用，当肿瘤抑制基因失活后，正常细胞增殖失控，转化成肿瘤细胞。 对癌基因和抑癌基因的研究对最终揭示细胞癌变的机制、实现肿瘤的预防和有效的基因治 疗具有重大的理论和现实意义。

肿瘤抑制基因(tumor supperssor genes)，是指一类可抑制细胞生长、增殖，诱导细胞凋 亡，并有抑制癌变潜能的基因。当它失活时，协同癌基因导致细胞恶性转化。目前已分离 的肿瘤抑制基因包括有，与DNA结合直接作用起到基因转录调节作用的，如p53、WT1； 间接调节基因转录的，如Rb、APC；在细胞周期中发挥调节作用的，如NF1、TGFβ；以 及调节DNA修复和基因组稳定性的，如MSH、MLH等。

FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing protein7，也称为hCDC4，FBW7)是 F-box蛋白家族成员，为SCF(Skp-cullin-F-box)泛素连接酶的靶蛋白识别组分。近期研究表 明，FBXW7是P53依赖的抑癌基因，在多数人类恶性肿瘤中包括乳腺癌、直肠癌、胃癌、 卵巢癌和白血病中存在突变或缺失。FBXW7通过泛素化调控多种癌蛋白如周期蛋白E、 c-Myc、c-Jun、Notch和mTOR等的含量是其发挥肿瘤抑制作用最常见的机制。我们研究 表明FBXW7是一重要抑癌基因网络（p53-FBXW7-HIPK2-PTEN）的中心节点。FBXW7的 突变或缺失会导致染色体不稳定性增加以及细胞生长失控。

但是目前，FBXW7在乳腺癌中的作用机制尚不完全清楚，其功能和表达变化的临床意 义尚未有报道。因此，分析FBXW7与乳腺癌发生发展的关系，探索针对FBXW7途径的肿 瘤治疗和预警策略至关重要。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种新的抑癌基因在乳腺癌预后预 测诊断及制备预防、治疗乳腺肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

发明人研究发现，FBXW7（如SEQ ID NO.1所示）基因在乳腺癌肿瘤组织中的特异性 低表达与乳腺癌的分子类型相关，并且在特定分子类型的乳腺癌中具有延长患者生存时间 的作用，因此，在筛选FBXW7基因低表达的肿瘤标本的基础上，特异性恢复该抑癌基因在 肿瘤组织细胞中的表达，有望成为乳腺癌靶向治疗的一种新方法和手段。

FBXW7表达作为乳腺癌预后预测和预警诊断的生物靶标。

抑癌基因FBXW7在制备预防或治疗乳腺肿瘤药物中的应用。

所述乳腺肿瘤预防或治疗药物以FBXW7基因为靶点。

所述药物为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射剂、胶囊、片剂或口服 液。

所述乳腺肿瘤为导管型、基底型、腔上皮型乳腺癌A型或B型、ERBB2型、ER阳性 和阴性。所述乳腺癌肿瘤包括但不限于乳腺癌。

一种预防或治疗乳腺肿瘤的表达载体，它是由FBXW7基因和pcDNA3.1载体构建而成。

上述预防或治疗乳腺肿瘤药物的表达载体的制备方法，步骤过下：

（1）获得cDNA：全长FBXW7基因的开放阅读框采用RT-PCR法从正常乳腺组织的 总RNA中获得，然后进行扩增，扩增所用引物为

FBXW7-cF：（SEQ ID NO.2）ttcaccatgaatcaggaactgctc

FBXW7-cR：（SEQ ID NO.3）acacctgtacttcacttgatga

（2）将上述cDNA连接到TOPO PCR Blunt载体，转化感受态细菌，在含青霉素培养 LB板中培养，挑取阳性克隆培养，经测序选择正确克隆；

（3）FBXW7表达载体的构建

抽提正确克隆的质粒，用EcoRⅠ酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收目的片段， 连入线性化的pcDNA3.1载体，转化感受态细菌，在含青霉素培养LB板中培养，挑取阳性 克隆培养，经酶切和测序双鉴定后，保存正确克隆，抽提质粒，即得。

一种乳腺肿瘤诊断药物，它至少包括一对特异性扩增FBXW7基因的引物，所述的引 物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如 GCCAAGGTCCAAGAAGTAGCA（SEQ ID NO.4）的核苷酸序列，下游引物具有如 TAGCGACATGTCTGAGCTGC（SEQ ID NO.5）的核苷酸序列。

诊断方法是：

所述的乳腺肿瘤诊断药物以FBXW7基因为基础的检测手段，检测手段为RT-PCR或实 时定量PCR。用GAPDH作为对照，PCR使用美国Applied biosystem公司的定量RT-PCR 试剂盒。反应总体积为20微升：采用1微升cDNA模板，加入2×PCR buffer10微升，高 纯去离子水9微升。反应参数如下：95℃预热5分钟；35个循环设置如下，95℃，30秒； 58℃，30秒；72℃45秒；最后进行表达分析。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供了一种新抑癌基因在制备乳腺癌诊断、预防或治疗药物中的应用，以 FBXW7基因为基础的诊断药物可方便快捷的在基因水平上实现肿瘤的检测，同时，以 FBXW7基因为靶点的药物有望成为肿瘤靶向治疗的一种新手段。

附图说明

图1a GSE10780数据库分析正常乳腺组织和乳腺癌组织中FBXW7mRNA表达水平；

图1b GSE3844数据库分析正常乳腺组织和乳腺癌组织中FBXW7mRNA表达水平；

图2a.FBXW7mRNA表达水平与患者无病生存率的相关性；

图2b.FBXW7mRNA表达水平与患者总体生存率的相关性；

图3雌激素受体状态与FBXW7表达水平的相关性分析；

图4FBXW7在不同分子亚型的乳腺癌组织中的表达分析；

图5根据分子亚型分析FBXW7表达水平对无病生存率的影响

其中5a正常样乳腺癌型

5b腔上皮型乳腺癌A型

5c腔上皮型乳腺癌B型

5dERBB2型

5e基底型

图6根据分子亚型分析FBXW7表达水平对总生存率的影响

其中6a正常样乳腺癌型

6b腔上皮型乳腺癌A型

6c腔上皮型乳腺癌B型

6dERBB2型

6e基底型

图7是FBXW7基因表达载体的构建示意图；

图8是RT-PCR法和Western blot法检测FBXW7基因表达载体转染前后的基因及蛋白 表达情况；

图9是应用集落形成实验来分析FBXW7基因的抑癌功能；

图10是应用细胞生长曲线实验来分析FBXW7基因的抑癌功能。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施 并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保 护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从 市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

本发明所述的抑癌基因FBXW7基因在开发乳腺癌诊断、预防和治疗手段中的应用，可 参考常规的药物配置方法和试剂开发。药物剂型和生物剂型为医学上认可的任何一种剂型， 例如为粉剂、注射剂、胶囊、片剂或口服液。

实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等所著的分子 克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。

试验试剂：DNA聚合酶，Trizol试剂，小牛血清，磷酸盐缓冲液，RPMI-1640培养基， 青霉素-链霉素和胰蛋白酶购于Invitrogen(USA)。Taq聚合酶购于Promega。乳腺癌细胞系 购自美国的ATCC。逆转录反应使用HighCapacity cDNA Reverse Transcription试剂盒（美 国Applied Biosystem公司）。

实施例1FBXW7基因在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的荟萃分析

1.材料和方法选取包含正常和乳腺癌样本的2个转录组数据库和10个包含临床资料及基 因表达数据的乳腺癌数据库，在这些数据库中的样本均已通过Affymetrix microarray  assay(either HG-U133A or HG U133Plus2.0)or Agilent oligo microarray检测分析（图1a 和图1b，FBXW7mRNA的表达实通过Affymetrix microarray方法检测。通过对两大数 据库GSE10780(a)and GSE3844(b)的分析发现，相对于正常乳腺组织，乳腺肿瘤组织中 的FBXW7mRNA表达水平显著降低）。通过调取GEO网站中的相关数据进行分析。总 计在10个数据库中的1935个病人样本中1900个能够得到无病生存率(disease-free  survival,DFS)的资料。

2.统计分析通过卡方检验分析正常和乳腺癌之间在FBXW7基因mRNA表达水平的差异。 采用Kaplan-Meier法分析无病和总生存率之间FBXW7的差异，分析FBXW7表达水平 与相关分子亚型的相关性。所有分析均采用SPSS11.5.0，p<0.05表示具有统计学意义。

3.结果

我们首先分析FBXW7基因在两个包含正常和乳腺癌样本的数据库（见SEQ ID NO.1） 中的表达。FBXW7在浸润性导管癌中的表达水平（IDC）比在正常的乳腺导管表达水平显 著降低（P=1.09E-13）（图1a）。在另外的数据集，也发现乳腺癌FBXW7表达水平显着低 于在正常乳腺组织（P=0.0013）（图1b）。

接下来，我们研究了从10个可公开获得的数据库（表1）中1900例乳腺癌患者的无病 生存与FBXW7基因表达水平的关系。要做到这一点，我们首先根据FBXW7在每个数据库 中的表达将患者分为不同组别（“FBXW7高”，“中级FBXW7”，“FBXW7低”），然后统计 汇集所有数据库中的患者。所有患者的无病生存率（DFS）的曲线如图2a所示。高表达 FBXW7的患者（“FBXW7高”）相对于中表达（“FBXW7中级”）或低表达（“FBXW7低”） FBXW7的患者能够显著增加DFS（P=0.037）（图2a）。在FBXW7中表达和低表达的群体 之间的DFS曲线无显著差异，这表明FBXW7表达对DFS的影响无剂量依赖性。令人惊讶 的是，FBXW7表达对患者的整体存活率（OS）无显着影响（P=0.35）（图2b）。

ER状态是乳腺癌预测复发及治疗的重要检测指标。因此，我们进行了ER阳性和ER 阴性乳腺癌中FBXW7的表达分析。FBXW7低表达与ER阴性患者较短的DFS和OS（P= 0.038和0.010）密切相关，然而与ER阳性患者的DFS和OS无相关性（图3）。

分子亚型的不同是人类乳腺癌另一重要预后因素。接下来，我们研究是否能从分子亚 型层面揭示FBXW7表达与乳腺癌具有特定的相关性。因此，样本库中的乳腺癌样本被分 为以下几类：正常乳腺样型（n=265）；腔上皮型乳腺癌A型（n=550）；腔上皮型乳腺癌 B型（n=342）；ERBB2的（N=193）；基底细胞样型（N=382）；其他未分类组（N=282）。 FBXW7表达水平在不同的亚型（P=2.28E-23）（图4）均显著不同。值得注意的是腔上皮 型乳腺癌A型和B型中FBXW7表达较低，而正常乳腺样型乳腺癌FBXW7表达显著升高 （图4）。随后，我们进行亚组分析FBXW7在每个分子亚型肿瘤中与患者生存时间的相关 性。研究发现，仅在基底细胞样型患者的FBXW7高表达能显着增加患者的DFS（P=0.040） （图5）。对不同亚型的患者而言，FBXW7对患者的OS长短有着不同的效果（图6）。在 正常乳腺样肿瘤亚型，具有FBXW7高表达的患者其OS显著缩短（P=0.044）（图6a），而 在ERBB2亚型和基底细胞样亚型肿瘤患者中，高表达的FBXW7能显著延长其OS（P=0.003 和0.049）（图6d和e）

4.结论

我们的荟萃分析表明，FBXW7作为ER阴性和基底细胞样亚型乳腺癌患者具有重要的 意义，可以作为一个诊断、治疗和预后预测的靶标。

实施例2FBXW7cDNA的克隆和表达载体的构建

1.克隆专用cDNA合成

逆转录反应（RT）使用Fermentas公司的First Synthesis System for RT-PCR试剂盒，每 个反应使用2μg总RNA。反应总体积为20μl：10×RT buffer2μl，总RNA5μl，oligodT20 引物1μl，10mM dNTP1μl，25mM MgCl₂4μl，0.1M DTT1μl，RNaseOUT1μl，SuperScriptⅢ 逆转录酶1μl，高纯去离子水4μl。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如 下：25℃10min；37℃60min；75℃5min；冷却至4℃。-20℃保存备用。

2.FBXW7cDNA的克隆

全长FBXW7基因的开放阅读框采用RT-PCR法从正常乳腺组织的总RNA中扩增获 得，其中PCR使用Fermentas公司的Mix，反应总体积为50μl：2×PCR Mix25μl，引物 各1μl，cDNA模板5μl，高纯度去离子水23μl。PCR反应参数如下：95℃预变性4min； 反应35个循环：95℃,30s；58℃30s；72℃45s,72℃延伸1min。

运用TOPO技术，连接到TOPO PCR Blunt载体。具体步骤如下：取新鲜PCR产物 2μl，加入载体1μl，试剂盒中NaCl溶液1μl，高纯去离子水2μl。室温下孵育10min后 转化细胞：将TOPO反应产物加入冰浴融化的感受态细菌中，冰浴孵育30min，42℃热 激活90s，加入试剂盒中SOB培养液1ml，37℃低俗培养1h，再将细菌培养液接种在含 青霉素培养LB板中继续常规培养过夜。第二天，挑取克隆培养，经测序选择正确克隆。

3.FBXW7的克隆引物

FBXW7-cF：（SEQ ID NO.2）ttcaccatgaatcaggaactgctc

FBXW7-cR：（SEQ ID NO.3）acacctgtacttcacttgatga

4.FBXW7表达载体的构建

抽提正确克隆的质粒，用EcoRⅠ酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收目的片段， 连入线性化的pcDNA3.1。连接反应如下：载体1μl，回收插入5μl，连接酶缓冲液2μl， T4DNA连接酶1μl。16℃连接过夜。过夜连接产物参照步骤2中的细菌转化程序进行转 化和细菌接种。挑取克隆培养，经酶切和测序双鉴定后，保存正确克隆，抽提质粒，用 于基因转染。

5.结果分析

FBXW7基因的哺乳动物表达载体构建成功（见图7，8）

实施例3集落形成实验分析FBXW7基因的抑癌功能

1.操作过程

利用克隆形成实验来检测FBXW7基因对乳腺癌细胞生长的作用，100000个细胞接种于 12孔培养板培养过夜，使用FUGENE6试剂转染FBXW7质粒，并使用空的pcDNA3.1 载体作为对照。转染48h后，转染的细胞均分成三组重新接种，并使用含有400μg/ml 的G418培养基培养10-15d，形成的克隆选用甲醇固定，然后用龙胆紫染色，大于等于 50个细胞的克隆被统计用于分析。

2.结果分析

BT549细胞中，当外源转入FBXW7基因后，肿瘤细胞形成克隆的能力显著降低（图9）。 表明FBXW7具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能。

实施例4细胞生长曲线法分析FBXW7的功能

1.操作过程

利用细胞生长曲线实验来检测FBXW7基因对乳腺癌细胞生长的影响。基因转染同实施 例4。转染细胞用含有400μg/ml的G418培养基培养筛选，获得的稳定细胞株在12孔细 胞培养板中连续培养4-5d，使用台盼蓝染色进行活细胞技术，所得结果如图10所示， 稳定表达FBXW7基因的细胞株的增殖能力显著低于对照的空载体细胞株。

2.结果分析

当外源转入FBXW7基因后，肿瘤细胞的生长能力被显著抑制（见图10）

实施例5

一种乳腺肿瘤诊断药物，它至少包括一对特异性扩增FBXW7基因的引物，所述的引 物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸 序列，下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

所述的乳腺肿瘤诊断药物以FBXW7基因为基础的检测手段，检测手段为RT-PCR或实 时定量PCR。

诊断方法是：用GAPDH作为对照，PCR使用美国Applied biosystem公司的定量RT-PCR 试剂盒。反应总体积为20微升：采用1微升cDNA模板，加入2×PCR buffer10微升，高 纯去离子水9微升。反应参数如下：95℃预热5分钟；35个循环设置如下，95℃，30秒； 58℃，30秒；72℃45秒；最后进行表达分析。

结论：

FBXW7基因在乳腺癌组织中表达下降，且其表达水平与ER-乳腺癌患者的预后生存时 间密切相关；通过克隆FBXW7cDNA，构建FBXW7基因的哺乳动物表达载体，发现使 FBXW7基因在肿瘤细胞中高表达后，可以抑制肿瘤细胞生长。以上结果表明：FBXW7基 因在乳腺癌中具有抑癌功能，特别是ER-型乳腺癌，检测FBXW7基因的表达可以用于乳腺 癌的诊断。而恢复FBXW7基因的抑癌功能则可以达到治疗肿瘤的目的。因此，FBXW7基 因在乳腺癌的诊断、预防及治疗中均有一定的应用价值。

尽管本发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于 本领域普通技术人员而言，对上述实施例作出修改和或变通或者采用等同的替代方案是显 然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述 和理解，并不能构成对本发明的限制。