一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置

摘要

本发明实施例公开了一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置，可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。本发明实施例方法包括：制备胶体金；利用所述胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；利用所述免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；对所述样本进行制片。由于胶体金颗粒子在普通光学显微镜下可见，当利用胶体金与抗上皮细胞粘附分子的抗体制备的免疫金去标记上皮细胞粘附分子时，通过直接观察就可以确定上皮细胞粘附分子的性质，由于子宫颈癌细胞与其表面的上皮细胞粘附分子的表达水平相关度很高，所以可以通过本发明实施例中的制备方法及装置简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

说明书

技术领域

本发明实施例涉及生物医学技术领域，具体涉及一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置。

背景技术

子宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率位于女性肿瘤的第二位。全世界每年大约有20万妇女死于这种疾病，而对子宫颈癌前病变的早期诊断和治疗可以降低其发生率。

目前国际上较先进的一种宫颈癌细胞学检查技术是新柏氏液基细胞学检测（TCT，Thinprep Cytologic Test），TCT检查是采用液基薄层细胞检测系统检测宫颈细胞并进行细胞学分类诊断的方法，与传统的宫颈刮片巴氏涂片检查相比明显提高了标本的满意度及宫颈异常细胞检出率，同时还能发现部分癌前病变，微生物感染如霉菌、滴虫、病毒、衣原体等。

然而利用新柏氏液基细胞学检测进行病理诊断不但需要经验丰富的专家，而且即使这样，还是会出现误诊和漏诊。因此开发简便快速检测癌细胞的技术有很大的临床意义。

发明内容

本发明实施例提供了一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置，可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

本发明实施例提供的新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法，包括：

制备胶体金；

利用所述胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；

利用所述免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；

对所述样本进行制片。

可选地，所述胶体金的制备方法包括：

（1）将氯金酸配制成浓度为0.005%-0.015%的水溶液并取100-200ml加热至沸腾；

（2）搅拌氯金酸水溶液，并向所述氯金酸水溶液加入3-6ml浓度为0.5-1.5%的柠檬酸三钠水溶液；

（3）将经过步骤（2）处理之后的溶液加热煮沸15-20分钟；

（4）冷却经过步骤（3）处理之后的溶液2-10分钟至室温后用双蒸馏水恢复所述经过步骤（3）处理之后的溶液的体积至原体积，得到胶体金溶液。

可选地，所述利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金的方法包括：

（1）调节所述胶体金溶液的pH值为7.5至8.5；

（2）将所述抗上皮细胞粘附分子的抗体置入透析袋内后放入双蒸馏水中透析2-4小时或过夜；

（3）对经过步骤（2）处理之后的溶液在4℃下进行离心力为50000-100000g的离心沉淀50-70分钟并去除所述溶液中的聚合物；

（4）取经过步骤（3）处理之后的溶液的上清液，调整所述上清液的蛋白质至0.5-1mg/ml的浓度并将调整后的上清液作为抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液；

（5）用浓度为0.004-0.006mol/l pH值为8.5-9.5的硼酸盐缓冲液将所述抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液作系列稀释后，取0.05-0.15ml抗上皮细胞粘附分子的抗体系列稀释液加到0.5-1.5ml所述胶体金溶液中，另设一管不加所述抗上皮细胞粘附分子的抗体系列稀释液的对照管，4-6分钟后分别向各管中加入0.05-0.15ml浓度为8-12％的NaCl溶液，混匀各管的溶液后静置1.5-2.5小时，在能使胶体金稳定的蛋白量上再加9%-11％并将所述蛋白量记为最佳标记蛋白量；

（6）调整所述上清液中蛋白量含量为所述最佳标记蛋白量并加入所述胶体金溶液并充分混合15-30分钟；

（7）向经过步骤（6）处理之后的溶液中加入浓度为2%-4%的PEG-2000使所述溶液的PEG-2000最终浓度为0.05%-0.1%并搅拌所述溶液10-15分钟；

（8）取经过步骤（7）处理之后的溶液中的沉淀部分并用含0.5%-1.5%的BSA和0.01%-0.03%的NaN₃的浓度为0.01-0.03mol/l pH值为7.0-7.4的Tris-HCl的缓冲液稀释所述沉淀部分，得到免疫金；

（9）回收所述免疫金并用微孔滤膜进行过滤除菌。

可选地，在步骤所述利用所述免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记之后和步骤所述对样本进行制片之前还包括：

对玻片进行预处理；

对样本细胞的抗体进行孵育；

所述对玻片进行预处理包括：

用浓度为93%-97%的乙醇浸泡处理所述玻片；

用双蒸馏水清洗所述玻片；

用3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷包被玻片。

可选地，在步骤所述对样本进行制片之后还包括：

利用显微镜对所述制片进行观察。

可选地，在步骤所述对样本进行制片之后还包括：

对所述制片进行染色；

利用显微镜对所述制片进行观察。

本发明实施例提供的新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备装置，包括：

制备单元一，用于制备胶体金；

制备单元二，用于利用所述胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；

标记单元，用于利用所述免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；

制片单元，用于对所述样本进行制片。

可选地，所述装置还包括：

预处理单元，用于对玻片进行预处理；

孵育单元，用于对样本细胞的抗体进行孵育。

本发明实施例中，首先制备胶体金；然后利用所述胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；接着利用所述免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；最后对所述样本进行制片。由于胶体金颗粒子在普通光学显微镜下可见，当利用胶体金与抗上皮细胞粘附分子的抗体制备的免疫金去标记上皮细胞粘附分子时，通过直接观察就可以确定上皮细胞粘附分子的性质，由于子宫颈癌细胞与其表面的上皮细胞粘附分子的表达水平相关度很高，所以可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

附图说明

图1为本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备方法第一实施例流程图；

图2为本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备方法第二实施例流程图；

图3为本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备装置实施例结构图。

具体实施方式

本发明实施例提供了一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置，可以简单、快速和准确地对癌细胞和间皮细胞进行鉴别诊断。

请参阅图1，本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法的第一实施例包括：

101、制备胶体金；

胶体金的成份主要是氯金酸，制备方法可以采用柠檬酸三钠还原法，通常采用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷和硼氢化钠。

102、利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；

制备好胶体金之后，可以利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金。

103、利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；

制备好免疫金之后，可以利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记。

104、对样本进行制片。

利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记之后，可以对样本进行制片。

本发明实施例中，首先制备胶体金；然后利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；接着利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；最后对样本进行制片。由于胶体金颗粒子在普通光学显微镜下可见，当利用胶体金与抗上皮细胞粘附分子的抗体制备的免疫金去标记上皮细胞粘附分子时，通过直接观察就可以确定上皮细胞粘附分子的性质，由于子宫颈癌细胞与其表面的上皮细胞粘附分子的表达水平相关度很高，所以可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

上面简单介绍了本发明新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法的第一实施例，下面对本发明新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法的第二实施例进行详细的描述，请参阅图2，本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法的第二实施例包括：

201、制备胶体金；

胶体金的成份主要是氯金酸，制备方法可以采用柠檬酸三钠还原法，通常采用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷和硼氢化钠。原理与具体操作方法如下：

2HAuCl₄+3C₆H₈O₇=2Au+3C₅H₆O₅+8HCl+3CO₂

制备胶体金的具体方法包括：将氯金酸（HAuCl₄）配制成浓度为0.005%-0.015%，可以为0.01％的水溶液并取100-200ml，可以为100ml加热至沸；搅拌氯金酸水溶液，并向氯金酸水溶液加入3-6ml，可以为5ml，浓度为0.5-1.5%，可以为1％的柠檬酸三钠水溶液；接着继续加热煮沸上述溶液15-20分钟，可以为15分钟；最后将上述得到的溶液进行冷却2-10分钟，可以为5分钟至室温后用双蒸馏水恢复至原体积，可以得到胶体金。

202、利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；

制备好胶体金之后，可以利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金。

具体制备免疫金的方法可以为：首先可以用浓度为0.2mol/l的K₂CO₃或浓度为0.1mol/l的HCl调节胶体金溶液的pH至选定值，可以为7.5至8.5；然后将抗上皮细胞粘附分子的抗体置入透析袋内后，放入双蒸馏水中透析2-4小时或过夜，接着将上述溶液在4℃下进行离心力为50000-100000g，可以为100000g的离心沉淀50-70分钟，可以为60分钟并去除所述溶液中的聚合物，取上述溶液的上清液，调整所述上清液的蛋白质至0.5-1mg/ml的浓度并将上述上清液作为抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液。

得到抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液后，用浓度为0.004-0.006mol/l，可以为0.005mol/l，碱度为8.5-9.5，可以为9.0的硼酸盐缓冲液将抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液作系列稀释后，取0.05-0.15ml，可以为0.1ml抗上皮细胞粘附分子的抗体系列稀释液加到0.5-1.5ml，可以为1ml胶体金溶液中，另设一支不加抗上皮细胞粘附分子的抗体质系列稀释液的对照管，4-6分钟，可以为5分钟后分别向各支试管中加入0.05-0.15ml，可以为0.1ml浓度为8-12％，可以为10%的NaCl溶液，混匀各管的溶液后静置1.5-2.5小时，可以为2小时，在能使胶体金稳定的蛋白量上再加9%-11％，可以为10%并将上述蛋白量记为最佳标记蛋白量。

得到最佳标记蛋白量后，调整上清液中蛋白量含量为最佳标记蛋白量，取上述上清液加入胶体金溶液并充分混合15-30分钟，可以为15分钟，接着加入浓度为2%-4%，可以为3%的PEG-2000使上述溶液中的PEG-2000最终浓度为0.05%-0.1％，可以为0.05%，并搅拌上述溶液10-15分钟，取样品并吸取上清液，然后取管底沉淀部分，用含0.5%-1.5%，可以为1%的BSA和0.01%-0.03%，可以为0.02%的NaN₃的浓度为0.01-0.03mol/l，可以为0.02mol/lpH值为7.0-7.4，可以为7.2的Tris-HCl的缓冲液稀释上述沉淀部分，得到免疫金，最终免疫金的回收量为原体积的10%。

接着还可以用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装，并在4℃下保存备用。

203、利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；

制备好免疫金之后，可以利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记。

204、对玻片进行预处理；

上述对玻片进行预处理可以包括：首先用浓度为93%-97%，可以为95%的乙醇浸泡处理玻片；接着用双蒸馏水清洗玻片；最后用3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷包被玻片即可完成对玻片的预处理，上述的预处理过程可以设定在步骤206之前的任一步骤之前或之后，而不限定与本实施例中的在步骤203之后。

205、对样本细胞的抗体进行孵育；

上述具体的孵育过程可以为，将胶体金包被的抗体与样本孵育在35-39℃，可以为37℃的恒温孵育箱中,反应一段时间，可以为2小时或者在4℃的恒温孵育箱中过夜,然后取出后依次用清洗液，可以用浓度为1%Tween20的PBS清洗，最后在转速，可以为1000rpm的离心机中离心若干次，可以为3次，每次持续若干时间，可以为5分钟。

206、对样本进行制片。

完成对样本细胞进行抗体孵育之后，可以对样本进行制片。具体的制片方法为现有技术中的内容，在此处不再赘述。

对所述样本进行制片之后，可以对上述制片进行观察。在对上述制片进行观察之前，还可以对所述制片进行染色，然后再进行观察。

本发明实施例中，首先制备胶体金；然后利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；接着利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；最后对样本进行制片。其中还可以对玻片进行预处理和对样本细胞进行抗体孵育。由于胶体金颗粒子在普通光学显微镜下可见，当利用胶体金与抗上皮细胞粘附分子的抗体制备的免疫金去标记上皮细胞粘附分子时，通过直接观察就可以确定上皮细胞粘附分子的性质，由于子宫颈癌细胞与其表面的上皮细胞粘附分子的表达水平相关度很高，所以可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

上面对本发明新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备方法的第二实施例作了详细描述，特别是制备胶体金和免疫金的过程，下面介绍本发明新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备装置实施例，请参阅图3，本发明实施例中新的子宫颈癌细胞的标记技术及其制备装置实施例包括：

制备单元一301，用于制备胶体金；

制备单元二302，用于利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；

标记单元303，用于利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；

制片单元304，用于对样本进行制片。

所述装置还包括：

预处理单元305，用于对玻片进行预处理；

孵育单元306，用于对样本细胞的抗体进行孵育。

首先制备单元一301制备胶体金，胶体金的成份主要是氯金酸，制备方法可以采用柠檬酸三钠还原法，通常采用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷和硼氢化钠。原理与具体操作方法如下：

2HAuCl₄+3C₆H₈O₇=2Au+3C₅H₆O₅+8HCl+3CO₂

制备胶体金的具体方法包括：将氯金酸（HAuCl₄）配制成浓度为0.005%-0.015%，可以为0.01％的水溶液并取100-200ml，可以为100ml加热至沸；搅拌氯金酸水溶液，并向氯金酸水溶液加入3-6ml，可以为5ml，浓度为0.5-1.5%，可以为1％的柠檬酸三钠水溶液；接着继续加热煮沸上述溶液15-20分钟，可以为15分钟；最后将上述得到的溶液进行冷却2-10分钟，可以为5分钟至室温后用双蒸馏水恢复至原体积，可以得到胶体金。

制备单元一301制备好胶体金之后，制备单元二302可以利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金。

制备单元二302具体制备免疫金的方法可以为：首先可以用浓度为0.2mol/l的K₂CO₃或浓度为0.1mol/l的HCl调节胶体金溶液的pH至选定值，可以为7.5至8.5；然后将抗上皮细胞粘附分子的抗体置入透析袋内后，放入双蒸馏水中透析2-4小时或过夜，接着将上述溶液在4℃下进行离心力为50000-100000g，可以为100000g的离心沉淀50-70分钟，可以为60分钟并去除所述溶液中聚合物，取上述溶液的上清液，调整上清液的蛋白质至0.5-1mg/ml的浓度并将上述上清液作为抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液。

得到抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液后，用浓度为0.004-0.006mol/l，可以为0.005mol/l，碱度为8.5-9.5，可以为9.0的硼酸盐缓冲液将抗上皮细胞粘附分子的抗体储存液作系列稀释后，取0.05-0.15ml，可以为0.1ml抗上皮细胞粘附分子的抗体系列稀释液加到0.5-1.5ml，可以为1ml胶体金溶液中，另设一支不加抗上皮细胞粘附分子的抗体系列稀释液的对照管，4-6分钟，可以为5分钟后分别向各支试管中加入0.05-0.15ml，可以为0.1ml浓度为8-12％，可以为10%的NaCl溶液，混匀各管的溶液后静置1.5-2.5小时，可以为2小时，在能使胶体金稳定的蛋白量上再加9%-11％，可以为10%并将上述蛋白量记为最佳标记蛋白量。

得到最佳标记蛋白量后，调整上清液中蛋白量含量为最佳标记蛋白量，取上述上清液加入胶体金溶液并充分混合15-30分钟，可以为15分钟，接着加入浓度为2%-4％，可以为3%的PEG-2000使所述溶液的PEG-2000最终浓度为0.05%-0.1％，可以为0.05％，并搅拌所述溶液10-15分钟，取样品并吸取上清液，然后取管底沉淀部分，用含0.5%-1.5%，可以为1%的BSA和0.01%-0.03%，可以为0.02%的NaN₃的浓度为0.01-0.03mol/l，可以为0.02mol/lpH值为7.0-7.4，可以为7.2的Tris-HCl的缓冲液稀释上述沉淀部分，得到胶体金标记复合物，最终胶体金标记复合物的回收量为原体积的10%。

接着还可以用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装，并在4℃下保存备用。

制备单元二302制备好免疫金之后，标记单元303可以利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记，标记单元303完成利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记之后预处理单元305可以对玻片进行预处理。

上述对玻片进行预处理可以包括：首先用浓度为93%-97％，可以为95%的乙醇浸泡处理玻片；接着用双蒸馏水清洗玻片；最后用3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷包被玻片即可完成对玻片的预处理。

预处理单元305完成玻片预处理过程之后，孵育单元306可以对样本细胞的抗体进行孵育。

上述具体的孵育过程可以为，将胶体金包被的抗体与样本孵育在35-39℃，可以为37℃的恒温孵育箱中,反应一段时间，可以为2小时或者在4℃的恒温孵育箱中过夜,然后取出后依次用清洗液，可以用浓度为1%Tween20的PBS清洗，最后在转速，可以为1000rpm的离心机中离心若干次，可以为3次，每次持续若干时间，可以为5分钟。

孵育单元306对样本细胞进行抗体孵育的过程完成之后，制片单元304对所述样本进行制片。具体的制片方法为现有技术中的内容，在此处不再赘述。

制片单元304对样本进行制片之后，可以对上述制片进行观察。在对上述制片进行观察之前，还可以对制片进行染色，然后再进行观察。

本发明实施例中，制备单元一301首先制备胶体金；然后制备单元二302利用胶体金和抗上皮细胞粘附分子的抗体制备免疫金；接着标记单元303利用免疫金对预收集的样本中的上皮细胞粘附分子进行标记；最后制片单元304对样本进行制片。其中预处理单元305还可以对玻片进行预处理和孵育单元306对样本细胞进行抗体孵育。由于胶体金颗粒子在普通光学显微镜下可见，当利用胶体金与抗上皮细胞粘附分子的抗体制备的免疫金去标记上皮细胞粘附分子时，通过直接观察就可以确定上皮细胞粘附分子的性质，由于子宫颈癌细胞与其表面的上皮细胞粘附分子的表达水平相关度很高，所以可以简单、快速和准确地对子宫颈癌细胞进行鉴别诊断。

本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。

以上对本发明所提供的一种新的子宫颈癌细胞的标记技术的制备方法及装置进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。