以生物样品中的氧及氢同位素诊断肾脏失调或肿瘤疾病

摘要

本发明提供一种在疑似肾脏疾病或肿瘤疾病的个体诊断肾脏疾病或肿瘤疾病可能性的方法，包括测定疑似肾脏疾病或肿瘤疾病的个体的生物样品中delta O-18(δ

说明书

技术领域

本发明是关于肾脏疾病或肿瘤疾病的诊断。具体而言，本发明 使用生物样品中的δH-2(δ²H)和/或δO-18(δ¹⁸O)值作为肾脏疾病或肿 瘤疾病的诊断基础。

背景技术

肾脏为位于脊椎动物腹腔的背侧的单个或成对的器官，其功能 为维持适当的水及电解质平衡、调节酸碱浓度及过滤血中代谢废物 并以尿液形式排出。因此，肾脏疾病的结果会导致生物整体不平 衡。许多器官，如膀胱、肠、心脏、肺及前列腺依靠肾脏的能力滤 出身体中的不需要的废物并维持整体平衡。

肾脏是清洁血液的器官。肾动脉将血液自心脏带到肾脏，并通 过数百万含有肾元的肾小球网络清洁血液。肾元滤出毒素、过量营 养物及体液；剩余的经清洁及过滤的血液接着通过肾静脉回到血液 循环中。滤出的物质流经肾小管调整盐份、水及废物，并排出至尿 液。肾盂收集尿液；尿液从肾盂经输尿管流到膀胱；尿液排出膀胱 并经尿道排出身体。

肾脏疾病包括高血压、肾小球肾炎与囊肿。糖尿病影响身体调 节血糖的能力，过量血糖会伤害肾脏肾元，降低血管过滤毒素的能 力。高血压伤害肾元；而肾小球肾炎通常关于一类非肾脏感染的疾 病。

如两个肾由于疾病丧失功能，病患经验末期肾失调(end stage  renal disease；ESRD)或肾衰竭。肾衰竭意指身体不再去除特定毒素 且无法适当地调节血压及重要营养物。除非这些病患经过治疗，否 则他们由于毒素及废液堆积在血液中而可能在数天内死亡。

糖尿病性肾病，已知为糖尿病肾病变，是第1型糖尿病(TIDM) 患加速发病并提早死亡。约25%至40%的TID M病患会发展成糖尿病 肾病变。糖尿病肾病变的最长期严重影响是肾衰竭导致末期肾脏 病，一种永久及几乎完全失去肾功能的病况，仅有少于10%的肾基 础功能。

已知诊断肾脏疾病的传统方法牵涉特定蛋白质的检测。 US7,141,382关于检测样品中介白素18(interleukin 18)的方法，较佳 为倾向如肾衰竭的个体的血清肌酸酐增加前。US7,935,495提供一种 检测动物早期肾病的方法，包括下列步骤：(a)得到欲检测样品及(b) 测定样品中白蛋白的量。US7,833,872关于新颖且有用的生物标记， GRO-alpha(即，CXCL1、趋化素(Chemokine)C-X-C配体1、GRO1、 GROa、MGSA、MGSA alpha、MGSA-a、NAP-3、SCYB1)，针对急 性肾伤害(即AKI)、肾缺血再灌注伤害(即IRI)、缺血性急性肾伤害 和/或缺血性急性肾小管性肾炎。虽然已知许多测定尿液或血液样品 中成份的诊断肾失调的方法，但此等方法的缺点是牵涉复杂的步骤 以得到测定结果。

此外，肿瘤或癌症病况持续为最普遍引起死亡的疾病的一种疾 病。肿瘤发生随老化增加。肿瘤或癌症由持续多种基因突变引起， 导致致癌基因活化和/或肿瘤抑制基因不活化。肿瘤或癌症成为全球 致死率的主要原因。虽然诊断及治疗的进步，总存活率并未显著提 升。仍有需要较准确和灵敏的诊断肿瘤或癌症的检测方法，特别是 早期阶段的肿瘤或癌症。

水是生命的基础，也是身体最重要且最丰富的物质，约占身体 质量的70%。虽然注意到水的重要性，但水同位素的独特性通常被 忽略。天然水含有微量的重同位素氢和氧原子，其中²H与¹⁸O是主 要种类。¹H对²H的比例约为6240比1，或在V-SMOW(Vienna  Standard Mean Ocean Water)水标准中为约155ppm，和¹⁶O对¹⁸O的比 例约为499比1或约2005ppm。水同位素的独特特性与质谱技术的快 速进展，各种生物样品中氢(^δH)与氧(^δO)的安定比例已在古食物、气 象学、人类学、生态学和现代食物链网中作为”原子化石或追踪 者”。

安定的非放射活性的同位素水，²H₂O，在人类生理和病理生理 上扮演重要角色。数种使用动物和细胞培养研究已显示饮食水中 ²H₂O的增加或缺乏在病理生理和生理上具有重要影响。例如，现有 技术显示²H₂O通过刺激微管蛋白次单元(tubulin subunit)的聚合可促 进微小管(microtubule)的形成，并导致细胞死亡。此外，²H₂O含量 增加在自发性高血压鼠可预防高血压。换言之，培养基中水的重氢 (deuterium)缺乏降低动物细胞株的生长率。未治疗的链佐霉素诱导 的糖尿病(streptozotocin-induced diabetes mellitus)鼠的身体水中的 氢(δ²H)与氧(δ¹⁸O)同位素比例与正常鼠显著不同。

然而，没有任何现有技术揭示、教示或建议水同位素与肾脏疾 病与肿瘤间的关系。

发明内容

本发明惊讶地发现生物样品中delta H-2(δ²H)和/或delta O- 18(δ¹⁸O)的值与肾脏疾病或肿瘤疾病有关。因此，本发明发展比较得 自假定具有肾脏疾病可能的个体与没有肾脏疾病或肿瘤疾病的个体 的生物样品中delta H-2(δ²H)和/或delta O-18(δ¹⁸O)的诊断肾脏疾病或 肿瘤疾病的方法。

除非另有定义，本文中所有技术或科学用语具有本领域技术人 员一般了解的意义。所有本文中提到的公开刊物、专利申请案、专 利及其它参考数据均以其全文并入参考。此外，材料、方法及实施 例仅做为说明，并非限制本发明。

用语”检测(detecting)”或”诊断(diagnosing)”是鉴定具肾脏疾病 或肿瘤疾病的病患或罹患肾脏疾病或肿瘤疾病风险的病患。

用语”分析(assay)”指分析样品以测定样品中物质的存在和/或该 物质的量。

用语”降低量(decreased amount)”指较预定量为低的量。用语” 肾脏疾病(renal disease)”指一个体的肾脏功能失调、受损、异常或 功能障碍。

用语”样品”指得自哺乳动物个体的体液或组织液样品。作为 非限制性实例，用于本发明的体液或组织液样品可为尿液、血液、 血清、血浆、唾液、淋巴液、脑脊髓液、囊性液(cystic fluid)、腹 水、粪便、胆汁、组织液及任何其它的分离体液。

用语”肿瘤”或”癌症”包括，但不限于，源自乳房、前列腺、大 肠、肺、胰脏、肝、胃、膀胱或生殖器官(子宫颈、卵巢、子宫内膜 等)、脑和骨髓的肿瘤或癌症、黑色素瘤或淋巴癌。

本案引用的所有刊物与专利文件以其全部并入参考，其目的是 如个别公开或专利文件指出的相同范围。文件中的各种参考数据的 引用，申请人不承认任何特定文献为其发明的现有技术。

在一方面，本发明提供一种在疑似肾脏疾病或肿瘤疾病的个体 诊断肾脏疾病或肿瘤疾病可能性的方法，包括测定疑似肾脏疾病或 肿瘤疾病的个体的生物样品中delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)的 值，比较该测定的delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)值与没有肾脏 疾病或肿瘤疾病的个体的delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)的参考 值，基于该测定的delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)值与delta O- 18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)的参考值的比较诊断肾脏疾病或肿瘤疾 病的可能性；其中当疑似肾脏疾病或肿瘤疾病的个体的生物样品中 delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)的值低于没有肾脏疾病或肿瘤疾 病的个体的delta O-18(δ¹⁸O)和/或delta H-2(δ²H)的参考值时，则诊断 为有肾脏疾病或肿瘤疾病的可能性。

所有哺乳动物个体可使用本发明方法测试。典型地，受测个体 (或病患)罹患肾功能障碍(例如末期肾失调、肾病变、肾衰竭、高尿 酸血症、糖尿病性肾病变、缺血性或毒物诱导的肾伤害、慢性肾衰 竭、急性肾衰竭、肾小球性肾炎、多囊性肾病或慢性肾盂肾炎)、或 肿瘤(例如，赘瘤(neoplasm)、肿瘤(tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤 (sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝细胞癌、肝母细胞瘤、 横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、神经节母细胞瘤、纤维肉瘤、黏 液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮 肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤 (ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大肠癌、胰 脏癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞 癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、 髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、血肿、胆管癌、黑色素瘤、绒毛 膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms'tumor)、子 宫颈癌、睪丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶 质瘤、星状细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果腺 瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞肿瘤、白血病、急性成髓细胞性 白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非 何杰金氏症)、多发性骨髓瘤、Waldenstro m氏巨蛋白血症 (Waldenstrom macroglobulinemia)、直肠癌、头颈癌、脑癌、原发部 位未明癌、周围神经系统癌、中枢神经系统癌、听神经瘤、少突胶 质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、重链病、癌转移、及以未控制 或不正常细胞生长表征的任何疾病或病症组成的群组)。较佳地，哺 乳动物个体为人类、猪、马、狗、绵羊、牛、山羊或猫。

本发明惊讶地发现健康个体的水同位素存在生物平衡 (biological homeostasis)。健康个体中的水状态(δ¹⁸O与δ²H)与肾脏疾 病或肿瘤疾病的体中的水状态显著不同。肾脏疾病或肿瘤疾病的体 中的delta O-18和/或delta H-2是降低的。

样品中的delta O-18和/或delta H-2的值作为比较用的参考值者 是得自没有肾脏疾病或肿瘤疾病的个体(健康病患)。肾脏疾病或肿 瘤疾病可藉由得自个体(如疑似罹患肾脏疾病或肿瘤疾病的个体)的 体液样品中delta O-18和/或delta H-2的值降低而诊断。

根据本发明的方法也适合于健康个体的例行分析，即实施年度 分析以诊断非常早期阶段的肾脏疾病或肿瘤疾病。

”控制组”参考值为得自健康状态的相同或其它个体的参考值。 具体而言，同位素表示为关于国际V-SNOW (Vienna Standard Mean  ocean Water)标准的δ-符号(‰)。根据本发明，没有肾脏疾病或肿瘤 疾病的个体的delta O-18为-3⁰/₀₀至约-4.5⁰/₀₀。没有肾脏疾病或肿瘤疾 病的个体的d elta H-2为-30⁰/₀₀至约-35⁰/₀₀。

根据本发明，水同位素降低诊断为肾脏疾病或肿瘤疾病。也就 是说，罹患肾脏疾病或肿瘤疾病的个体中的delta O-18和/或delta H- 2的值低于没有肾脏疾病或肿瘤疾病的个体中的值。根据本发明， 罹患肾脏疾病或肿瘤疾病的个体的delta O-18值低于约-4.5‰、约- 5.5‰、约-6.0‰、约-7.0‰、约-8.0‰、约-9.0‰、约-10.0‰、约- 11.0‰、约-12.0‰、约-13.0‰、约-14.0‰、约-15.0‰、约-16.0‰、 约-17.0‰、约-18.0‰、约-19.0‰、约-20.0‰、约-21.0‰、约- 22.0‰、约-23.0‰、约-24.0‰、约-25.0‰、约-26.0‰、约-27.0‰、 约-28.0‰、约-29.0‰或约-30.0‰。较佳地，delta O-18值约-4.5‰至 约-30.0‰；较佳为-4.5‰至约-25.0‰、-4.5‰至约-22.0‰、-4.5‰至 约-20.0‰、-4.5‰至约-18.0‰、-4.5‰至约-16.0‰、-4.5‰至约- 14.0‰、-4.5‰至约-12.0‰、-4.5‰至约-10.0‰；更佳为肾脏疾病为- 5.0‰至约-16.0‰、-5.0‰至约-14.0‰、-5.0‰至约-12.0‰或更佳为 肿瘤疾病为-5.0‰至约-25.0‰、-5.0‰至约-22.0‰、-5.0‰至约- 20.0‰、-5.0‰至约-18.0‰、-5.0‰至约-16.0‰、-5.0‰至约- 14.0‰、-5.0‰至约-12.0‰、-5.0‰至约-10.0‰。更佳地，delta O-18 值为约-5.0‰至约-28.0‰、-5.0‰至约-26.0‰、-5.0‰至约-25.0‰、- 5.0‰至约-20.0‰、-5.0‰至约-18.0‰、-5.0‰至约-16.0‰、-5.0‰至 约-14.0‰、-5.0‰至约-12.0‰或-5.0‰至约-10.0‰。

根据本发明，罹患肾脏疾病或肿瘤疾病的个体的delta H-2值低 于约-35‰、约-36‰、约-37‰、约-38‰、约-39‰、约-40‰、约- 42‰、约-44‰、约-48‰、约-50‰、约-55‰、约-60‰、约-65‰、 约-70‰、约-75‰、约-80‰、约-85‰、约-90‰、约-95‰或约- 100‰。较佳地，delta H-2值为约-35‰至约-100‰、约-35‰至约- 95‰、约-35‰至约-90‰、约-35‰至约-85‰、约-35‰至约-80‰、 约-35‰至约-75‰、约-35‰至约-70‰、约-35‰至约-65‰、约-35‰ 至约-60‰、约-35‰至约-55‰、约-35‰至约-50‰、约-35‰至约- 45‰、约-35‰至约-40‰、约-40‰至约-100‰、约-40‰至约-90‰、 约-40‰至约-85‰、约-40‰至约-80‰、约-40至约-75‰、约-40‰至 约-70‰或约-40‰至约-65‰。较佳地，肾脏疾病的delta H-2值为约- 40‰至约-80‰、约-40‰至约-75‰、约-40‰至约-80‰、约-40‰至 约-75‰、约-40‰至约-70‰、约-40‰至约-65‰、约-40‰至约- 60‰、约-40‰至约-55‰或约-40‰至约-50‰。较佳地，肿瘤疾病的 delta H-2值为约-45‰至约-100‰、约-45‰至约-95‰、约-45‰至约- 90‰、约-45‰至约-85‰、约-45‰至约-80‰、约-45‰至约-70‰或 约-45‰至约-60‰。

根据本发明，生物样品为体液。较佳地，体液为尿液、血液、 血清、血浆、唾液、淋巴液、脑脊髓液、囊性液(cystic fluid)、腹 水、粪便、胆汁、组织液及任何其它的分离体液。任何已知得到作 为同位素测定的水的方法均可用于本发明。根据本发明之一具体实 施例，测定同位素的水是得自将体液样品置于含干燥剂的密闭容器 使得样品中的水被干燥剂吸收以得到不含其它成份的纯水，并接着 从含水(或水合)的干燥剂去除水分。较佳地，以蒸馏自含水(或水 合)干燥剂去除水；较佳为真空蒸馏。根据本发明，干燥剂是选自硅 胶(silica gel)、活性碳、硫酸钙、氯化钙、蒙脱黏土 (montmorillonite clay)和分子筛(molecular sieve)的群组。根据本发 明的另一具体实施例，用于测定同位素的水是经逆渗透(reverse  osmosis)得到。

在另一方面，本发明是关于实施本发明的套组，该套组包括： 一包含生物样品的容器或预定充填该样品的容器，该生物样品得自 可能罹患肾脏疾病或肿瘤疾病的个体或罹患肾脏疾病或肿瘤疾病风 险的个体，一测定生物样品中delta O-18和/或delta H-2的装置，和 一参考值装置，用于诊断肾脏疾病或肿瘤疾病。较佳地，该套组另 包含含有干燥剂的容器。较佳地，该套组另包含自样品得到其中的 水的装置；例如，含干燥剂的密闭容器及蒸馏装置或逆渗透装置。

测定delta O-18和/或delta H-2的装置可选自提供/定量delta O-18 和/或delta H-2的任何适合装置；例如，同位素质谱仪(Isotope-ratio  mass spectrometry；IRMS)。

用于诊断肾脏疾病或肿瘤疾病的参考值的装置较佳选自得自含 健康个体生物样品的容器。本发明套组可进一步包含校正曲线、套 组使用说明书或其组合。较佳包含适当的说明书(如书面形式)，提 供关于诊断肾脏疾病或肿瘤疾病的使用信息。

本发明研究生物样品中氢(δ²H)和氧(δ¹⁸O)的安定同位素比例，观 察到生物样品中(如血液、血浆)的δ²H及δ¹⁸O与肾脏功能和肿瘤疾病 有关。特别是，控制组个体及糖尿病组个体(没有肾功能障碍)血浆 (blood plasma)中的δ¹⁸O较晚期肾失调个体分别高87%及160%。健康 肾组个体(即控制组个体及糖尿病组个体)血浆(blood plasma)中的δ²H 较肾失调组个体分别高72%及92%。然而，在控制组个体和糖尿病 组个体血浆中的水含量(δ²H)及氧(δ¹⁸O)则没有差异。

具体实施方式

实例

虽然已参考特定实施例描述本发明，但熟习此项技术者应了 解，在不悖离本发明的范畴的情况下可作出各种变化且可用等效物 替代其组件以适于特定情况。提供以下实验性实例以展示及进一步 说明本发明的某些实施例的各种形式且不应理解为限制其范畴。在 以下实验性揭示内容中，使用下列材料及方法：

参与者.根据针对参与者的记录的生物化学参数及医生描述， 将参与者分成三类：对照个体(CS)、诊断为末期肾脏失调(ESRD)的 患者及患有糖尿病但无可侦测的肾脏功能障碍(DB)的个体。所有DB 个体皆处于糖尿病控制下。所有48名个体(5个CS、32个ESRD及5个 DB)皆为居住在台北市的本地台湾人。其在取样日期之前至少三个 月未远足。因此，可消除由食物及水的地理同位素组成而造成的同 位素比变化(Bowen GJ,Wilkinson B(2002)Spatial distribution of  delta 0-18 in meteoric precipitation.Geology 30:315-318；Hobson  KA,Atwell L,Wassenaar LI(1999)Influence of drinking water and  diet on the stable-hydrogen isotope ratios of animal tissue,.Proc  Natl Acad Sci USA 96:8003-8006；Bowen GJ,Ehleringer JR, Chesson LA,Thompson AH,Podlesak DW等人(2009)Dietary and  physiological controls on the hydrogen and oxygen isotope ratios of  hair from  mid-20th century indigenous populations.Am J  Phys  Anthropol 139:494-504；Ches son LA,Podlesak DW,Erkkila BR, Cerling TE,Ehleringer JR(2010)Isotopic con sequences of consumer  food choice:Hydrogen and oxygen stable isotope ratios in foods from  fost food restaurants versus supermarkets.Food Chemistry 119:1250- 1256)。

水样.将3ml人类血浆样品储存于15ml法尔康管(falcon tube) 中。随后将管置放于具有15g CaCl₂颗粒(Sigma-Aldrich)的预干燥且 抽真空的圆瓶烧瓶中。随后将圆瓶烧瓶封盖且小心地密封以确保空 气中的水不会进入烧瓶中。在室温下保温烧瓶以使CaCl₂自人类血浆 样品中吸收水，持续七天。藉由真空蒸馏自水合CaCl₂获得水样(约2 ml)(Buchi Glass OvenB-585,Kugelrohr)。

测定人类血浆中的氢(δ²H)及氧(δ¹⁸O).如下进行水样中的氢 (δ²H)及氧(δ¹⁸O)之评估。通过熟知CO₂-H₂O平衡方法来分析稳定氧 同位素组成(Epstein S,Mayeda T(1953)Variation of O18 content of  waters from natural sources.Geochimica et Cosmochimica Acta 4: 213-224；Brenninkmeijer CAM,Morrison PD (1987)An automated system for isotopic equilibration of CO2 and H2O for 18O analysis of  water.Chemical Geology:Isotope Geoscience section 66:21-26)。由 VG SIRA 10同位素比质谱仪量测平衡之CO₂气体。在使用由印地安 那大学(Indiana University)生物地球化学实验室制造的锌珠将水还 原成H 2之后于VG MM602D同位素比质谱仪上测定氢同位素组成 (Coleman ML,Shepherd TJ,Durham JJ,Rouse JE,Moore GR(1982) Reduction of water with zinc for hydrogen isotope analysis. Analytical Chemistry 54:993-995)。所有同位素比结果以相对于国 际V-SMOW(维也纳标准平均海洋水(Vienna Standard Mean Ocean  Water))标准之δ表示法(‰)报导且按SLAP(标准轻南极降水(Standard  Light Antarctic Precipitation))的δ¹⁸O及δ²H分别为-55.5‰及-428‰的 标度进行校正(Gonfiantini R (1978)Standards for stable isotope  measurements in natural compounds.Nature 271:534-536)。针对实 验室标准表示为lσ的分析精确度分别优于1.3‰(对于δ²H)及0.08‰(对 于δ¹⁸O)。水样的双重复分析的平均差异分别为±1.5‰(对于δ²H)及 ±0.11‰(对于δ¹⁸O)。

数据分析.通过使用STASTISTICA 8.0(StartSoft.Inc.,Tulsa, OK)进行ANO VA及史都登氏t检验(Student's t-test)。在MATLAB R2011a(MathWorks.Inc.,Natick,MA)中进行k平均值丛聚，其将数 据分配成四个丛集的预设集(preset)。量测欧几里德距离(Euclidean  distance)以计算丛集的矩心，亦即彼丛集内数据点的平均值。进行 总共10,000次重复丛聚过程，在各轮中给出初始丛集矩心位置的新 集合。此程序传回四个丛集的最佳解答方案，其中各丛集的点-矩心 距离的总和具有最低值。

实例1使用本发明方法诊断肾脏失调

量测来自42个人类血浆的水样的氢(δ²H)及氧(δ¹⁸O)的稳定同位 素比。自以下四组参与者随机获得样品：空腹对照个体(CS， n=5)、未经血液透析处理的空腹末期肾脏失调个体(ESRD_nHD， n=5)、经血液透析处理的空腹末期肾脏失调个体(ESRD_HD，n=5)及 空腹糖尿病个体(DB，n=5)。

对照个体组(CS).

如表1中所示，CS的δ2H及δ18O的平均值为-4.76‰及-35.2‰。

表1.对照个体的血浆的同位素值。

空腹样品(CS)^h

^a.自具有健康肾脏的对照个体收集5个人类血浆样品(CS-1至 CS-5)。

^b.所有对照个体在取样的前三个月待在本地区而不旅行。

^c.血尿素氮(BUN)测试用以通过量测血液中呈尿素形式的氮的量 来评估肾脏功能。血液中尿素的正常含量为7-20mg/dL。

^d.肌酐为肌酸的代谢物。使用肌酐测试作为肾脏功能的指示 物。血液中肌酐的正常含量对于男性为0.7-1.2mg/dL，且对于女 性为0.5-1.9mg/dL[45]。

^e.估算肾小球滤过率，肾脏功能的指针。基于MDRD(肾脏失调中的膳食 修正)公式eGFR=186×血清肌酐^-1154×年龄^-0.203×(1.212(若为黑 人))×(0.742(若为女性))计算eGFR值[46]。

^f.比率以相对于国际V-SMOW(维也纳标准平均海洋水)标准的δ 表示法(‰)报导且按SLAP(标准轻南极降水)的δ¹⁸O及δ²H分别 为-55.5‰及-428‰的标度进行校正[44]。

^i.圆括号中的数字为取各组所有数字而得的标准差。

末期肾脏失调组(ESRD).

δ²H及δ¹⁸O的平均值对于ESRD_nHD为-11.89‰及-72.44‰，且 对于ESRD_HD为-10.37‰及-59.10‰(表2)。ESRD_HD(标准差对于 δ¹⁸O为2.9且对于δ²H为11.54)相比ESRD_nHD(标准差对于δ¹⁸O 为0.9且对于δ²H为4.9)较分散。就δ²H而言，ESRD_HD与 ESRD_nHD之间的差异显著[t_0.05;30=2.5且F _0.05;1,30=6.33]。然而， 对于δ¹⁸O，差异不显著[t_0.05;30=1.17且F_0.05;l,30=1.37]。

表2.末期肾脏失调(ESRD)患者的血浆的同位素值。

未经血液透析处理(ESR_nHD)^j

经血液透析处理(ESRD_HD)^k

^a.自空腹8小时的ESRD(末期肾脏失调)患者收集32个人类血浆样品，且将其分成两组：ESRD_nHD(末 期肾脏失调但未经血液透析处理)及ESRD_HD(末期肾脏失调且接受血液透析处理)。

^b.,c.,d.BUN、肌酐及eGFR测试，所有皆为肾脏功能的指示物；参见表1脚注c、d及e。

^e.血液中钠的浓度。血液中钠的正常含量为135-140mmol/L。

^f.血液中钾的浓度。正常血液钾含量为3.5-5mmol/L。

^g.血液中氯离子的浓度。血液中氯离子的正常范围为98-108mmol/L。

^h.,i.同位素比以δ表示法(‰)报导，参见表1脚注c及d中的详情。

^j.自未经血液透析处理的E S RD患者收集ESRD_nHD样品(ESRD-1至ESRD-5)。ESRD_nHD不进行单价离子 测试。

^k.自接受6个月血液透析的ESRD患者收集ESRD_HD样品(ESRD-6至ESRD-32)。恰在ESRD患者接受 血液透析之前收集此等样品。

^I.圆括号中的数字为取各组所有数字而得之标准差。

糖尿病组(D B)

在DB组中，血浆中δ²H的平均值为-4.04‰，且δ¹⁸O的平均值 为-34.08‰(表3)。

表3.糖尿病(DB)患者的血浆的同位素值

平均值      68.4   0.7(0.2)  99.46(21.46)  160.8(36.7)  -4.04  -34.08

(标准差)^g   (7.1)                                       (0.3)  (5.0)

^a.自空腹8小时的糖尿病患者收集DB血浆样品(DB-1至DB- 5)。

^b.血浆肌酐浓度，肾脏功能的指示物。

^c.估算肾小球滤过率，肾脏功能的指针。详情参见表1脚注e。

^d.空腹血糖含量。

^e.,f同位素比以δ表示法(‰)报导，参见表1脚注c及d中之详 情。

^g.圆括号中的数字为取DB的所有数字而得的标准差。

ESRD的水δ¹⁸O及δ²H值明显低于CS之δ¹⁸O及δ²H值。

ESRD_nHD的血浆中的水δ¹⁸O及δ²H的值显示与CS的δ¹⁸O及 δ²H的值不同的特征。通过将史都登氏t检验及ANOVA统计分析 应用于ESRD_nHD及CS数据集，ESRD_nHD及CS中的血浆的水含量 (δ¹⁸O及δ²H)显示显著差异[对于δ¹⁸O，t_0.05;8=13.78且F_0.05;1,8=189.83；对于δ²H，t_0.05;8=15.08且F_0.05;1,8=227.47]。E S RD_HD的血 浆中的δ¹⁸O及δ²H分布分散于CS与ESRD_nHD之间。ESRD_HD的血 浆水中的δ¹⁸O及δ²H亦显著低于CS的δ¹⁸O及δ²H。ESRD (包括 ESRD_nHD及ESRD_HD)的血浆中的δ¹⁸O及δ²H比CS低87%及 72%，且比DB低160%及92%。因此，在本研究中血浆中的δ¹⁸O 及δ²H之值与肾脏功能相关联。ESRD患者的血浆中之水¹⁸O及²H 之较低含量令人感兴趣，此系因为正常对照个体与肾脏患者共享 相同来源之饮用水及膳食水。

似乎在具有肾脏功能障碍的患者中²H及¹⁸O同位素自血浆水中 选择性地「移除」。肾脏的许多功能之一为水的再吸收，现已知其 至少部分由不同类型的肾脏水通道蛋白(aquaporin，AQP)(一种形 成水通道的质膜蛋白)介导(Nielsen S,Frokiaer J,Marples D,Kwon  TH,Agre P等人(2002)Aquaporins in the kidney:from molecules  to medicine.Physiological Reviews 82:205-244；King LS,Kozono  D,Agre P(2004)From structure to disease:The evolving tale of  aquaporin biology.Nature Reviews Molecular Cell Biology 5:687- 698；Borgnia M,Nielsen S,Engel A,Agre P(1999)Cellular and  molecular biology of the aquaporin water channels.Annual Review  of Biochemistry 68:425-458)。举例而言，水通道蛋白1(AQP1)位 于近端小管及增加透水性之下降细支处(Nielsen S,Smith BL, Christensen EI,Knepper MA,Agre P(1993)CHIP28 water channels  are localized in constitutively water-permeable segments of the  nephron.The Journal of cell biology 120:371-383)。AQP2、AQP3 及AQP4位于集合管处，其中AQP2为集合管处透水性的升压素调 控标靶(Nielsen S,Knepper MA(1993)Vasopressin activates  collecting duct urea transporters and water channels by distinct  physical processes.The American journal of physiology 265:F204- 213)。自然地产生如下问题：这些水信道蛋白是否涉及肾脏功能障 碍患者的血浆中的¹⁸O及²H的较低含量。在现有研究中，原型 AQP1的分子动力学(MD)仿真及溶液实验显示²H₂O的渗透性类似 于水的渗透性(Mamonov AB,Coalson RD,Zeidel ML,Mathai JC  (2007)Water and deuterium oxide perm eability through aquaporin1: MD predictions and experimental verification.The Journal of  general physiology 130:111-116)，而另一研究显示AQP1的芳族物 /精胺酸区域中的点突变使得质子可通过其(BeitzE,Wu B,Holm LM, Schultz JE,Zeuthen T(2006)Point mutations in the  aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea, glycerol,ammonia,and protons.Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America 103:269- 274)。此外，在ESRD患者中，发现升压素的浓度较高(Argent NB, Baylis PH,Wilkinson R(1990)Immunoreactive vasopressin in end  stage renal failure.Clinica chimica acta;international journal of  clinical chemistry 190:185-188)。升压素及水分剥夺伴随肾脏集合 管中之AQP2上调(Terris J,Ecelbarger CA,Nielsen S,Knepper MA  (1996)Long-term regulation of four renal aquaporins in rats.The  American journal of physiology 271:F414-422；Combet S,Gouraud  S,Gobin R,Berthonaud V,Geelen G等人(2008)Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is  posttranscriptional and is abolished by water deprivation.American  Journal of Physiology-Renal Physiology 294:F1408-F1414)，且老 龄化过程中AQP2之下调为转录后的(Combet S,Gouraud S,Gobin  R,Berthonaud V,Geelen G 等人(2008)Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is  posttranscriptional and is abolished by water deprivation.American  Journal of Physiology-Renal Physiology 294:F1408-F1414)。对 ESRD_HD的血浆中的单价离子(诸如Na⁺、K⁺及Cl^-)的含量的进一步 研究揭示，亨利氏环(loop of Henle)的上升支的主动输送的正常功 能化(表2)，而肾元的此部分不含水通道蛋白(Nielsen S,Frokiaer J, Marples D,Kwon TH,Agre P等人(2002)Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine.Physiological Reviews 82:205-244； King LS,Kozono D,Agre P(2004)From structure to disease:The  evolving tale of aquaporin biology.Nature Reviews Molecular Cell  Biology 5:687-698)。因此，在系统分辨率与原子分辨率下研究 ESRD的水通道蛋白在稳定同位素中的生理作用可阐明肾脏功能障 碍患者中的低重水。

血浆的¹⁸O及²H的动态平衡抵抗水源的¹⁸O及²H含量的波 动。

降雨的δ²H及δ¹⁸O值季节性地波动。因为血浆中的大部分水²H 及¹⁸O最终将来自降雨-饮用水及膳食水的来源，所以令人感兴趣 的是检查雨水与血浆水中的δ²H及δ¹⁸O值之间的关系。

比较数据的δ²H及δ¹⁸O值与台北自2000年至2010年每月降水 的δ²H及δ¹⁸O值(Peng T-R,Wang C-H,Huang C-C,Fei L-Y,Chen  C-TA 等人(2010)Stable isotopic characteristic of Taiwan's precipitation:A case study of western Pacific monsoon region. Earth and Planetary Science Letters 289:357-366)。1月至5月， 雨水的δ²H及δ¹⁸O值显示极小变化。此等值在6月开始下降，在 7月及8月达至最小，且自9月至12月回升。另一方面，C S组中 的血浆水同位素比始终低于1月至5月的降雨的同位素比。然 而，血浆水的同位素比在7月至12月的降雨的标准误差内。因 此，观测到CS组的血浆中的同位素δ²H及δ¹⁸O的动态平衡对抗 每日摄入水的波动。

归因于7月台湾常见的台风，降雨的同位素含量最小，但在所 有其它月份中变化极大。7月及3月的ESRD_HD的血浆水的同位素 比显著低于降水的同位素比，再次表明雨水的较强独立性。虽然9 月的降水的同位素比接近于CS的同位素比，但在ESRD_nHD中仍观 测到相同样式，比降水的同位素比低约35%。对于DB组，血浆水 的δ¹⁸O可与12月的降雨的δ¹⁸O相当[t_0.05;14=0.27且F_0.05;1,14=0.07]，但血浆水的δ²H显示降雨的独立性[t_0.05;14=3.03且F_0.05;1,14=9.21]。

DB及CS组中的水δ¹⁸O及δ²H值类似。

来自DB的δ¹⁸O及δ²H的值类似于CS的δ¹⁸O及δ²H的值。 ANOVA分析表明DB及CS的血浆水含量(δ¹⁸O及δ²H)相当[对于 δ18O，F0.05;1,8=4.63；对于δ2H，F0.05;1,8=0.20]。

似乎存在反映差异性肾脏状况的水同位素的生物动态平衡的微 调。举例而言，ESRD_nHD及正常肾脏组(CS及DB)具有不同动态平 衡水平。应注意，具有正常肾脏功能的三组(表1及表3)，CS及 DB的δ¹⁸O及δ²H含量类似。另外，我们注意到，CS个体的年龄 (范围自27至67岁)独立于DB及ESRD个体(p=0)。ESRD_HD组中 ¹⁸O及²H动态平衡的缺乏可归因于各血液透析的时间及持续时间 以及不同ESRD_HD个体的水合状态(Konings CJ,Kooman JP, Schonck M,Cox-Reijven PL,van Kreel B等人(2002)Assessment of  fluid status in peritoneal dialysis patients.Perit Dial Int 22:683- 692)。

肾脏功能障碍的原因通常极其复杂，包括药物、糖尿病、高血 压、败血症、个人生活方式等等。尽管如此，肾脏受损引起代谢 物积聚，其导致²H替代¹H且¹⁸O替代¹⁶O。此最终导致血浆的低 同位素。在本研究中，我们表明肾脏功能障碍与人类血浆中大大 减小的δ¹⁸O及δ²H相关。观测到血浆的低同位素的特性在肾脏功 能障碍患者中显现，但在健康个人或糖尿病患者中不会显现。数 据及结果表明，血浆的δ¹⁸O及δ²H对肾脏功能敏感但似乎对年 龄、种族及膳食不敏感，此可能归因于生物同位素动态平衡。总 之，此初步研究连同生物数据一起表明使用血浆中的δ¹⁸O及δ²H 的含量作为肾脏功能障碍的潜在标记的可能性。