一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法

摘要

本发明涉及一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法，该方法包括如下步骤：(1)提取样品微生物的DNA；(2)分别采用序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对2，及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序；(4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息。本发明用特异性引物扩增样品中的微生物DNA，结合测序的方法获得样品中具有厌氧条件下烃降解功能的微生物的信息。本发明的检测特异性强，操作便捷，检测准确、全面，克服了依赖培养及计数的传统检测方法所存在的各种缺陷。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测鉴定技术领域，尤其是涉及一种检测具有厌氧 条件下降解烃功能微生物的方法。

背景技术

油藏是一个典型的厌氧环境，其中蕴含大量的石油烃并孕育功能多样 的微生物。在这个巨大的地质生物反应器中，普遍存在可在厌氧条件下降 解烃类的微生物。原油两大组份是由芳香烃、烷烃和沥青质组成，多数烃 类溶解性差，化学性质较为稳定不易降解。芳香烃中，苯、甲苯、乙苯、 二甲苯（BTEX化合物）是强污染物，因而备受关注。但是，烷烃中也有 一些是有毒的，所以研究厌氧降解烷烃的微生物同样具有重要意义。研究 表明，具有厌氧降解烷烃功能的微生物主要有硝酸盐还原菌、硫酸盐还原 菌及产甲烷菌群。厌氧条件下微生物降解烃有利于提高原油采收率，是目 前国内外研究的热点。这项研究在油藏残余油生物气化开采和石油污染生 物修复方面具有重大的理论意义和应用价值。

在分析检测烃降解微生物方面，传统技术主要包括以下3种方法：

(1)液体筛选培养方法—采用以烃为唯一碳源的选择性培养基培养 待检测样品，经反复培养，优胜劣汰，最后获得能够降解烃的微生物，然 后用镜检法和比浊法测定培养物中的菌量；(2)固体培养方法—用含有 烃、氮和磷等营养物质的固体培养基筛选分离烃降解菌，同时可以结合平 板菌落计数法和最大概率数法（MPN法）测菌数。(3)细菌瓶法—与 MPN法的基本原理和方法相同，利用烃降解产物的反应现象指示微生物生 长。

上述3种方法中，细菌瓶法目前应用较多，但是这3种方法都如下缺 陷：检测不全面，较适合于好氧菌检测、而用于厌氧菌检测时难度非常大； 对于丰度低的微生物，可能因为培养条件不适逐渐被淘汰而造成漏检；检 测周期长、消耗大，对于生理特性不同的微生物必须分别采用不同培养条 件检测，因而工作量大；检测镜检法、比浊度法、MPN和细菌瓶法均不能 得到烃降解菌的分类信息。此外，环境样品中（如油藏）发育着丰富多样 的微生物，绝大多数具有降解烃功能，但其中多数微生物属于不可培养的， 由于传统方法依赖于培养，因此采用传统方法无法认知这些微生物，导致 了这类微生物的群落结构与功能认识上的一个盲区。

本发明用特异性引物扩增样品中的微生物DNA，结合测序的方法获得 样品中具有烃降解功能的微生物的信息。本发明的检测特异性强，操作便 捷，检测准确、全面，克服了依赖培养及计数的传统检测方法所存在的各 种缺陷。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种针 对性强、操作简便、检测全面准确的快速检测样品中具有厌氧条件下降解 烃功能的微生物的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。

本发明提供一种检测具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的方法，该 方法包括如下步骤：

(1)提取样品微生物的DNA；

(2)分别采用序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对1、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对2，及SEQ ID NO:5和SEQ ID  NO:6所示引物对3对样品微生物的DNA进行PCR扩增：

(3)将PCR扩增产物连接转化至感受态细胞并测序；

(4)分析序列，得到样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信 息。

本发明的方法中，步骤（2）采用的引物对具体为：

引物对1

正向：CCNACCACNAAGCAYGG（SEQ ID NO:1），

反向：TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC（SEQ ID NO:2）；

引物对2

正向：TCGAYGAYGGSTGCATGGA（SEQ ID NO:3），

反向：TTCTGGTTYTTCTGCAC（SEQ ID NO:4）；

引物对3

正向：GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT（SEQ ID  NO:5），

反向：CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA（SEQ ID NO:6）。

分别采用上述各引物对对样品微生物的DNA进行PCR扩增的反应体 系组成为无菌水12μL、2×Taq PCR master mix9μL、浓度为12.5μmol·L^-1的引物对的正向和反向引物各1μL、样品微生物的DNA2μL。所述样品微 生物的DNA浓度调整在50ng·μL^-1左右。

采用上述引物对对样品微生物的DNA进行PCR扩增的反应程序为： a)94°C保温5min；b)94°C保温45s；c)60°C保温1min；d)72°C保 温1min；e)重复执行b）~d）48次；f)72°C保温10min后结束。

附图的简要说明

图1是PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。这些实施例只是用于说 明本发明，并不构成对本发明范围的限制。

实施例

华北某油田采油井产出液样品（S1、S2、S3、S4）中具有厌氧条件下 降解烃功能的微生物的检测

1．提取样品中微生物的DNA

采用Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen Biosciences,Inc.， 美国），按照说明书描述的方法提取华北油田采油井产出液样品微生物的 DNA。

2．分别采用引物对1（正向：CCNACCACNAAGCAYGG，反向： TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC）、引物对2（正向： TCGAYGAYGGSTGCATGGA，反向：TTCTGGTTYTTCTGCAC）及引物 对3（正向：GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT，反向： CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA）对样品微生物的DNA进行PCR 扩增。

1）PCR扩增反应体系

利用引物对1、引物对2和引物对3对样品微生物DNA分别进行PCR 扩增，PCR扩增反应体系组成相同，包括12μL无菌水，9μL2×Taq PCR master mix和浓度为12.5μmol·L^-1的引物对的正反向引物各1μL，最后加 入提取的样品中微生物的DNA2μL。

2）PCR扩增反应程序

利用引物对1、引物对2和引物对3进行样品微生物DNA扩增的PCR 反应程序相同：a)94°C保温5min；b)94°C保温45s；c)60°C保温1min； d)72°C保温1min；e)重复执行b）~d）48次；f)72°C保温10min后结 束。

3)PCR扩增反应结束后，取5μL PCR产物,用1.0%的琼脂糖凝胶 进行电泳鉴定、拍照。结果见图1。

3．扩增产物连接转化至感受态细胞并测序

采用Axygen胶回收纯化试剂盒（Axygen Biosciences,Inc.，美国），按 说明书描述的方法提取扩增所得目的基因。采用Takara公司的Simple载体试剂盒，按说明书描述的方法将提取得到的目的基因连接转化 至大肠杆菌感受态细胞中，培养连接转化后的细胞，然后将培养所得细胞 送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1）引物对1扩增S1样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A11（SEQ ID NO:7）：

TCGGCCACGGCCAACTGCGCCAAGATGGTGGAATACGCTCTTCT

AAACGGCTACGACCCGGTTGTTCAGATGCAGATGGGGCCAAAG

ACCGGCGATTCCGCCAAGTTCACGGACTTCGAGCAGCTTTTCGC

CGCGTGGGTGACCCAGATGGAATGGCTGACGAACACCCTGGTG

CGCACGGTGAACCTTGGCCGGTACAAGGACCCGGAATTCTACG

GCAGGCCCTTCCTCTCGGCCACATACGAGCGGGCGGTTGAATCG

GGCCTGGATGCGGTAAGCCCGGTGGGTGATCGCGGCAACTGCT

GGATAACCGGTTTCACATGGGTTGAAAACATAGACAGCCTGGCT

GCGGTTAAAAAGCTTGTTTTCGACGACAAAAAATACACCATGA

GCGAACTTCTGGAAGCCCTTCGCACCAACTGGGACGGCCGCGA

GCAGATGAGGCTCGATTTCGTGAATGCCCCCAAATGGGGCAAC

GACG

2）引物对2扩增S3样品,扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A23（SEQ ID NO:8）：

ATGGAACTTGGCCGGGACGCCTGTGAGCTTTCCGAGCAGCCCA

ACGGCTGGCATAATCCGATTACAACCGTTGTGGCGGCCAATTCC

CTGGTGGCTATCAAAAAACTGATTTATGATGATAAAAAGTACAC

CATGGGCCAGCTCATGAATGCCCTGAGGGCAAACTGGGAAGGC

TATGAAGAAATGCAGAAGGACTTTAAAAACGCTCCCAAGTGGG

GCAATGACGATGAATATTGCGACGCAATAATCAAGGCCTTTTATG

AGGATATCATCGGAGGAGAAATGAGCAAGATTACCAACTATTCG

GGAGGTCCGGTGCTTCCGGTGGGACAGGGTGTCGGGCTGTATAT

GGAAGTCGGATCGCGGACCGGCCCGACCCCTGACGGTCGATTC

GGAGGGGAAGCGGCAGATGACGGCGGGATTTCTCCTTATATGGG

TACGGACCATAAAGGGCCGACCGCGGTGCTGAGATCGGTATCA

AACGTGCAGAAAAACCAG

3）引物对3扩增S2样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A32（SEQ ID NO:9）：

GAAGGGCGTCATCGCCGGCTTCCAGCGCGCATCAAGCGACCG

CAAGATCGTCGCCGCGGTGTTTACCGGCGTCGGCGACAAGGCC

TTCTGCACCGGTGGCAACACCGCCGAGTACGCCGTCTACTACTC

GCGCCGGCCCAATGAATACGGCGAGTACATGGACCTCTTCAACG

CCATGGTCGACGGCATCCTCAACTGCAAGAAGCCGGTGATCTGC

CGCGTGAACGGCATGCGCGTCGCCGGCGGCCAGGAGATCGGCA

TGGCCACCGACATCACCGTCACCTCCGACCTCGCCGTGC

4）引物对3扩增S3样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A33（SEQ ID NO:10）：

CAAAGGCGTGATCCTCGCCTTCCGTGAGGCGAGCGCAGCGCGC

GACGTCGTCGCAGTGGTGTTTACCGGTGCCGGCGACAAGGCCTT

CTGCACCGGCGGAAATACCAAGGAATACGCCGAATATTACGCCG

GCAATCCGCAGGAATATCGCGGCTATATGCGGCTGTTCAACGACA

TGGTGTCAGCCATCCTGGGCTGCGACAAGCCCGTGATCTGCCGG

GTCAACGGCATGCGCATCGGCGGCGGCCAGGAAATCGGCATGG

CCTGCGATTTCACGATCGCGCAGGATCTGGCGCGC

5）引物对3扩增S4样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A34（SEQ ID NO:11）：

ATGGAGCTCTTCAACAACATGGTCGACTCCATCCTCACGTGCAA

GAAGCCCGTCATCTGCCGGGTGAACGGCATGAGGGTCGCCGGC

GGGCAGGAAATCGGCCTGGCGTGCGACATCGCTATCGCCTCCG

ACCTCGCCATC

4．序列分析

将所得序列结果在美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的基于 序列相似性的数据库搜索程序blast（http://blast.ncbi.com）上比对分析，得 到检测样品中具有厌氧条件下降解烃功能的微生物的信息如下：

1）引物对1扩增S1样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A11。经序列比对分析，序列A11在蛋白质水平与 Desulfatibacillum alkenivorans AK-01相似度83%，该菌是可以在厌氧条件 下降解烷烃的微生物。S1样品检测该菌克隆数为23，总克隆数为23（见 表1），表明S1样品中在厌氧条件下降解烷烃的微生物全部为该类菌。

采用引物对1扩增S3样品和S4样品，扩增产物代表序列的测序结果 同S1样品。对于S3样品，检测到该类菌的克隆数为24，总克隆数为26 （见表1），计算S3样品中在厌氧条件下降解烷烃的微生物中该类菌相对 丰度为92.3%。对于S4样品，检测到该类菌克隆数为28，总克隆数为28 （见表1），计算S4样品在厌氧条件下降解烷烃的微生物全部为该类菌。

2）引物对2扩增S3样品,扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A23。经序列比对分析，上述序列在蛋白质水平与 Desulfobacula toluolica相似度81%，表明油藏环境中存在可以在厌氧条件 下降解芳香烃的微生物。S3样品检测，该类菌克隆数为30，总克隆数为 30（见表1），表明S3样品中在厌氧条件下降解芳香烃的微生物中全部为 该类菌。

采用引物对2扩增S4样品,扩增产物代表序列的测序结果同S3样品， S4样品检测该类菌克隆数为25，总克隆数为25（见表1），表明S4样品 中在厌氧条件下降解芳香烃的微生物全部为该类菌。

3）引物对3扩增S2样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A32。经序列比对分析，上述序列在蛋白质水平与 Azoarcus toluvorans相似度87%，表明油藏环境中存在可以在厌氧条件下 降解芳香烃的微生物。S2样品检测该类菌克隆数为14，总克隆数为26（见 表1），表明S2样品中在厌氧条件下降解芳香烃的微生物中该类菌的相对 丰度为53.8%。

4）引物对3扩增S3样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A33。经序列比对分析，上述序列在蛋白质水平与Thauera  chlorobenzoica相似度90%，表明油藏环境中存在可以在厌氧条件下降解芳 香烃的微生物。S3样品检测该类菌克隆数为8，总克隆数为21（见表1）， 计算S3样品中在厌氧条件下降解芳香烃的微生物中该类菌的相对丰度为 38.1%。

5）引物对3扩增S4样品，扩增产物连接转化至大肠杆菌感受态细胞 后测序，代表序列A34。经序列比对分析，上述序列在蛋白质水平与 Desulfobacterium aniline DSM4660相似度87%,S4样品检测该类菌克隆数 为15，总克隆数为27（见表1），计算S4样品中在厌氧条件下降解芳香烃 的微生物中该类菌的相对丰度为55.6%。

表1厌氧烃降解基因文库克隆数

（注：“ND”表示未检测到）