金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法

摘要

本发明涉及金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法。本发明检测过氧化氢的方法包括以金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)和过氧化氢水溶液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量。本发明检测葡萄糖或胆固醇的方法包括：以葡萄糖氧化酶或胆固醇氧化酶为催化剂使葡萄糖或胆固醇氧化生成过氧化氢，然后再检测生成的过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖或胆固醇的含量。本发明的方法简单、经济、环保且高效。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域。具体而言，本发明涉及金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液用作催化剂的用途以及一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液直接检测过氧化氢或通过检测中间产物过氧化氢间接检测其他物质的方法。更具体地，本发明提供水溶性葡萄糖和脂溶性胆固醇的检测方法。 

背景技术

因高效率和高选择性的催化活性，天然酶在生物化学领域扮演着重要角色。但天然酶在储存、运输和使用过程中容易受到外在物理、化学因素的影响，如温度、pH值等，而变性失活。此外，天然酶的价格相对昂贵且制备纯化繁琐。这些缺点限制了它的应用范围。因此，开发具有酶特征活性、结构比天然酶更稳定的模拟酶在化学工业、农业和生物医药领域也是极其重要的。 

近年来，研究人员发现在体相中呈现化学惰性的金属化合物在纳米尺度下表现出新颖的类过氧化物酶活性。这些纳米颗粒在不同pH和不同温度下表现出比辣根过氧化物酶更加稳定的催化特征，是一类新型模拟酶。中国科学院生物物理研究所阎锡蕴研究小组发现四氧化三铁纳米颗粒具有类过氧化物酶催化活性；并利用这一特性，设计了两种免疫检测方法，实现了对乙肝病毒表面抗原和肌钙蛋白的检测(L.Z.Gao，J.Zhuang，L.Nie，J.B.Zhang，Y.Zhang，N.Gu，T.Wang，J.Feng，D.L.Yang，S.Perrett，X.Y.Yan，Nature Nanotechnology，2007，2，577-583)。随后，汪尔康等人利用四氧化三铁纳米颗粒类过氧化物酶特性，实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测(H.Wei，E.K.Wang，Anal.Chem.2008，80，2250-2254)。之后，氧化石墨烯也被发现具有类过氧化物酶特性，并成功用于模型体系葡萄糖的检测。与上述纳米颗粒不同的是，我们最近的研究工作表明，贵金属纳米颗粒(如铂)具有类过氧化物酶和氧化酶双重活性。与其他只具有单一类酶活性的纳米颗粒 相比，双功能活性的模拟酶具有更多的优势。(W.W.He，Y.liu，J.S.Yuan，J.J.Yin，X.C.Wu，X.N.Hu，K.Zhang，J.B.Liu，C.Y.Chen，Y.L.Ji，Y.T.Guo，Biomaterials.2011，32，1139-1147)通常，对于具体的测试样品，如血液中，还存在有其他还原性的干扰物质，如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，它们可消耗H₂O₂，将其还原为H₂O，这样就会影响下一步的显色反应，使实际测得的吸光度下降，致使结果偏低。而金核/铂壳纳米结构类氧化酶活性可以用来预处理待测试样本，从而显著降低样本中还原性物质的干扰(见实施例)。因此，与其他类过氧化物酶活性的纳米颗粒相比，本发明利用金核/铂壳纳米结构的双功能酶特性，可预先消除还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，提供了一种抗还原性物质干扰的检测方法。 

对类过氧化物酶活性，底物之一是过氧化氢，因而可以用来直接检测过氧化氢。此外，许多生化反应的中间产物涉及到过氧化氢，因而可以通过检测过氧化氢间接检测其他物质，从而搭建一个基于与过氧化氢产生相关的其它物质的检测平台。在本专利中，我们以水溶性葡萄糖和脂溶性胆固醇作为两类典型的检测实例。葡萄糖是动、植物体内的主要组成部分，葡萄糖浓度的测定在食品分析质量监控、生物化学和临床化学中都占有很重要的地位。胆固醇是体内其它所有类固醇的前体，例如糖皮质类固醇、性激素、胆汁酸和维生素D，血液中胆固醇的含量是用于诊断冠心病、动脉硬化、脑血栓和其他多种疾病的重要参数。葡萄糖和胆固醇在其特定氧化酶的作用下产生过氧化氢，从而可以通过两步反应实现其特异性检测。目前常用的检测葡萄糖或胆固醇法的方法之一是基于葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)或胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，CHOD)的特异性催化氧化反应结合过氧化物酶(peroxidase，POD)催化氧化显色底物的方法。首先利用GOD催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸或CHOD催化胆固醇氧化成胆甾-4-烯-3-酮，同时产生H₂O₂，H₂O₂在过氧化物酶催化下氧化无色的还原型色原生成有色的氧化型色素，然后根据氧化型色素在特定波长的吸光度求出样品中葡萄糖或胆固醇的含量。但天然酶对热敏感、稳定性差、来源有限以及受催化条件局限等缺点限制了它们的广泛应用。 

发明内容

本发明利用金核/铂壳纳米棒模拟酶，避免了非水溶剂对天然酶活性的影响，实现了对非水溶性的物质一胆固醇的检测，并得到了与水溶性物质相同的 线性检测区间。 

本发明的一个目的是，提供金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催化剂的用途。 

本发明的另一个目的是，提供基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢的方法，该方法可用于过氧化氢的比色检测，从5×10^-5到1×10^-3mol/L浓度范围内对过氧化氢检测呈现好的线性响应。 

本发明的再一目的是，提供基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的方法，该方法可实现抗维生素C干扰的葡萄糖的灵敏、特异检测，该方法对于葡萄糖比色检测的线性响应范围为5×10^-5到4×10^-4mol/L。 

本发明的再一目的是，提供基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液并结合胆固醇氧化酶来比色检测胆固醇的方法，该方法可完成胆固醇的灵敏、特异检测，该方法对于胆固醇比色检测的线性响应范围为3×10^-5到3×10^-4mol/L。 

在本说明书中，术语“类过氧化物酶”指显示出过氧化物酶的催化活性的物质。具体地，本发明的类过氧化物酶催化氧化还原反应，并以过氧化物作为电子受体，从而氧化底物。 

在本说明书中，术语“类氧化酶”指显示出氧化酶的催化活性的物质。具体地，本发明的类氧化酶催化氧化还原反应，并以分子氧作为电子受体，氧化底物。 

在本说明书中，术语“ABTS”是化合物“2，2′一联氮一双(3一乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐”的缩写名称，但二者互换地使用。 

本发明的技术方案如下： 

本发明提供金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催化剂的用途。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法，该方法包括：以金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)和过氧化氢水溶液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量。 

优选地，所述金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为0.033～0.133nM，优选为0.033nM。 

优选地，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为1mM～3.3mM，优选为3.3mM。 

优选地，所述反应是在pH值为3.5～6.5，优选为4.5，反应温度为 30℃～70℃，优选为37℃，反应时间为10～60分钟，优选为30分钟的条件下进行的。 

优选地，检测的过氧化氢含量的线性范围是5×10^-5～1×10^-3mol/L，优选为5×10^-5～6×10^-4mol/L。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液抗维生素C干扰测定葡萄糖的方法，该方法包括：以葡萄糖氧化酶为催化剂使葡萄糖氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖的含量。 

优选地，检测的葡萄糖含量的线性范围是5×10^-5～4×10^-4mol/L。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液测定胆固醇的方法，该方法包括：以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定胆固醇的含量。 

优选地，检测的胆固醇含量的线性范围是3×10^-5～3×10^-4mol/L 

以下将对本发明进行详细描述。 

本发明提供金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液作为类过氧化物酶或类氧化酶用作催化剂的用途。 

本发明的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液含有一种由圆柱状金纳米棒内核和包覆于所述圆柱状金纳米棒内核外表面的岛状多孔铂壳层构成的金核/铂壳结构。 

所述的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的制备方法可以包括如下步骤： 

1)制备金晶种溶液 

向十六烷基三甲基溴化铵水溶液加入四氯金酸水溶液，然后在搅拌的条件下再加入硼氢化钠水溶液，制得第一混合溶液； 

所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸和硼氢化钠的质量配比为0.75∶0.0025∶0.006；继续搅拌第一混合溶液3分钟，然后静置2～5小时，得到含金晶种的金晶种溶液，该金晶种溶液中金浓度为0.25mM； 

2)制备金纳米棒溶液 

向十六烷基三甲基溴化铵水溶液中依次加入四氯金酸水溶液、硝酸银水溶液和硫酸水溶液；混合均匀后再加入抗坏血酸水溶液，然后向其中加入步骤(1)制备的金晶种溶液，制得第二混合液；再将所述第二混合溶液置入30℃恒温水浴中水浴12～16小时，得到含金纳米棒的金纳米棒溶液； 

所述第二混合液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸、硝酸银、硫酸、 抗坏血酸与金晶种的质量配比为5∶0.025∶0.0025～0.0075∶0.5∶0.04∶0.000015； 

3)制备纯化的金纳米棒溶液 

将步骤2)制备的金纳米棒溶液经离心分离，得到纯化的金纳米棒溶液，并通过加入去离子水，控制纯化的金纳米棒溶液中金纳米棒的浓度为0.5mM； 

4)制备金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液 

将步骤3)得到的纯化的金纳米棒溶液与四氯亚铂酸钾溶液混合并摇匀，再加入抗坏血酸水溶液得第三混合溶液；所述第三混合溶液中的抗坏血酸、四氯亚铂酸钾与金纳米棒的质量配比为5～20∶1∶3～10； 

将上述混合均匀的第三混合溶液置入30℃的恒温水浴中反应2～3小时，溶液由枣红色变成了暗灰色；之后再向第三溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，并使加入十六烷基三甲基溴化铵后的溶液中的十六烷基三甲基溴化铵浓度为0.03M；然后再进行离心分离，得到金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液； 

5)金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的改性 

将步骤4)得到的金核/铂壳纳米棒模拟溶液在每分钟12000转的转速下离心分离5分钟，弃去上清液，向沉淀中加入与上清液等体积的改性溶液，所述改性溶液由浓度为1mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液和浓度为3.0mM的氯化钠溶液组成的混合液；再将所述混合液进行超声10～25分钟，然后静置3～10小时，得到改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液； 

6)改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的纯化 

将步骤5)制得的改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液，在每分钟12000转的转速下离心分离5分钟，弃去离心分离后的上清液，加入与上清液等体积的去离子水，分散均匀，得到经纯化的改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液。 

所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.1M；所述四氯金酸水溶液的浓度为24.7mM；所述硼氢化钠水溶液的浓度为0.01M；所述硝酸银水溶液的浓度为10mM；所述硫酸水溶液的浓度为0.5M；所述抗坏血酸水溶液的浓度为0.1M；所述四氯亚铂酸钾的浓度为2.0mM。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法，该方法包括：以金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)或2，2′一联氮一双(3一乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和 过氧化氢水溶液反应，产生有色或发光物质，测定生成的有色或发光物质，以确定过氧化氢的含量。 

优选地，所述金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为0.033～0.133nM，优选为0.033nM。 

优选地，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为1mM～3.3mM，优选为3.3mM。 

优选地，所述反应是在pH值为3.5～6.5，优选为4.5，反应温度为30℃～70℃，优选为37℃，反应时间为10～60分钟，优选为30分钟的条件下进行的。 

优选地，检测的过氧化氢含量的线性范围是5×10^-51×10^-3mol/L，优选为5×10^-5～6×10^-4mol/L。 

该检测方法的反应原理如下： 

在本发明的一个实施方案中，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的步骤如下： 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺(OPD)、金核铂壳纳米棒模拟酶溶液和过氧化氢水溶液，并使邻苯二胺的浓度为3.3mM，金核铂壳纳米棒模拟酶的浓度为0.033nM；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹；只改变加入过氧化氢水溶液的浓度为0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，4，5，10，50，100，1000mM； 

(2)将步骤(1)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(3)取100μl终止液(10M H₂SO₄和0.5M Na₂SO₃)加入到步骤(2)中所得混合液； 

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液测定葡萄糖的方法，该方法包括：以葡萄糖氧化酶为催化剂使葡萄糖氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定葡萄糖的含量。 

优选地，检测的葡萄糖含量的线性范围是5×10^-5～4×10^-4mol/L。 

该检测方法的反应原理如下： 

在本发明的一个实施方案中，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的步骤如下： 

(1)取500ml 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，向其中加入20μl 10mg/mL的葡萄糖氧化酶和待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液，然后将上述溶液混合均匀，于37℃反应30分钟，得到葡萄糖反应液；所述混合溶液中只改变加入葡萄糖磷酸缓冲溶液的浓度为0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2mM； 

(2)取2.4ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次加入邻苯二胺(OPD)、金核铂壳纳米棒模拟酶溶液，并使邻苯二胺的浓度为3.3mM，金核铂壳纳米棒模拟酶的浓度为0.033nM，以及上述步骤(1)的葡萄糖反应液中；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹； 

(3)将步骤(2)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(4)取100μl终止液(10M H₂SO₄和0.5M Na₂SO₃)加入到步骤(2)中所得混合液； 

(5)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

本发明还提供一种基于金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液测定胆固醇的方法，该方法包括：以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇氧化生成过氧化氢，然后根据以上所述的方法来测定过氧化氢的含量，从而确定胆固醇的含量。 

优选地，检测的胆固醇含量的线性范围是3×10^-5～3×10^-4mol/L。 

该检测方法的反应原理如下： 

在本发明的一个实施方案中，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合胆固醇氧化酶来比色检测胆固醇的步骤如下： 

(1)将0.0386g胆固醇溶解在1ml异丙醇，0.5ml曲拉通-x 100以及8.5ml 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中的混合液中，在60℃的水浴中加热溶解。 

(2)取500μl 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，向其中加入20μl 10U/mL的胆固醇氧化酶和待测的胆固醇磷酸缓冲溶液，然后将上述溶液混合均匀，于37℃反应30分钟，得到胆固醇反应液；所述混合溶液中只改变加入胆固醇磷酸缓冲溶液的浓度为0，0.03，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4，0.5mM； 

(3)取2.4ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次加入邻苯二胺(OPD)、金核铂壳纳米棒模拟酶溶液，并使邻苯二胺的浓度为3.3mM，金核铂壳纳米棒模拟酶的浓度为0.033nM，以及上述步骤(1)的胆固醇反应液中；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹； 

(4)将步骤(2)中所得混合液在37℃水浴中反应60分钟； 

(5)取100μl终止液(10M H₂SO₄和0.5M Na₂SO₃)加入到步骤(2)中所得混合液； 

(6)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果： 

本发明制备的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液具有类过氧化物酶和类氧化酶的催化功能，可作为一种新颖的过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶；可代替过氧化物酶和氧化酶在免疫分析、生物检测和临床诊断等中应用；此外，本发明制备的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液可用于过氧化氢的比色检测，对过氧化氢检测有好的灵敏度； 

本发明制备的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液结合葡萄糖氧化酶氧化酶，可用于葡萄糖的比色检测，同时利用金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的类氧化酶的催化功能，可消除还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，从而对葡萄糖检测有好的选择性和灵敏度。 

本发明制备的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液结合胆固醇氧化酶氧化胆固醇，可以用于非水溶性的胆固醇的比色检测，得到了与水溶性物质相同的线性检测区间。 

本发明利用金核/铂壳纳米结构的类过氧化酶的特征，提供了一种比色检测过氧化氢或葡萄糖和胆固醇的方法。抗坏血酸是一种在血液中常见的还原性物质，正常人血液中含量约为5×10^-5至8×10^-5mol/L，本发明利用金核/铂壳纳米结构的类氧化酶特征，可消除还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，提供了一种抗干扰检测葡萄糖的方法。 

本发明利用金核/铂壳纳米结构的类过氧化物酶特性，替代了原有天然酶，不但降低了试剂成本，而且改善了天然酶的工作环境，使其在较高温度下也可进行检测。 

本发明与汪尔康等人利用四氧化三铁纳米颗粒类过氧化物酶检测过氧化氢和葡萄糖的方法相比，在于可以利用金核/铂壳纳米结构的类氧化酶特征，可消除还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，提供了一种抗干扰检测葡萄糖的方法。其次本文利用金核/铂壳纳米棒模拟酶对非水溶性的物质-胆固醇进行了检测，克服了溶剂对酶活性的影响，得到了与水溶性物质相同的线性检测区间。 

附图说明

图1(A)是表示金核/铂壳纳米棒模拟酶催化过氧化氢氧化邻苯二胺(OPD)反应随时间的反应进程的图。图为3ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液中含有100μl 0.1M邻苯二胺溶液中以及30μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液，图中各曲线从下向上分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟的吸收值； 

图1(B)是表示金核/铂壳纳米棒模拟酶催化过氧化氢氧化2，2′一联氮一双(3一乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)反应随时间的反应进程的图。图为3ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液中含有600μl 15mM ABTS溶液中以及30μl 10mM过氧化氢水溶液和10μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液，图中各曲线从下向上分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5分钟的吸收值； 

图2是反映金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液在不同条件下检测过氧化氢的效果的图，其中，图2A为金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢时得到的邻苯二胺浓度-450纳米处吸收值响应曲线；图2B为金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢时得到金核/铂壳纳米棒模拟酶的加入量-450纳米处吸收值响应曲线；图2C为金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢时得 到的反应温度-450纳米处吸收值响应曲线；图2D为金核/铂壳纳米棒模拟酶检测过氧化氢时得到的反应时间-450纳米处吸收值响应曲线；图2E为金核/铂壳纳米棒模拟酶检测过氧化氢时得到的反应体系pH值-450纳米处吸收值响应曲线； 

图3A是用金核/铂壳纳米棒模拟酶检测过氧化氢时得到的过氧化氢浓度-492纳米处吸收值响应曲线；图3B是过氧化氢测量的线性校正曲线； 

图4是用葡萄糖氧化酶和金核铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时其检测特异性的柱形图，柱形图从左到右依次为2mM葡萄糖，2mM麦芽糖，2mM乳糖，2mM果糖；柱形图垂直坐标代表相对吸光度(各种糖类A与缓冲溶液A₀在450纳米处的吸收值之差与缓冲溶液在450纳米处的吸收值的比值(A-A₀)/A₀) 

图5是用葡萄糖氧化酶和金核铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时得到的时间-450纳米处吸收值响应曲线图，其中，方块表示2mM葡萄糖，圆形表示2mM葡萄糖中混入了0.2mM抗坏血酸，三角形表示利用金核/铂壳纳米棒将混入的抗坏血酸氧化后的检测结果； 

图6A是用葡萄糖氧化酶和金核/铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时得到的葡萄糖浓度-492纳米处吸收值响应曲线图；图6B是葡萄糖测量的线性校正曲线图。 

图7A是用胆固醇氧化酶和金核/铂壳纳米棒模拟酶检测胆固醇时得到的胆固醇浓度-492纳米处吸收值响应曲线图；图7B是胆固醇测量的线性校正曲线图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。 

实施例1本发明金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的制备 

1)制备金晶种溶液 

取7.5mL浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化铵水溶液，向其中加入100.4μL浓度为24.7mM的四氯金酸水溶液，混合均匀后将体积稀释到9.4mL，在磁力搅拌的条件下加入0.6mL浓度为0.01M的硼氢化钠水溶液(使 用前临时配制并置于冰水中)，制得第一混合溶液，所述第一混合溶液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸和硼氢化钠的物质的量比＝0.75∶0.0025∶0.006；搅拌三分钟后停止，静置2小时，得到含有金晶种的金晶种溶液，所述金晶种溶液中金的浓度为0.25mM； 

2)制备金纳米棒溶液 

取100mL浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，向其中加入2.05mL浓度为24.7mM的四氯金酸水溶液，1mL浓度为10mM的硝酸银水溶液和2mL 0.5M的硫酸水溶液，混合均匀后，再加入800μL浓度为0.1M的抗坏血酸水溶液，得到的混合溶液由桔红色变为无色，然后加入240μL步骤1制备的金晶种溶液，制得第二混合溶液；混合均匀后放入30℃恒温水浴中；溶液在20分钟后开始出现颜色，经过16小时，最终变为枣红色，说明形成了金纳米棒溶液；所述第二混合液中的十六烷基三甲基溴化铵、四氯金酸、硝酸银、硫酸、抗坏血酸与金晶种的重量比＝5∶0.025∶0.0075∶0.5∶0.04∶0.000015； 

3)金纳米棒溶液的纯化 

先将制备好的金纳米棒溶液在30℃的恒温水浴中静置，然后在每分钟12000转的条件下离心两次，每次10分钟，这样去掉了未反应的离子及多余的十六烷基三甲基溴化铵，得到纯化的金纳米棒溶液，再加入去离子水，控制纯化的金纳米棒溶液中金纳米棒的浓度为0.5mM； 

4)制备金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液 

取一份(1mL)上述离心后的纯化的金纳米棒溶液放入试管中，并先后向其中加入1mL去离子水、40μL 2mM四氯亚铂酸钾水溶液和8μL 0.1M的抗坏血酸水溶液混合均匀得到第三溶液；该第三溶液中的抗坏血酸、四氯亚铂酸钾与金纳米棒的重量比为10∶1∶5.8； 

然后放入30℃的恒温水浴中，反应3小时后溶液由枣红色变成了暗灰色(表明了金核/铂壳纳米棒模拟酶的形成)，之后再向第三溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，并使加入十六烷基三甲基溴化铵后的溶液中的十六烷基三甲基溴化铵浓度为0.03M；然后再进行离心分离，得到金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液； 

5)金核/铂壳纳米棒模拟酶的PSS改性 

将步骤4)制备得到的金核/铂壳纳米棒模拟酶在每分钟12000转的转速下离心分离5分钟，弃去离心分离后的上清液，向沉淀中加入与上清液等体 积的聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液和氯化钠溶液；所选聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液和氯化钠溶液的浓度为分别为1mg/mL和3.0mM；将该溶液在超声清洗器中超声25分钟，然后静置8小时即得到聚苯乙烯磺酸钠(PSS)改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液； 

6)制备纯化的改性金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液： 

将步骤5)制得的改性的金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液，在每分钟12000转的转速下离心分离5分钟，弃去离心分离后的上清液，加入与上清液等体积的去离子水，分散均匀，得到经纯化的改性金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液，以用于实施例2-5。 

实施例2金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液催化过氧化氢氧化其底物反应的实验 

实施例2A金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液催化过氧化氢氧化邻苯二胺(OPD)反应的实验 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl0.1M邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢以及邻苯二胺的摩尔比为1∶2.4×10⁹∶4×10⁹。 

(2)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在十分钟之内的扫描动力学紫外吸收光谱，结果如图1(A)所示。 

实施例2B  金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液催化过氧化氢氧化2，2′一联氮一双(3一乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)反应的实验 

(1)取2.4ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入600μl15mMABTS，30μl 15mM过氧化氢水溶液和10μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢以及ABTS的摩尔比为1∶6×10⁸∶1.8×10¹⁰。 

(2)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在五分钟之内的扫描动力学紫外吸收光谱，结果如图1(B)所示。 

从图1可以看出随着时间的推移，有色生成物的含量不断升高，这说明金核铂壳纳米棒在过氧化氢存在情况下对底物的氧化有很高的催化活性，表现出了金核铂壳纳米棒的过氧化物酶活性。 

实施例3金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液检测过氧化氢的条件优化试验 

实施例3A OPD浓度对利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的影响 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢的摩尔比为1∶2.4×10⁹；只改变混合溶液中邻苯二胺(OPD)水溶液的浓度为0，0.01，0.02，0.03，0.05，0.1，0.5，1和3.3mM。 

(2)将步骤(1)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

实验结果如图2A所示，从图2A可以看出450纳米处的吸光度在邻苯二胺浓度为1mM时已经达到平衡。在本实验中优选为3.3mM邻苯二胺。 

实施例3B金核/铂壳纳米棒模拟酶浓度对利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的影响 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl0.1M邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定与邻苯二胺过氧化氢的摩尔比为1.175∶1。只改变加入金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为0.033，0.05，0.067，0.084，0.1，0.117和0.133nM。 

(2)将步骤(1)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

实验结果如图2B所示，从图2B可以看出金核/铂壳纳米棒模拟酶的加入量与450纳米处的吸光度成线性相应。在本实验中，较小的模拟酶用量其吸光度已经满足检测的需要，即金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的浓度为0.033nM。 

实施例3C反应温度对利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的影响 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl0.1M邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳 纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢以及邻苯二胺的摩尔比为1∶2.4×10⁹∶4×10⁹。 

(2)将步骤(1)中所得混合液在30℃，37℃，50℃，60℃和70℃水浴中反应30分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

实验结果如图2C所示，从图2C可以看出450纳米处的吸光度随着温度的升高而增加。在本实验中为了使模拟酶在自然酶的使用条件下工作，故选用了自然酶的最适宜条件37℃。 

实施例3D反应时间对利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的影响 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl0.1M邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢以及邻苯二胺的摩尔比为1∶2.4×10⁹∶4×10⁹。 

(2)将步骤(1)中所得混合液在37℃水浴中反应10，20，30，40，50和60分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

实验结果如图2D所示，从图2D可以看出450纳米处的吸光度随着反应时间的延长而增长。在本实验中，反应时间为30分钟时其吸光度已经满足检测的需要，选用反应时间的中间值30分钟。 

实施例3E反应pH对利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢的影响 

(1)取2.8ml 0.1M pH 3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5和10.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl 0.1M邻苯二胺(OPD)，60μl 0.1M过氧化氢水溶液和50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与过氧化氢以及邻苯二胺的摩尔比为1∶2.4×10⁹∶4×10⁹。 

(2)将步骤(1)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

实验结果如图2E所示，从图2E可以看出450纳米处的吸光度在溶液 酸碱度pH为4.5时最高。在本实验中为了使吸光度最大，选用了pH为4.5的磷酸缓冲溶液。 

实施例4利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢 

根据实施例4所选择的条件，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶比色测定过氧化氢，具体步骤如下： 

(1)取2.8ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入100μl0.1M邻苯二胺溶液中以及50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液和过氧化氢水溶液；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹；只改变加入过氧化氢水溶液的浓度为0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，4，5，10，50，100，1000mM。 

(2)将(1)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

利用本发明的比色方法对过氧化氢检测的表征如图3所示。其中，图3是用金核/铂壳纳米棒模拟酶检测过氧化氢时得到的过氧化氢浓度-492纳米处吸收值响应曲线(如图3A)；过氧化氢测量的线性校正曲线(如图3B)，由图3可以看出，该方法对于过氧化氢的检出限为4.5×10^-5mol/L，线性范围是5×10^-5到1×10^-3mol/L。 

实施例5利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖 

根据实施例4所选择的条件，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖，具体步骤如下：(1)取500ml 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，向其中加入20μl 10mg/mL的葡萄糖氧化酶和待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液，然后将上述溶液混合均匀，于37℃反应30分钟，得到葡萄糖反应液；所述混合溶液中只改变加入葡萄糖磷酸缓冲溶液的浓度为0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2mM。 

(2)取2.4ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次向其中加入3.3mM邻苯二胺(OPD)和0.084nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液以及上述步骤(1)的葡萄糖反应液中；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹。 

(3)将(2)中所得混合液在37℃水浴中反应30分钟； 

(4)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。 

利用本发明的比色方法对于葡萄糖检测的表征如图4，图5和图6所示。其中，图4是用葡萄糖氧化酶和金核铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时其检测特异性的柱形图，柱形图从左到右依次为2mM葡萄糖，2mM麦芽糖，2mM乳糖，2mM果糖；图中可以看出，该传感器可以完成葡萄糖特异的比色检测。从图4中可以看出代表葡萄糖的柱形要比其它糖类高出许多，这说明本发明的比色方法只对葡萄糖有很高的特异性。 

图5是用葡萄糖氧化酶和金核铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时得到的时间-450纳米处吸收值响应曲线图。实心方块表示2mM葡萄糖，空心圆形表示2mM葡萄糖中混入了0.2mM抗坏血酸，空心三角形表示利用金核/铂壳纳米棒将混入的抗坏血酸氧化后的检测结果，图中可看出，圆形数据与方块数据相差较大，即抗坏血酸干扰了实验结果，而空心三角形数据与实心方形数据重合度较高，故表明利用金核/铂壳纳米棒模拟酶的类似氧化酶的催化功能，可以氧化抗坏血酸，使得抗坏血酸无法干扰实验数据，即消除了还原性物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰。 

图6A是用葡萄糖氧化酶和金核/铂壳纳米棒模拟酶检测葡萄糖时得到的葡萄糖浓度-450纳米处吸收值响应曲线图；图6B是葡萄糖测量的线性校正曲线图，由图6可以看出，该方法对于葡萄糖的检出限为4×10^-5mol/L，线性范围为5×10^-5到4×10^-4mol/L。 

实施例6利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合胆固醇氧化酶来比色检测胆固醇 

根据实施例4所选择的条件，利用金核/铂壳纳米棒模拟酶并结合胆固醇氧化酶来比色检测葡萄糖，具体步骤如下：(1)将0.0386g胆固醇溶解在1ml异丙醇，0.5ml曲拉通以及8.5ml 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中的混合液中，在60℃的水浴中加热溶解，储存于4℃的冰箱中。 

(2)取500ml 10mM pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，向其中加入20μl 10U/mL的胆固醇氧化酶和待测的胆固醇磷酸缓冲溶液，然后将上述溶液混合均匀，于37℃反应30分钟，得到胆固醇反应液；所述混合溶液中只改变加入胆固醇磷酸缓冲溶液的浓度为0，0.03，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4，0.5mM； 

(3)取2.4ml 0.1M pH 4.5的磷酸缓冲溶液，依次100μl 0.1M邻苯二胺溶液中以及50μl 5nM金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液以及上述步骤(1)的胆固醇反应液；所述混合溶液中固定金核/铂壳纳米棒模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1∶4×10⁹； 

(4)将步骤(2)中所得混合液在37℃水浴中反应60分钟； 

(5)取100μl终止液(10M H₂SO₄和0.5M Na₂SO₃)加入到步骤(2)中所得混合液； 

(6)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。图7A是用胆固醇氧化酶和金核/铂壳纳米棒模拟酶检测胆固醇时得到的胆固醇浓度-492纳米处吸收值响应曲线图；图6B是胆固醇测量的线性校正曲线图，由图7可以看出，该方法对于胆固醇的检出限为3×10^-5mol/L，线性范围为3×10^-5到3×10^-4mol/L。