一种无菌速溶型药膜及其肿瘤药敏测试用途

摘要

本发明提供一种无菌速溶型药膜，应用该药膜进行抗肿瘤药物药敏测试的方法，并还提供了该无菌速溶型药膜用于抗肿瘤药敏测试的用途。本发明所述的抗肿瘤药物药敏测试的方法，包括将抗肿瘤药物溶解于含肿瘤细胞的细胞培养液中以使抗肿瘤药物与肿瘤细胞充分接触的步骤，其特征在于所述的抗肿瘤药物是通过制成无菌速溶型药膜形式溶解于所述的细胞培养液中。本发明通过将抗肿瘤药物制成无菌速溶型药膜进行抗肿瘤药物药敏测试，提高了抗肿瘤药物药敏测试的操作效率、灵活性、准确性和经济性。

说明书

技术领域

本发明提供一种无菌速溶型药膜，应用该药膜进行抗肿瘤药物药敏测试的方法，并还提供了该无菌速溶型药膜用于抗肿瘤药敏测试的用途。属于医药技术领域。 

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主要疾病之一，在35～59岁年龄组中，恶性肿瘤居死因第一位。资料显示，我国恶性肿瘤年发病例数为200万，死亡约150万，并以3％的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率之最。 

目前世界对恶性肿瘤的主要治疗手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗及生物免疫治疗等。在恶性肿瘤治疗的诸多手段中，化疗作为一种全身性的治疗方法，较之其他方法有可能最大程度地杀灭患者体内的肿瘤细胞，因此，化疗在恶性肿瘤治疗中占有非常重要的地位。随着医学的发展，化疗已经不再是单纯起姑息性治疗作用的手段，正在从姑息向根治过渡。 

1998年，世界卫生组织提出，使用适当化疗在部分肿瘤(恶性滋养细胞肿瘤、急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、急性粒细胞白血病、胚胎性横纹肌肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌和卵巢癌等)中已成为可以治愈肿瘤的根治性治疗手段。经辅助化疗后可能治愈的肿瘤有乳腺癌、成骨肉瘤、大肠癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤及肾母细胞瘤等。 

尽管化疗在恶性肿瘤的治疗中占有非常重要的地位，但是在临床实践中，结果往往不尽如人意。其中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见因素，也是困扰肿瘤治疗的关键性难题。耐药问题是极为普遍的临床问题，据美国癌症协会估计，90％以上因肿瘤死亡的患者在不同程度上受到耐药影响。 

肿瘤细胞耐药分为原发性和获得性耐药两大类。目前临床上通常的做法是，根据国际肿瘤临床试验的循证研究结果，得知不同的化疗药物对不同肿瘤的治疗敏感性不同，即每一种肿瘤有相应有效的化疗药物敏感谱，从而选择疗效最高的 化疗单药或多种药物组成的联合方案进行治疗。但在临床上经常碰到这样的情况，经循证研究公认为对某种肿瘤有效的治疗方案，而对有的患者却毫无效果。如阿霉素对浸润性乳腺癌是一种具有里程碑意义的治疗药物，但仍有50％的浸润性乳腺癌病人对这种药不敏感。又如健择，对非小细胞肺癌公认的疗效明显，但也有60％以上的病人疗效并不明显。 

肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异。即不同的肿瘤类型或同一类型的不同病人，甚至同一病人在不同的发病阶段，对化疗的敏感性并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种化疗药物或几种化疗药物的联合应用，能对某一种肿瘤100％有效。临床上，用同一种化疗药物或同一种化疗方案治疗不同的肿瘤患者，显然带有一定的盲目性。因此，在化疗前针对不同的患者进行肿瘤药敏试验来选择有效化疗药物进行化疗显得十分必要。为此，建立一种像细菌敏感试验一样，通过相对可靠的敏感试验方法，对不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。 

目前肿瘤药敏试验操作所需的药物以临用现配为主，肿瘤药敏试验需要测试多种抗肿瘤药物，药液配制稀释繁琐，且肿瘤药敏试验所需抗肿瘤药物剂量小，取样不便。部分药物溶液状态下保存时间短，剩余部分只能报废，造成药物的浪费，尤其是价格昂贵的药物。 

现有技术公开的肿瘤药敏测试方法，主要是采用试剂盒。例如，CN93111551.5公开了肿瘤化疗药物敏感预测试剂配制方法及试剂盒，该专利将8种常用抗肿瘤药物按设定剂量预装于标本瓶内。但该方法不便于联合化疗方案的测试，且不便于方案的剂量调整。 

专利CN03102260.X采用预制药敏检测板的方法，将抗肿瘤药物按计算剂量加入检测板内，冻干、包装，用于肿瘤药敏试验。该方法同样不便于联合化疗方案的测试，不便于方案的剂量调整，而且所使用方法无法真正解决无菌问题，不符合细胞培养的无菌要求。由于培养板中所加的药物的量比较少，冻干过程中各种药物粉尘相互交叉污染，使实际诊断结果可疑。 

临床目前有少量采用抗肿瘤药物临时配制的方法进行抗肿瘤药物药敏测试，但是，该方法存在许多问题：配制药物的准确浓度未知，所配制药液的准确性存疑；配制所使用的药物多为临床使用制剂，制剂中辅料的会干扰对最终结果的判断；临床口服抗肿瘤药物的抗肿瘤药物药敏测试无法进行；个体操作误差大。 

发明内容

为了克服现有技术中抗肿瘤药物药敏测试存在的缺陷，本发明提供一种提高抗肿瘤药物药敏测试的操作效率、灵活性、准确性和经济性的方法。本发明方案如下： 

本发明提供了一种抗肿瘤药物药敏测试的方法，包括将抗肿瘤药物溶解于含肿瘤细胞的细胞培养液中以使抗肿瘤药物与肿瘤细胞充分接触的步骤，其特征在于所述的抗肿瘤药物是通过制成无菌速溶型药膜形式溶解于所述的细胞培养液中。细胞培养液没有特别限制，可以为常用的细胞培养液，例如RPMI1640、DMEM、199、MEM、F12、L-15等细胞培养液。 

本发明上述方法，抗肿瘤药物制成无菌速溶型药膜，药膜易溶解于细胞培养液。膜的厚度和面积控制在合适的范围，保证溶解速度和机械强度。本发明上述所述的方法，其中所述的无菌速溶型药膜厚度0.01mm～1mm，优选0.04mm～0.15mm；面积0.2cm²～25cm²，优选0.5cm²～16cm²；1cm²的药膜在1ml细胞培养液中于5分钟、优选3分钟、更优选100秒内完全溶解。药膜形状可为圆形、正方形或长方形，可适应各种相应规格的细胞培养板。 

本发明上述所述的方法，其中所述的无菌速溶型药膜按重量百分比含0.0001％～30％抗肿瘤药物、50％～98％成膜材料和1％～20％增塑剂。 

其中所述的成膜材料选自聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等，优选聚乙烯醇，特别是聚乙烯醇04-88或者聚乙烯醇05-88。 

其中，上述所述的成膜材料，为易溶于水的成膜材料，考虑到制备工艺难度和成膜性能，更优选的是聚乙烯醇，羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。鉴于膜的溶解性能、机械性能等，更优选聚乙烯醇，特别是聚乙烯醇04-88、聚乙烯醇05-88。 

聚乙烯醇随着聚合度的升高，水中溶解性下降，成膜后强度增加。聚乙烯醇04-88和聚乙烯醇05-88在水中的溶解性较好，又有足够的成膜强度。对于在膜中含量较低，对膜强度影响较小的药物，聚乙烯醇04-88可以很好的满足要求，对于在膜中含量较高，对膜强度影响较大的药物，则使用聚乙烯醇05-88提高膜强度，部分或全部替换聚乙烯醇04-88。 

所述的增塑剂选自甘油、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、山梨醇、柠檬酸三 乙酯等；最优选的是甘油。 

本发明上述所述的方法，其中所述的抗肿瘤药物没有特别限制，可以是各种抗肿瘤药物，例如选自如下中的一种或者两种以上：氟尿嘧啶、替加氟、二喃氟啶、去氧氟尿苷、卡莫氟、甲氨蝶呤、白消安、阿霉素、柔红霉素、去甲柔红霉素、表阿霉素、吡柔比星、米托蒽醌、放线菌素D、博莱霉素、平阳霉素、丝裂霉素、光辉霉素、橄榄霉素、链脲霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、卡莫司汀、洛莫司汀、阿糖胞苷、氟脲苷、环胞苷、氯环胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、多西他赛、长春瑞滨、长春地辛、长春新碱、紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、乐铂、庚铂、利妥昔单抗、替伊莫单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、白介素-2、醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、阿那曲唑、来曲唑、氨鲁米特、福美坦、依西美坦、鬼臼噻吩甙、依托泊苷、喷司他丁、伊立替康、索拉菲尼、卡培他滨、地西他滨、培美曲塞二钠、丙卡巴肼、三尖杉酯碱、沙利度胺、氮烯咪胺、三苯氧胺、替莫唑胺、拓扑替康、吉非替尼、厄洛替尼、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、依西美坦、亚砷酸、靛玉红等。 

药敏测试中的细胞培养液，是用于培养肿瘤细胞的液体培养基，细胞培养液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、无机盐、维生素和微量元素等。为了维持稳定的pH，培养液中一般有一个pH缓冲系统，同时常加入少量的酚红作为pH指示剂;另外培养液中一般需要加入一定量的血清或特殊的促细胞生长因子。合适的肿瘤细胞培养液例如可以为RPMI1640(加10％～20％胎牛血清和/或加0.03％谷氨酰胺)、DMEM、199、MEM、F12、L-15等，最为常用的是RPMI1640加10％～20％胎牛血清。由于肿瘤细胞的特殊性，在培养过程中，细胞培养液中常需要适当添加促细胞生长因子，见表1。 

表1常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 

如：适合用于人小细胞肺癌培养的HITES选择培养基是一种改良RPMI1640培养基，含有氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素、硒等成分。 

所述的肿瘤细胞，例如可以选用来自临床外科手术切除的离体肿瘤组织或者从血液系统或体液中在体外分离等得到的非实体肿瘤细胞。应注意取材的新鲜、无菌、及时、准确问题，取材后尽快将癌组织进行培养，一般4小时内细胞存活最好。标本在4℃存放，不宜超过24小时。应注意取材部位，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免，应挑选活力较好的部位。同时由于实体瘤组织在取材时可能被污染，应注意清洗及无菌处理。对于新鲜肿瘤组织单纯的机械方法分离如吹打和过滤一般对癌细胞损伤小，有些肿瘤如人卵巢癌、某些神经胶质瘤可采用。癌组织多为较坚实的实体，肿瘤细胞包埋在大量的纤维基质中，难以进行机械分离，因此常采用酶消化法来分散癌细胞。消化后制备的癌细胞，培养时应有足够的细胞密度，通常接种细胞浓度为5×10⁵/ml或1×10⁶/ml，37℃培养。 

作为本发明另一目的，还提供一种用于抗肿瘤药物药敏测试的无菌速溶型药膜，按重量百分比含0.0001％～30％抗肿瘤药物、50％～98％成膜材料和1％～20％增塑剂，其特征在于其中所述的成膜材料选自聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。 

其中，上述所述的成膜材料，为易溶于水的成膜材料，考虑到制备工艺难度和成膜性能，更优选的是聚乙烯醇，羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。 

鉴于膜的溶解性能、机械性能等，更优选聚乙烯醇，特别是聚乙烯醇04-88、聚乙烯醇05-88。 

所述的增塑剂选自甘油、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、山梨醇、柠檬酸三乙酯等；最优选的是甘油。 

优选的，上述所述的药膜，按重量百分比含0.0001％～10％抗肿瘤药物、80％～98％成膜材料和1％～10％增塑剂。 

本发明还提供了一种制备上述所述的无菌速溶型药膜的方法，其包括如下步骤： 

(1)将成膜材料加入水中，搅拌溶解或加热溶解； 

(2)加入增塑剂和抗肿瘤药物，搅拌溶解均匀，采用加热、静置或超声等方式脱气； 

(3)将上述溶液涂布于制膜设备，采用热风或冷风等方式干燥； 

(4)脱膜，测定含量，并按照测定结果进行分剂量分割； 

(5)将分割后的药膜采用放射线照射灭菌或环氧乙烷灭菌，优选放射线照射灭菌。 

本发明上述所述的无菌速溶型药膜，适合用于抗肿瘤药物药敏测试的用途。其中药膜直接用于肿瘤细胞药敏测试，或者药膜溶解后加入药物代谢酶活化后进行肿瘤细胞药敏测试。 

肿瘤药敏测试需要将抗肿瘤药物溶解于细胞培养液中，以便药物能够充分与细胞接触。为保证操作的可靠与便捷，药物必须能够快速的分散并溶解细胞培养液中。本发明通过将抗肿瘤药物制成无菌速溶型药膜形式，用于肿瘤药物的药敏测试，便于肿瘤药敏试验的操作以及节约成本，将抗肿瘤药物制备成剂量准确、稳定性好、能够在肿瘤细胞培养液中快速溶解的无菌药膜，并将药膜按使用剂量进行准确的切片，能够便捷的用于肿瘤药敏试验。 

溶解速度测试 

取1cm²大小的空白药膜10片/每组，分别加入24孔板中，每孔加入冷RPMI1640细胞培养液(含20％的FBS)1ml，加入空白药膜1片，轻轻振摇使完全溶解。记录时间，取平均值，见表2。 

表2溶解速度测试(成膜材料98％，增塑剂甘油2％) 

拉伸性能测试 

取膜剂10片/组，用万能试验机进行拉伸性能测试，读取拉伸强度和断裂伸 长率，取平均值，见表3、表4。 

表3空白膜拉伸强度测试 

(成膜材料98％，增塑剂甘油2％) 

表4空白膜断裂强度测试 

(成膜材料98％，增塑剂甘油2％) 

表5聚乙烯醇空白膜性能测试(膜厚度0.10mm) 

具体实施方式：

实施例1： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇04-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入甘油和长春新碱，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例2： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇05-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入甘油和依托泊苷，搅拌0.5小时。停止搅拌，保温4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例3： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇04-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入聚乙二醇和甲氨蝶呤，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例4： 

将纯化水加热至80℃，加入羟丙甲纤维素，搅拌分散，降温至25℃，搅拌溶解。加入甘油和阿糖胞苷，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例5： 

将纯化水加热至80℃，加入羧甲基纤维素钠，搅拌溶解。降温至70℃，加入甘油和羟基喜树碱，搅拌0.5小时。停止搅拌，保温1小时，排除气泡。涂膜并于70℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例6： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇05-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入乙二醇和高三尖杉酯碱，搅拌0.5小时。停止搅拌，保温4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例7： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌溶解。降温至25℃，加入甘油和柔红霉素，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例8： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇04-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入柠檬酸三乙酯和米托蒽醌，搅拌0.5小时。停止搅拌，保温4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例9： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇05-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入丙二醇和阿霉素，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例10： 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇04-88，搅拌溶解。降温至25℃，加入甘油和去甲柔红霉素，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置4小时，排除气泡。涂膜并于30℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例11： 

聚乙烯醇04-88        98g 

甘油                 2g 

纯化水               200ml 

将纯化水加热至80℃，加入聚乙烯醇04-88，搅拌溶解。降温至70℃，加入 甘油，搅拌0.5小时。停止搅拌，静置1小时，排除气泡。涂膜并于70℃干燥。脱膜，切割包装。灭菌。 

实施例12： 

抗肿瘤药敏测试 

按急性髓系白血病的诊疗指南选择治疗化疗药物，根据药物的性质将各种药物分别制成药膜，各种化疗药物药膜参考药物在人体内的血浆峰值浓度制备，并制备空白药膜，参照实施例1～实施例11。根据药膜含量测定结果，将每片药膜切割为含1ml血浆峰值浓度的化疗药物，空白药膜切割面积1cm²。 

于化疗前无菌技术下抽取20例急性髓系白血病患者的骨髓10ml(肝素抗凝)，在净化室内经Ficoll液分离出白血病细胞，经培养液洗涤，置于RPMI1640培养体系中制成1×10⁶/ml的细胞悬液。 

细胞悬液种于24孔培养板中(1ml/孔)，设细胞对照组(肿瘤细胞悬液)、空白药膜对照组(肿瘤细胞悬液+空白药膜)、实验组(肿瘤细胞悬液+化疗药膜)。实验组每种药物分3个复孔，对照组各孔不加化疗药物。实验组有单药组和联合用药组(表6)，化疗药物联合用药时，按照化疗方案取相应的单药药膜在一起组合，置于同一孔中。按设定方案向培养板各孔加入相应药膜，并向各孔加入细胞悬液1ml/孔，轻轻振摇，使药膜溶解。37℃、5％二氧化碳饱和湿度培养24小时。离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM，离心时间5min收集细胞)。用400μl1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×10⁶/ml。在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15分钟。加入10μl PI后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测对照组及药物组细胞凋亡及坏死的数量，计算药物的抑制率，评估药物的敏感度。 

表6药敏测试的敏感度 

药物 敏感度(％) 长春新碱膜 25 依托泊苷膜 10 甲氨蝶呤膜 0 阿糖胞苷膜 35

[0099] 

羟基喜树碱膜 25 高三尖杉酯碱膜 35 柔红霉素膜 65 米托蒽醌膜 25 阿霉素膜 40 去甲柔红霉素膜 30 阿糖胞苷膜+柔红霉素膜 95 阿糖胞苷膜+去甲柔红霉素膜 70 阿糖胞苷膜+阿霉素膜 85 阿糖胞苷膜+高三尖杉酯碱膜 85

(抑制率＝〔(空白膜对照组活细胞-实验组活细胞)/空白膜对照组活细胞〕×100％；抑制率＞50％为敏感) 

实施例13： 

按小细胞肺癌的诊疗指南选择治疗化疗药物，根据药物的性质将各种药物分别制成药膜，各种化疗药物药膜参考药物在人体内的血浆峰值浓度制备，并制备空白药膜，参照实施例1～实施例11。根据药膜含量测定结果，将每片药膜切割为含1ml血浆峰值浓度的化疗药物，空白药膜切割面积1cm²。 

于化疗前取1例患者的小细胞肺癌新鲜组织块(0.5cm³～1cm³)，置于无菌生理盐水中(含20万单位/ml青霉素、25万单位/ml链霉素)，在超净工作台上，剪除脂肪、纤维等正常组织，以及坏死和血污组织，用带抗生素的生理盐水冲洗干净组织，加入组织消化酶(胰酶、胶原酶)消化2～3h，使组织块成为单个细胞漏过铜网，离心弃上清，加RPMI1640培养液吹打成细胞悬液，计数并调整细胞浓度至1×10⁶/ml。 

细胞悬液种于24孔培养板中(1ml/孔)，设细胞对照组(肿瘤细胞悬液)、空白药膜对照组(肿瘤细胞悬液+空白药膜)、实验组(肿瘤细胞悬液+化疗药膜)。实验组每种药物分3个复孔，对照组各孔不加化疗药物。实验组有单药组和联合用药组，化疗药物联合用药时，按照化疗方案取相应的单药药膜在一起组合，置于同一孔中。按设定方案向培养板各孔加入相应药膜和活化酶，并向各孔加入细胞悬液1ml/孔，轻轻振摇，使药膜溶解。37℃、5％二氧化碳饱和湿度培养24小时。 离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM，离心时间5min收集细胞)。用400μl1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×10⁶/ml。在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15分钟。加入10μl PI后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测对照组及药物组细胞凋亡及坏死的数量，计算药物的抑制率。 

表7化疗方案及抑制率 

(联合用药时将各种单药药膜按照化疗方案组合，并加入相应的药物活化酶) 

方案 抑制率(％) 依托泊苷膜 76 紫杉醇膜 69 拓扑替康膜 61 依托泊苷膜+顺铂膜 90 依托泊苷膜+卡铂膜 83 伊立替康膜+顺铂膜 80 卡铂膜+紫杉醇膜+依托泊苷膜 96 环磷酰胺膜+阿霉素膜+长春新碱膜+肝微粒体酶 85 环磷酰胺膜+阿霉素膜+依托泊苷膜+肝微粒体酶 84

(抑制率＝〔(空白膜对照组活细胞-实验组活细胞)/空白膜对照组活细胞〕×100％；环磷酰胺需要肝微粒体酶活化) 

实施例14： 

按乳腺癌的最疗指南选择治疗化疗药物，根据药物的性质将各种药物分别制成药膜，各种化疗药物药膜参考药物在人体内的血浆峰值浓度制备，并制备空白药膜，参照实施例1～实施例11。根据药膜含量测定结果，将每片药膜切割为含1ml血浆峰值浓度的化疗药物，空白药膜切割面积1cm²。 

取1例手术切除的乳腺癌组织浸泡于无菌Hanks液中，选取无坏死癌组织少许，加入含有1％双抗的RPMI1640培养基中反复冲洗，剪成1～2mm³小块，加入10倍量的0.25％胰蛋白酶溶液及0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)、37℃消化40min，每5min摇动1次，弃去消化液，加入无血清1640培养基冲洗，然后加 入少量培养液用吸管反复吹打，使之成为单细胞过40目网，并用RPMI1640培养体系配制成1×10⁶/ml的细胞悬液。 

细胞悬液种于24孔培养板中(1ml/孔)，设细胞对照组(肿瘤细胞悬液)、空白药膜对照组(肿瘤细胞悬液+空白药膜)、实验组(肿瘤细胞悬液+化疗药膜)。实验组每种药物分3个复孔，对照组各孔不加化疗药物。化疗药物联合用药时，按照化疗方案取相应的单药药膜在一起组合，置于同一孔中。按设定方案向培养板各孔加入相应药膜和活化酶，并向各孔加入细胞悬液1ml/孔，轻轻振摇，使药膜溶解。将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养48h后，每孔加入MTT试剂20μl，轻轻混匀，继续培养6～12h，取出检测板以1000r/min离心15min，每孔加入DMSO100μl，充分振荡直至微孔内的紫色结晶全部溶解，用酶标分析仪在570nm处读取各孔吸光度(A)值。 

按下列公式计算不同化疗药物对乳腺癌细胞的增殖抑制率。 

乳腺癌细胞的增殖抑制率＝(1-加药组细胞A值/空白膜对照组细胞A值)×100％ 

表8化疗方案及抑制率 

(联合用药时将各种单药药膜按照化疗方案组合，并加入相应的药物活化酶) 

方案 抑制率(％) 环磷酰胺膜+阿霉素膜+多西他赛膜+肝微粒体酶 83 环磷酰胺膜+阿霉素膜+紫杉醇膜+肝微粒体酶 76 环磷酰胺膜+多西他赛膜+肝微粒体酶 78 环磷酰胺膜+阿霉素膜+肝微粒体酶 55 环磷酰胺膜+阿霉素膜+氟尿嘧啶膜+肝微粒体酶 71 环磷酰胺膜+甲氨蝶呤膜+氟尿嘧啶膜+肝微粒体酶 63 环磷酰胺膜+表柔比星膜+肝微粒体酶 79

(抑制率＝〔(空白膜对照组活细胞-实验组活细胞)/空白膜对照组活细胞〕×100％)。