一种纯化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种纯化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法，利用自主筛选鉴定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(CGMCC NO.4348），通过微生物发酵培养出蜡样芽孢杆菌发酵液，并利用硫酸铵分级沉淀方法提取出抑菌蛋白粗品；再利用葡聚糖凝胶柱来进一步纯化抑菌蛋白粗品，并将其对真菌病害进行抑菌活性检测。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，可以显著提高其发酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及微生物发酵，生物制药，发酵产物的提 取、分离和纯化工艺，特别涉及一种纯化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌（Bacillus.cereus简称B.cereus）广泛地分布在在自然界 中，在空气、尘埃、土壤、水及植物中都可以分离出蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢杆 菌活菌制剂是我国农业部正式批准生产的微生物制品，具有调节宿主微生态平衡 的功能，广泛应用于农业、饲料、医药保健和食品等领域。然而，此制剂也和其 他微生态制剂一样，存在以下几个问题：生产过程中温度、压片等因素导致活菌 数减少有效期内活菌量不稳定，产品有效期不长、货架期短等。因此，提高蜡样 芽孢杆菌制剂的活菌数对产品质量的提高具有重大意义，也为工业化生产蜡样芽 孢杆菌活菌制剂奠定了基础。蜡样芽孢杆菌可单独制成微生态制剂，用于胃肠道 疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治， 如能效改善肝硬化患者肠道菌群失调，并可降低血清LBP浓度，可以作为肝硬化 患者的辅助治疗措施。

蜡样芽孢杆菌不但其本身可以被制成微生物菌剂和微生物肥料，它还能通过 体内的SOD酶，调节作物细胞微生境，维持细胞正常的生理代谢和生化反应，提 高抗逆性，加速生长，提高产量和品质。有益蜡样芽孢杆菌具有分泌各种蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶（SOD）、抗菌素及多种氨基酸、维生素等营养 物质的能力，因此可以被广泛应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域。研 究表明：蜡样芽孢杆菌的抑菌活性物质主要是其活菌的生理与代谢活动而产生的 抗菌蛋白、多肽类及几丁质酶等多种物质。但蜡样芽孢杆菌制剂普遍存在产品有 效期不长、货架期短等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有的技术中存在的缺陷或者不足，提供一种纯 化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法。

本发明的技术方案为：利用自主筛选鉴定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus  CGMCC NO.4348，通过微生物发酵培养出蜡样芽孢杆菌发酵液，并利用硫酸铵分 级沉淀方法提取出抑菌蛋白粗品，具体培养及提取方法见本发明人申请的专利 （申请号为201210056365.7）；利用葡聚糖凝胶柱来进一步纯化抑菌蛋白粗品， 并将其对真菌病害进行抑菌活性检测。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉， 可以显著提高其发酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。

本发明的具体技术方案：一种纯化蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus  CGMCC4348发酵液中抑菌蛋白的方法，其具体步骤如下：

（1）抑菌蛋白的提取：利用蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348， 通过微生物发酵培养出含有抑菌蛋白的发酵液，并将此发酵液采用硫酸铵 分级沉淀以提取获得抑菌蛋白粗品；

（2）装柱：称取葡聚糖凝胶用蒸馏水以15-20mL/g的比例进行装柱前的溶胀 3-5h；将处理好的葡聚糖凝胶用湿法上柱；上柱后用缓冲液进行充分平 衡；

（3）上样：将步骤（1）中获得的抑菌蛋白粗品配成15-20mg/ml样品溶液， 注入到平衡好的凝胶柱上；

（4）洗脱收集：用缓冲液进行洗脱，其中缓冲液的流速为0.5-1.0mL/min， 每2-5min收集一次洗脱液；将收集的洗脱液分别在波长为280nm下测 定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脱液，浓缩干燥后得到抑菌蛋白。

本发明中抑菌活性测定：把抑菌蛋白用无菌水配成5.0-10.0ug/mL的蛋白 溶液。培养出中心接有棉花枯萎病病菌和黄瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培养 48h后，于平板上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打 一个圆孔，在其中三个孔内注入10-20uL的抑菌蛋白溶液，另一个圆孔中以无 菌水作为对照。27~32℃培养42~48h，观察发现纯化的抑菌蛋白具有显著的拮 抗作用。

本发明步骤（1）中所述的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC4348抑菌 蛋白粗品的提取的方法详见本发明人申请的专利（申请号为201210056365.7）， 本发明是在此基础上进一步研究得到的。

优选上述的葡聚糖凝胶型号为：Sephadex G-150、Sephadex G-100或 Sephadex G-75；凝胶柱的径高比为：1：（10-15）。

优选步骤（2）和（4）中所述的缓冲液为：0.02-0.05mol/L的Tris-HCl， pH为7.1-8.5；步骤（2）中充分平衡凝胶柱的时间为2-5h。

优选步骤（3）中所述的注入到凝胶柱上的抑菌蛋白粗品溶液的体积为凝胶 柱柱床体积的10%-15%；

本专利选用的蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名 是Bacillus cereus，参据的微生物：NJYH63305，保藏日期是2010年11月15 日，保藏中心登记入册的编号是CGMCC No.4348。

有益效果：

采用本发明的微生物发酵提纯发酵液中的抑菌蛋白的方法，利用自主筛选鉴 定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.4348，通过微生物发酵培养出含 有抑菌蛋白的发酵液，采用硫酸铵分级沉淀来获取抑菌蛋白的；利用葡聚糖凝胶 柱来进一步纯化抑菌蛋白，并将其对真菌病害进行抑菌活性检测。本发明操作方 便、工艺简单、成本低廉，可以显著提高其发酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。

保藏信息

上述蜡样芽孢杆菌Bacillus cerreus CGMCC No.4348是由本实验室选育并保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所），其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC  No.4348，保藏日期是：2010年11月15日（见本发明人申请的专利，申请号 为201010579133.0）。

具体实施方式

实施例1

（1）抑菌蛋白的提取：利用自主筛选鉴定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC4348，通过微生物发酵培养出含有抑菌蛋白的发酵液，并将此发酵 液采用硫酸铵分级沉淀以提取获得抑菌蛋白粗品，参见本发明人申请专利 （申请号为201210056365.7）中的实例1中提取的抑菌蛋白组分A，其对 棉花枯萎病病菌的抑菌率为62%；

（2）装柱：称取葡聚糖凝胶Sephadex G-100用蒸馏水以16mL/g的比例进行 装柱前的溶胀3h；将处理好的葡聚糖凝胶用湿法上柱；柱的径高比为： 1：15，上柱后用0.02mol/L pH为7.1的Tris-HCl缓冲液进行充分平衡 3h；

（3）上样：将步骤（1）中获得的抑菌蛋白配成15mg/ml样品溶液，注入到平 衡好的凝胶柱上；上样的抑菌蛋白粗品溶液的体积为凝胶柱柱床体积的 14%；

（4）洗脱收集：用0.02mol/L pH为7.1的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，其中， 缓冲液的流速为0.8mL/min，每3min收集一次洗脱液，将收集的洗脱 液分别在波长为280nm下测定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脱液，浓 缩干燥后得到抑菌蛋白。

（5）活性测定：把步骤（4）中纯化的抑菌蛋白用无菌水配成6.0ug/mL的蛋 白溶液。培养出中心接有棉花枯萎病病菌的PDA平板培养48h后，于平 板上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个圆 孔，在其中三个孔内注入15uL的抑菌蛋白溶液，另一个圆孔中以无菌水 作为对照。28℃培养47h，观察发现纯化的抑菌蛋白组分A的抑菌率达 到73%。

实施例2

（1）抑菌蛋白的提取：利用自主筛选鉴定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC4348，通过微生物发酵培养出含有抑菌蛋白的发酵液，并将此发酵 液采用硫酸铵分级沉淀以提取获得抑菌蛋白粗品；参见本发明人申请专利 （申请号为201210056365.7）中的实例2中提取的抑菌蛋白组分B，其对 黄瓜枯萎病病菌的抑菌率为42%；

（2）装柱：称取葡聚糖凝胶Sephadex G-150用蒸馏水以20mL/g的比例进行 装柱前的溶胀5h；将处理好的葡聚糖凝胶用湿法上柱；柱的径高比为： 1：15，上柱后用0.03mol/L pH为7.5的Tris-HCl缓冲液进行充分平衡 4h；

（3）上样：将步骤（1）中获得的抑菌蛋白配成18mg/ml样品溶液，注入到平 衡好的凝胶柱上；上样的抑菌蛋白粗品溶液的体积为凝胶柱柱床体积的 15%；

（4）洗脱收集：用0.03mol/L pH为7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，其中， 缓冲液的流速为0.6mL/min，每2min收集一次洗脱液，将收集的洗脱 液分别在波长为280nm下测定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脱液，浓 缩干燥后得到抑菌蛋白。

（5）活性测定：把步骤（4）中纯化的抑菌蛋白用无菌水配成10.0ug/mL的蛋 白溶液。培养出中心接有黄瓜枯萎病病菌的PDA平板培养48h后，于平 板上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个圆 孔，在其中三个孔内注入20uL的抑菌蛋白溶液，另一个圆孔中以无菌水 作为对照。30℃培养45h，观察发现纯化的抑菌蛋白组分B的抑菌率达 到59%。

实施例3

（1）抑菌蛋白的提取：利用自主筛选鉴定的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC4348，通过微生物发酵培养出含有抑菌蛋白的发酵液，并将此发酵 液采用硫酸铵分级沉淀以提取获得抑菌蛋白粗品；参见本发明人申请专利 （申请号为201210056365.7）中的实例3中提取的抑菌蛋白组分A，其对 棉花枯萎病病菌的抑菌率为59%；

（2）装柱：称取葡聚糖凝胶Sephadex G-75用蒸馏水以18mL/g的比例进行装 柱前的溶胀4h；将处理好的葡聚糖凝胶用湿法上柱；柱的径高比为：1： 10，上柱后用0.04mol/L pH为8.5的Tris-HCl缓冲液进行充分平衡2h；

（3）上样：将步骤（1）中获得的抑菌蛋白配成20mg/ml样品溶液，注入到平 衡好的凝胶柱上；上样的抑菌蛋白粗品溶液的体积为凝胶柱柱床体积的 10%；

（4）洗脱收集：用0.04mol/L pH为8.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，其中， 缓冲液的流速为1.0mL/min，每5min收集一次洗脱液，将收集的洗脱 液分别在波长为280nm下测定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脱液，浓 缩干燥后得到抑菌蛋白；

（5）活性测定：把步骤（4）中纯化的抑菌蛋白用无菌水配成8.0ug/mL的蛋 白溶液。培养出中心接有棉花枯萎病病菌的PDA平板培养42h后，于平 板上下左右距离培养皿边缘2cm处各用打孔器（d=6mm）各打一个圆 孔，在其中三个孔内注入10uL的抑菌蛋白溶液，另一个圆孔中以无菌水 作为对照。32℃培养42h，观察发现纯化的抑菌蛋白组分A的抑菌率达 到71%。