用于结核病预防和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗pVAXI-Hsp70/CD80

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结核病的嵌合型DNA疫苗。本发明要解决的技术问题是现有的嵌合疫苗药效还不够理想以及安全性不好。本发明的技术方案是提供一种含有HSP70/CD80嵌合蛋白的编码基因并能在体内将其表达的嵌合型DNA疫苗。使用pVAXI载体后，在结核病的预防和治疗上具有更好的效果。尤其是能诱导出更强的Th1型反应，能更好的预防和治疗结核病。另外该载体具有的是卡纳霉素的抗性，不会导致任何过敏反应，能更好预防和免疫治疗结核病。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具发明涉及一种结核疫苗，具体地说涉及一种能够诱导和增 强人或动物体内保护性免疫应答（体液免疫和细胞免疫）的嵌合DNA分子。该DNA分子可 作为疫苗，用于结核病的预防和治疗。

背景技术

继第一次和第二次世界大战全球出现两次结核病回升高峰之后，80年代中期，由于世界 范围内结核病疫情又急剧恶化而形成第三次回升高峰，据《世界卫生组织简报》报道，1996 年全球所有年龄死亡人数，结核病捧列于缺血性心脏病、脑血管疾病和急性下呼吸道感染死 亡例数之后，位居第四位，占全球单病种引起死亡例数之首，创百年历史之最高记录。全球 每年死于结核瘸的人数达300万，每天有8000人死于结核病，每10秒种就有1人死于结核 瘸．贫穷、流动人口、耐多药结核病增多以及爱滋病的流行使结核病更加成为全球性的严重 公共卫生问题(Cole ST.Why sequence the genome of Mycobacterium tuberculosis?Tubercle  Lung.Dis.1996;77:486-490.)，因而引起国际社会的极大关注。应用现代分子生物学方法揭 示分技杆菌的秘密是目前研究策略的中心问题．通过分析结核杆菌基因组DNA序列将获得 大量有关结核杆菌的生物信息，应用这些信息可以了解结核病的发生、发展过程，并可以加 强对结核病的诊断、治疗和预防新措施的研究。

卡介苗(BCO)是至今为至唯一被批准使用的预防肺结核的疫苗，每年市场使用超过1亿 剂。但是卡介苗却不是理想的疫苗。虽然卡介苗对儿童有一定的保护作用，它对成人却没有 效用。

卡介苗是活菌疫苗。自从卡介苗由法国人在1908-1921年研制成功以后，菌株被各国实 验室在培养液中连续传代，一直到1961年低温(零下80度)冰箱的出现才被低温保存。最近 的基因库(Genome)研究表明，目前在全世界使用的十几种卡介苗已经不再是同一菌株，许多 基因片段已经失落．这是造成卡介苗保护效应减弱的原因之一，也解释了为什么旱期的临床 实验，卡介苗表现出很好的保护性(1930年，英国，80％保护率)，而后期卡介苗结果远不尽 人意?(1970年印度，0%保护率)（刘军，加拿大国家卫生院。肺结核（TB）的诊断与预防新 技术中国防痨杂志。2003，25，增刊：20-22)：1995每WHO也发表声明指出，BCG复种 没有科学依据，所以不提倡复种。BCG免疫失败也与下列因素有关(Baldwin SL,D，Souza C， Roberts A D,et al.Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pigmodel of  tuberculosis.Infect 1mmun 1998,66(6)：2951-2959)：(1)BCG不能提高由于其他因素已具有免疫 力人群的保护水平，(2)个体随着年龄增长，有可能继续接触到周围环境的分支杆菌抗原， 从而将该免疫反应从Thl型推向Th2型(这就是BCG预防儿童结核效果良好，而对成人效果 差的主要原因)。鉴于这种情况，一种合格的新疫苗应该可以恢复到Thl型的保护性鄯记性免 疫状态；因此，研制安全、有效、价廉的新一代疫苗成为一项紧迫而重要的工作．

热休克蛋白(heat shock protein,hsp)是一类具有重要生物和免疫功能的高度保守的蛋白质， 存在于原核和真核细胞中。分支杆菌hsp70包含多个T细胞和B细胞表位，免疫原性非常强， 具有免疫优势抗原(immunodominant antigen)的特点，能诱导出特异性Thl型细胞反应，并产 生r-干扰素(r-IFN)和白细胞介素12，对结核杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应 (Mckenzie.KR,Adams E,Britton WJ,et a1,Sequence and immunogenicity of the 70-kDa heat shock  protein ofMycobacterium leprae.J.Immune.1991；147：312-319.)。

B7-1(B7-1)是重要的具有免疫活化功能的共刺激分子(costimulatory molecule)之一。近年 来对免疫调控的研究表明，T细胞活化时，必需两个信号，即T细胞受体(TCR)与抗原递呈细 胞(APCs)表面的MHC-Ag结合产生的第一信号，和由共刺激分子提供的第二信号(协同刺激 信号)，如果缺乏协同刺激信号，T细胞则不能被完全活化而呈现无反应状态(Anergy)，或者 出现细胞凋亡(Apoptosis)。B7-1

(与其共刺激受体CD28和，或CTLA-4间相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号， 诱导T细胞产生r-IFN，对体液免疫和细胞免疫具有全面的活化作用，通过实验性自身免疫性 脑脊髓炎(EAE)模型，证明B7-1可以促进Thl型细胞反应(Orme 1 M.Progress in the development  of new vaccines against tuberculosis.Inl.J.Tuberc.Lung.Dis.1997；1(2)：95-100和Lenschow D  J,Walunas T L andBluestone J A.CD28/B7system of T cell costimulation.Annu.Rev.Iramunol. 1996；14：233.)。

r-IFN主要由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子，通过 增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗病毒、抗肿瘤作用。r-IFN的免疫调节作用 表现在对宿主免疫细胞的活性的影响，如对巨噬细胞可使其表面MHCII类分子的表达，增强 其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复活物、 抗体包被的病原体和肿瘤细胞。同时，对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，能增强 Thl细胞的活性，增强细胞免疫功能(HathcockKS,Laszlo GJ Pucillo C,et alComparitive  analysisofB7-1andB7-2costimulatoryligands:Expressionandfunction.J.Exp.Med 1994；180： 631-640.)。

由于BCG不能将免疫状态从TH2型转向THI型，导致了BCG作为疫苗预防结核病所存在的 缺陷性，透过选择分支杆菌hsp70基因与人B7-l基因在分子水平进行嵌合，构建成新型结核病 DNA疫苗；其中hsp70提供免疫特异性信号，诱导出特异性Thl型细胞反应，产生r-IFN和白介 素-12；B7-1提供第二信号即协同刺激信号，间接诱导T细胞产生r-IFN，全面活化细胞和体 液免疫。通过两者的共同作用，将人和动物的免疫状态由Th2型推向Thl型，达到预防和治疗 结核病和其他感染性疾病的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的嵌合型DNA疫苗。该嵌合型DNA疫苗为含有如下 蛋白质（a）或（b）的编码基因并能在体内将其表达的的pVAXI质粒：

（a）SEQ ID No.2所述的氨基酸序列所组成的蛋白质；

（b）在SEQ ID No.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 具有与（a）所述的蛋白质具有相同或相似功能的蛋白质。

其中，上述蛋白质的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所述。

其中，上述的编码基因连接在pVAXI质粒上，由pVAXI质粒的CMV启动子控制其表达。 具体可以连接在连接在pVAXI质粒的多克隆位点上，由CMV启动子操纵其表达；如使用Xba1 和Hind III双酶切的方式连入。

其中，上述嵌合型DNA疫苗，的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了嵌合型DNA疫苗在制备预防或免疫治疗结核病的药物中的用途，所述嵌合 型DNA疫苗为含有如下蛋白质（a）或（b）的编码基因并能在体内将其表达的的pVAXI质粒：

（a）SEQ ID No.2所述的氨基酸序列所组成的蛋白质；

（b）在SEQ ID No.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 具有与（a）所述的蛋白质具有相同或相似功能的蛋白质。

其中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

其中，所述蛋白质的编码基因由pVAXI质粒上的CMV启动子控制其表达。

其中，所述的pVAXI质粒的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述嵌合型DNA疫苗的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

本发明同时也提供了以上述的嵌合型DNA疫苗为主要活性成分制备成的预防或免疫治疗 结核病的药物。

上述嵌合型DNA疫苗中的蛋白质编码基因序列是可操作地连于pVAXI质粒中，以使其能 启动该蛋白质编码基因序列的转录。一般是由CMV启动子操纵其表达。如可以使用Xba1和 Hind III双酶切的方式连入pVAXI质粒中，由CMV启动子操纵其表达。

在以前报道的结核病防治研究中使用的pcDNA3.1-HSP70/CD80嵌合疫苗的载体是 pcDNA3.1(+),但是由于该载体具有氨苄青霉素的抗性，在大规模制备该载体以用于药品生产 的过程中会导致对氨苄青霉素敏感的生产者过敏反应，所以在后继研究中考虑转用其他的载 体进行嵌合型DNA疫苗的制备。在研发过程中意外的发现，使用pVAXI载体替换pcDNA3.1(+) 载体装载结核菌HSP70/人CD80嵌合蛋白的编码基因所制备成的嵌合型DNA疫苗，在用于结 核病预防和治疗具有明显更好的效果，尤其能诱导出更强的Th1型反应，也使实验对象的IFN- γ明显增高，并经过动物实验证明了其预防免疫和免疫治疗的效果均明显优于 pcDNA3.1-HSP70/CD8和卡介苗。因此使用pVAXI-HSP70/CD80制备结核病嵌合疫苗在提高了 安全性的同时，还出人意料的大幅度地提高了药效，具有更好应用前景。

附图说明

图1、pVAXI-Hsp70/CD80经内切酶Hind III和Xba I双酶切前后的琼脂糖电泳图。

图2、Western blot检测pVAX1/Hsp70/CD80转染293T细胞的蛋白质24、46、72小时 真核表达结果。A：转染24、48、72小时后293T细胞Hsp70蛋白表达，M为Marker，1、3 和5为未转染，2为转染24小时后，4为转染48后，6为转染72小时后；B：转染24、46、 72小时后293T细胞CD80蛋白表达，各泳道分布同A；C：稳定转染293T细胞Hsp70蛋白 表达，M为Marker，1为未转染，2为稳定转染；D：稳定转染293T细胞CD80蛋白表达， 各泳道分布同C。

图3、pVAXI-Hsp70/CD80mRNA各时段体内表达分布的RT-PCR结果。 pVAXI-Hsp70/CD80mRNA体内表达分布RT-PCR检测接种7天和接种15天肌肉、淋巴结、骨髓、 脾、肝、肺、肾、胸腺组织均有Hsp70和CD80表达。接种30天在肌肉、肺和肝有Hsp70表 达，未见CD80表达。180天Hsp70/CD80均未检测出表达。

图4、Rear time PCR检测IFN-γ和IL-4基因表达的结果。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件， 例如Sambrook J,Russell D.W.,2001,Molecular Cloning:A laboratory manual(3rd ed), Spring Harbor Laboratory Press中所述的条件。或按照制造厂商所建议的条件或本领域的 惯常实验条件。

实施例一 本发明pVAXI-Hsp70/CD80载体的构建和鉴定以及生物活性

（一）材料及试剂：

1.1材料和设备

pVAXI质粒g够自invitrogen公司；LIPOFECTAMINE2000脂质体转染试剂够自 invitrogen公司；pcDNA3.1-Hsp70/CD80真核表达为本实验室前期构建保存，也可根据现有 技术的记载构建（中国专利ZL200410001785.0，公开号CN1562362）；感受态细胞E.coli DH5α 购自于Invitrogen公司；人胚肾细胞293T购自中科院细胞库；SPF级雌性健康BALB/c小鼠 20只购自第三军医大学；限制性内切酶HindIII、XbaI、T4连接酶购自New England Biolabs （NEB公司）；DNA片段回收试剂盒购自大连宝生物公司；Endofree Plasmid Giga Kit购自 Qiagen公司；Lipofectamine LTX and Plus Reagen购自于Invitrogen公司；鼠抗结核杆菌Hsp70 单克隆抗体购自Lifespan Biosciences公司；鼠抗人CD80单克隆抗体购自abcam公司；Western  blot试剂购自上海碧云天生物公司；总RNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京天根生化；TaKaRa  RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自大连宝生物；Sso Fast Eva Green Supermix购自Bio-Rad公司； 核酸蛋白成像仪：BIO-ROD；Real-Time PCR扩增仪：iCycler iQ。

1.2方法

1.2.1重组质粒pVAXI-Hsp70/CD80的构建与鉴定

用Hind III和XbaI双酶切以前构建的质粒pcDNA3.1-Hsp70/CD80和载体PVAX1，用 T4连接酶将目的基因Hsp70/CD80定向连接入Hind III和XbaI双酶切好的PVAX1中，构建 质粒PVAX1-Hsp70/CD80。酶切鉴定并送上海生工生物公司测序。

pVAXI-Hsp70/CD80经内切酶Hind III和Xba I双酶切前后的琼脂糖电泳图见图1。电 泳结果符合预期，表明其建立成功。送上海生工生物公司测序后证实该质粒构建成功，其核 苷酸序列见SEQ ID No.4。

将PVAX1-Hsp70/CD80质粒按常规方法转化入DH5α。用QIAGEN公司去内毒素级质 粒大量提取试剂盒按说明书方法提取纯化质粒DNA。

1.2.2pVAX1-Hsp70/CD80体外瞬时表达收集对数生长期的293T细胞，接种于6孔细胞培 养板。使细胞汇合度达到50%-80%时，按Lipofectamine LTX and Plus Reagen转染试剂说明书， 进行转染。分别于转染后24小时、48小时、72小时收获细胞，加入裂解液释放蛋白质，离 心取上清与5x上样缓冲液混匀并煮沸使蛋白质变性。SDS-page电泳、转膜。分别加入Hsp70、 CD80一抗4℃孵育过夜，洗膜后二抗孵育一小时。加入化学发光试剂置于核酸蛋白成像仪成 像。

1.2.3PVAX1-Hsp70/CD80体外稳定表达转染后培养24小时，按1×10⁴/孔接种于96孔细 胞培养板，并进行有限稀释。培养24小时后加入1000mg G418筛选。筛选10～14天后，有 大量细胞死亡，可见有抗性的克隆出现，以500mg G418维持，扩增培养。获得的稳定转染 细胞系命名为293T-HSP70/CD80。Western blot检测Hsp70、CD80蛋白表达，方法同上，结 果见附图2

实施例二、PVAX1-Hsp70/CD80在小鼠体内的分布和表达

1、动物实验 近交系BALB/c小鼠20只，饲养于独立通风换气笼（individually ventilated  IVC）系统中。动物按注射时间分为5组（每组3只）：7天组、15天组、30天组、180天组 和阴性对照组。分别为每个时间点小鼠股四头肌注射嵌合疫苗和7.5g/L布比卡因混悬液 （4∶1）125μl，含质粒100μg。对照组注射用生理盐水125μl。于注射后7、15、30和180 天取眼球血以及肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织冻存-80℃备用。

1.2.4.2RT-PCR检测Hsp70和CD80在小鼠体内的表达从肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、 肺、肾、胸腺组织中提取RNA，按天根总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书操作。按大连宝 生物TaKaRa RNA PCR Kit说明书，制备cDNA模板，并进行PCR反应。

引物序列为：

HSP70上游引物（SEQ ID No.5）：CGTCGTCTC GGTTCTGGAAGGTG，

HSP70下游引物（SEQ ID No.6）：CATTGAAGTAGGCGGGCGTCGTG：

CD80上游引物（SEQ ID No.7）：ACACGGAGGCAGGGAACATCACC，

CD80下游引物（SEQ ID No.8）：TGGGCGCAGAGCCAGGATCACA。

PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1、Real-time PCR检测小鼠脾脏组织中IFN-γ和LI-4表达从脾脏中提取总RNA，逆转录 制备cDNA。进行Real-time PCR反应。

引物序列为：

IFN-γ上游引物（SEQ ID No.9）：AACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG；

IFN-γ下游引物（SEQ ID No.10）：GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG。

IL-4上游引物（SEQ ID No.11）：TTTTGAACGAGGTCACAGGAGAGG；

IL-4下游引物（SEQ ID No.12）：CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG。

β-actin上游引物（SEQ ID No.13）：AGGGTGTGATGGTGGGAAT；

β-actin下游引物（SEQ ID No.14）：CTCGGTGAGCAGCACAGG。

反应完成后，用Bio-Rad iQ5软件进行分析，按照Pfaffl法计算相对表达量。结果见图 3。

实验分组：实验动物按接种时间分为5组（每组3只）：7天组、15天组、30天组和 180天组；阴性对照小鼠为生理盐水组。

布比卡因（Bbupivacaine）与质粒DNA结合后形成复合体保护并能够释放DNA,同时是一 种麻醉剂，可刺激肌细胞再生，从而提高肌肉组织细胞吸入DNA和表达的能力，所以在此实 验中作为佐剂。分别在每个时间点（7天、15天、30天、180天）为小鼠股四头肌注射嵌合 疫苗100μl和7.5g/L步比卡因混悬液25μl,及（4∶1），共125μl,含质粒100μg。对照组注 射用水100μl。

RNA的分离：pVAX1-Hsp70/CD80嵌合疫苗接种小鼠后分别于7、15、30、180天取眼球血 以及肌肉、淋巴节、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织，冻存-80℃。总RNA的提取按照北京 天根生物技术有限公司动物组织总RNA提取试剂盒进行，RT-PCR细胞总RNA反转录oligo dT 引物,按大连宝生物公司RT-PCR试剂盒说明书进行。

RT-PCR结果：接种7天组和接种15天组肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺 组织均有Hsp70和CD80表达。接种30天组在肌肉、肺和肝有Hsp70表达，未见CD80表达。 180天组Hsp70/CD80天未检测出表达。结果参见图3.

Real-time-PCR（实时PCR）结果：取7天和15天和30天和180天组小鼠脾脏cDNA用 Real-time-PCR检测IFN-γ（γ干扰素）和LI-4（白介素-4）.其结果为七天和15天IFN- γ有高水平表达，结果参见图4。

实施例三pvAXI-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗对结核病免疫保护作用及机制研究

（一）试验方法。

1、实验材料：

去内毒素级质粒纯化系统（Qiagen公司）。IFN-γ，IL-4、（Miltenyi Biotec公司）。

DNA质粒的制备：用去内毒素级质粒纯化系统制备pVAXI-Hsp70/CD80和 PcDNA_3.1-Hsp70/CD80质粒。

2、实验分组造模及处理：

动物分组：按照随机数字表随机分组，实验动物为6-8周龄、清洁级的健康小鼠C57BL/6N， 体重约在18±2g，雌雄各半，购自重庆医科大学实验动物中心。分为空白对照组（简称对照 组）、BCG疫苗组（卡介苗组，简称BCG组）、结核病实验模型组（简称结核组）、pcDNA3.1- Hsp70/CD80嵌合DNA载体组（简称载体组）和pVAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗组（简称疫 苗组），每组10-20只。

动物预防免疫（在结果表中简称免疫）：先免疫后感染，各实验组分别按要求注射 pVAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗，pcDNA3.1-Hsp70/CD80嵌合DNA载体各100ug（0.5mL）， BCG组按体重注射BCG；空白对照组和结核病实验模型组注射生理盐水0.5mL。注射部位均为 两侧胫前肌，每侧剂量各半，接种操作参照实施例二。接种2周和4周后各按原方案加强接 种一次。第三次免疫后第14天时除空白对照组外的各组的每只小鼠尾静脉注射10⁴-10⁵CFU结 核杆菌H37RV（结核杆菌H37RV标准菌株来源于四川省结核病防治所）。

动物免疫治疗（在结果表中简称治疗）：分组和操作基本同上述预防免疫试验，但是进行 “先感染后免疫”，即除空白组外的各组进行结核杆菌攻击在前，相应的DNA疫苗或卡介苗 的接种在后(空白对照组则仅注射生理盐水)。各组接种时间为H37RV攻击后的第7天、第14 天和第28天各一次。

IL-4、γ-INF的体外检测：预防免疫试验各组在H37RV尾静脉注射两周后，动物免疫 治疗试验的各组在第二次疫苗接种后14天后处死动物。取血清进行IL-4、γ-INF检测，检 测方法按晶美公司小鼠ELISA检测试剂盒说明书。

病理改变观察：观察小鼠肝、脾组织涂片、切片病理改变及以及培养结核杆菌记数。

统计学处理方法：采用SPSS for windowsl0.0统计软件包进行数据处理

3、结果：

3.1、γ-IFN、IL-4的体外检测结果见表1：

表1γ-IFN、IL-4的检测结果(ⅹ±SD)

表1结果表明：预防免疫试验各组和免疫治疗试验各组小鼠BALF中γ-IFN和IL-4水平。与 结核病模型组小鼠比较，pcDNA3.1-Hsp70/CD80嵌合DNA载体组（简称载体组）和 pVAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗组（简称疫苗组）小鼠BALF中γ-IFN水平都明显增高，差异极 显著；而载体组和疫苗组有明显差异。与结核病模型组小鼠比较,载体组和疫苗组IL-4明显 增高差异极显著；而载体组和疫苗组之间有明显差异，疫苗组明显高于载体组。pcDNA3.1- Hsp70/CD80嵌合DNA载体组（简称载体组）和pVAX1-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗组（简称疫苗组） BALF中γ-IFN水平和IL-4水平均明显高于BCG组，差异极显著。

3.2、肝、脾组织涂片(Z-N)染色

处死动物，取肝、脾组织涂片(Z-N，萋-尼氏)染色，结果见表2。

表2肝、脾组织涂片(Z-N)染色结果

表2中：+：为50个菌落以下，++：为500个菌落以下，+++：为1000个菌落以下，++++： 为5000个菌落以上。

3.3、肝、脾结核菌培养菌落记数

处死动物取肝、脾组织研磨后培养，并取少量组织进行涂片；结果见表3。

表3肝、脾结核菌培养菌落记数

注，+：为50个菌落以下，++：为500个菌落以下，+++：为1000个菌落以下，++++： 为5000个菌落以上。

表2、表3结果表明：预防组和治疗组小鼠BALF；与结核病模型组小鼠比较，疫苗组和对 照组小鼠BALF肝、脾组织涂片(Z-N)染色结果中菌落数为阴性，疫苗组和对照组小鼠BALF肝、 脾组织结核菌培养菌落为阴性。说明本发明pVAX1-Hsp70/CD80嵌合疫苗在结核病的预防和免 疫治疗两方面的效果均明显优于现有的pcDNA3.1-Hsp70/CD80质粒，且在安全性方面更有保 证，具有更好的应用前景。