血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备及其XY精子免疫分选法

摘要

本发明公开了血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备及其XY精子免疫分选法。利用生物信息学方法预测并筛选出血清学H-Y抗原基因DBY的3个B细胞表位抗原肽，连接、重组、原核表达，得到了高纯度的DBY重组抗原肽。以重组抗原肽为抗原免疫新西兰大白兔，获得效价高、特异性强的多克隆抗体。利用DBY抗体结合流式细胞技术分选出约63.2±4.5%精子。本发明建立了以血清学H-Y抗原基因DBY抗体为基础的X和Y精子的免疫分选法，利用该抗体来分离X和Y精子，可建立简单、高效、安全的性别选择的理想方法，可更好地控制种用品种（或品种）的遗传改良，获得更快的遗传进展和畜牧业生产与管理的效率优势。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种血清学H-Y抗原基因DBY重 组抗原肽，及其血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备和XY精子免疫分选法。

背景技术

雄性特异性弱组织相容性抗原（Male specific minor histompatibility antigens， H-Y抗原）最初发现是作为一种异性间移植抗原，为雄性动物特有的物质，在 雄性个体中无组织和器官特异性。随着研究的深入，人们发现H-Y抗原是糖蛋 白，存在于雄性哺乳动物细胞表面。H-Y抗体在哺乳动物性别鉴定和控制的理 论和实践研究上具有重要意义，国内外多个实验室生产了H-Y抗原抗血清及单 克隆抗体，并进行了胚胎的性别鉴定和控制，但由于其抗原的特异性较弱和复 杂性，抗体实际应用效果不理想，未能在生产中得到广泛应用。

雄性传递偏移现象和性别偏移现象的发生证明了X和Y精子间存在非共享 蛋白(Hendriksen et al.,1996),同时血清学H-Y抗原部分抗原表位的成功鉴定、X 和Y精子免疫学分离实验结果以及Y精子特异性蛋白的检测结果都为X和Y精 子膜蛋白差异的存在提供了间接的证据(Grant et al.,2008;Robbins et al.,2008; Zhang et al.,2008)。Blecher等（1999）用色谱柱得到相对保守的牛精子性别特 异性蛋白(Sex specific proteins，SSPs)，研究发现SSPs抗体可引起约半数的牛 精子凝集，未凝集精子体外受精，生产出90％以上雄性胚胎；Souza等(1999) 纯化并产生了一个针对19kDa的牛精子膜蛋白的单克隆抗体，流式细胞仪分析 显示结合约60％的精子，免疫组化仅有雄性组织被染色。然而，到目前为止， 仍未见用上述法产生性别控制后代的实际应用研究报道。

利用H-Y抗原进行胚胎早期性别鉴定和精子的分离应用于生产研究。无论 是应用免疫技术分离X精子与Y精子，还是进行胚胎的性别鉴定，都必须依赖 高纯度、高效价的特异H-Y抗体。早期研究已分别采用雄性动物细胞免疫雌性 动物的方法和单克隆抗体技术来制备H-Y抗体，但其特异性不强，且操作繁琐。 H-Y抗体纯度低、效价不高，这些都限制了H-Y抗体的应用及H-Y抗原的研究。 Y精子的血清学H-Y抗原是一弱自身组织抗原，这为H-Y抗原候选蛋白和抗体 的筛选带来了挑战，借助基因序列信息和生物信息学技术来筛选血清学H-Y抗 原的候选抗原表位，为血清学H-Y抗体的研究提供了新技术途径。

DBY基因为血清学H-Y抗原的候选基因之一，定位于Y染色体短臂末梢 AZFa区域Xp11.3-11.23，含有17个外显子，编码660个氨基酸残基，为ATP依 赖性RNA解螺旋酶，是DEAD-Box(天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序 列)RNA解旋酶基因家族成员之一。DBY的转录子仅在雄性胚胎细胞中检测到， 在胚胎性腺发育17.5天DBY基因表达水平达到最高峰，出生后有所降低，但在 成年雄性性腺中仍维持较低水平；可育小鼠精子中，DBYmRNA被选择性保留， 并且在受精时通过反转录聚合酶链反应转移到卵子内，在雄性小鼠合子早期受 精卵发育中起重要作用。同时DBY基因编码一个仅在睾丸中表达的短转录子， 由此推断DBY在精子发生过程中起重要作用。

由于DBY基因与X染色体上的对应基因Dbx有较高的同源性，这为DBY 特异性抗体的制备带来很大的难度。利用生物信息学方法分析DBY与DBX间 的同源性，去掉高度同源序列区域，在序列差异区域选择DBY特异性抗原表位 为特异性抗体的制备提供了新的思路。在本发明中我们通过选取具有代表性和 应运广泛性的几个软件模型来研究DBY蛋白的线性B细胞表位，全面分析了 DBY蛋白的生物特性。分别进行跨膜区分析和序列比对去除同源区，利用在线 软件预测获得优选序列区域，最后用独立软件进一步筛选，综合评价得出抗原 肽序列。小鼠DBY蛋白的空间构象相关信息还没有公布，而没有分析其构象表 位，所以在DBY抗原肽筛选中我们选取了3段序列，用于下游实验抗原肽表达 的参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种DBY重组抗原肽，及其基于血清学H-Y抗原基因 DBY的抗原表位抗体的制备方法和XY精子免疫分选法。

一种DBY重组抗原肽，包含以下三段蛋白序列：

DBY-Ⅰ

KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY

SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER

SGHSRWSDRSDEDDWSK

DBY-Ⅱ

SIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVAT

DBY-Ⅲ

SRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGG

GGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDWWGN。

一种DBY重组抗原肽，蛋白序列如下：

KSSDNQNGGGN TESKGRYIPPHLRNRET SKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY

SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER

SGHSRWSDRSDEDDWSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILV

ATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGS

SHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDWWGN。

血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备方法，是以上述的重组抗原肽为抗原免 疫试验动物，获得多克隆抗体。

所述的重组抗原肽的制备过程如下：

提取雄性小鼠脑组织中总RNA，再用逆转录合成cDNA第一链，设计特异 性引物

，将3段DBY抗原肽核酸片段扩增出来；将抗原肽核酸片段分别克隆进入 pMD18-T载体，筛选阳性质粒，经双酶切（见表1）后，将DBY1、DBY2和 DBY3核酸片段用T4连接酶连接后克隆入pET-32a表达载体中，筛选出阳性克 隆质粒pET-32a-DBY，然后进行原核表达，获得的DBY重组抗原肽进行纯化。

XY精子免疫分选法，以上述制备的抗体与动物精子进行免疫反应，来鉴别 或者分离X和Y精子。

所述的动物精子包括小鼠的精子。

本发明的创新性在于：

精子分离需要X和Y精子之间存在可检测的差异，到目前为止，只有利用 DNA结合的染料直接检测DNA含量的流式细胞分离X和Y精子是行之有效的 方法，在牛性别选择方面得到商业应用（准确度可达90％以上）。但使用流式 细胞仪作为性别选择常规工具应用于动物育种是相对低效的，因为每单位时间 内产生的精子是有限的，性别控制精液的精子数量比正常精液低，；需要价格 昂贵的专门设备(Seidel,2003)、专利授权和操作高度熟练的的技术人员 (Hendriksen,1999)，此法未得到广泛应用。而且精子在分离、后续的处理、保存、 使用等阶段都可能受到许多因素（高度稀释、核染色、机械高压、激光照射、 离心、冷冻等）的损害，使得分离精子活力、精液的密度等精子的常规性状受 到影响，导致牛性控后代出现个体差异(Rath et al.2009，陆阳清，2005，Spinaci et al.,2006;Bermejo-et al.,2008)。免疫学分选方法可避免或减少与 DNA含量检测有关的影响。本发明探求X和Y精子表面的特异性标记蛋白的序 列和结构信息，首次利用Y精子特异性表面抗原（血清学检测H-Y抗原复合物） 的候选基因DBY抗原表位制备抗体，建立了简单、高效的X和Y精子免疫学 分选法。

附图说明

图1为pET-32a-DBY诱导表达结果图；

1：37℃,0h；2：37℃,1h；3：37℃，3h；

4：37℃，6h沉淀；5：37℃，6h上清；

6：30℃，6h沉淀；7：30℃，6h上清；

图2为DBY多肽抗血清与雌鼠脾细胞进行细胞免疫荧光反应结果（200倍）；

图3为DBY多肽抗血清与雄鼠脾细胞进行细胞免疫荧光反应结果（200倍）；

图4为小鼠精子细胞免疫荧光反应统计结果；

图5为DBY多肽抗血清与小鼠精子反应结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

1、DBY抗原肽的生物信息学预测和筛选

利用DNAStar软件PROTEAN program（Gamier-Robson program）、在线 蛋白质分析工具ABCpred servers(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、 BepiPred1.0servers(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)等生物信息学技术， 分别从蛋白质跨膜区、一级结构同源性、二级结构、亲水性、可塑性、表面可 极性以及抗原指数等方面，综合分析DBY蛋白全序列的结构特性，同时我们对 DBY蛋白进行跨膜区预测。雄性个体的DBY与雌性个体的DBX进行序列比对， 去除冗余序列和同源的重复序列进一步缩小预测范围。最后结合在线线性B细 胞软件预测结果筛选出3段DBY抗原肽序列（DBY-Ⅰ，DBY-Ⅱ，DBY-Ⅲ， 见序列表）。

2、DBY抗原肽的原核表达

利用Trizol法提取雄性小鼠脑组织中总RNA，再用逆转录试剂盒合成cDNA 第一链，根据3段DBY抗原肽序列（DBY-Ⅰ，DBY-Ⅱ，DBY-Ⅲ）设计特异 性引物（见表1），将3段DBY抗原肽核酸片段扩增出来。将抗原肽核酸片段 分别克隆进入pMD18-T载体（大连宝生物工程有限公司），提取重组质粒进行 PCR鉴定和测序验证。然后用原核表达载体pET-32a（大连宝生物工程有限公 司），进行原核表达，获得的DBY抗原肽（见序列表）用His纯化试剂盒进行 纯化。

表1DBY抗原肽引物设计结果

3、DBY抗原肽的抗体制备

用无菌注射器取纯化后的DBY抗原肽融合蛋白（用无菌生理盐水稀释）， 与等体积的CFA（弗氏完全佐剂）充分混匀。于颈部、背部、腹部皮下多点注 射免疫成年雌性新西兰大白兔，剂量为500ug/kg（蛋白量/兔的体重），进行首 免。

按照上述方法将纯化的DBY融合蛋白与等体积的IFA（弗氏不完全佐剂） 混合并乳化，分别在免疫后的第14天、28天、38天进行多点皮下注射，剂量 为250ug/kg（蛋白量/兔的体重），最后一次免疫后10天，心脏采血收集血液， 将全血置于室温静置2h后离心，3000r/min15min，收集血清。

4、细胞免疫荧光实验

1）取昆明白成年小鼠采用眼眶放血，断颈处死；

2）75%酒精浸泡消毒小鼠，转入超净工作台，无菌操作取脾放入，用6ml PBS 漂洗，剔除结缔组织和脂肪；

3)将脾脏移入另一个平皿中，加入6mL PBS，用灭菌注射器吸取营养液插入脾 脏一端推注，将脾细胞吹出，反复冲洗多次，并用镊子轻轻挤压脾脏；

4)将细胞悬液移入有盖试管中，冰浴静置5min，取上清移入离心管中，4℃， 1000prm离心，10min，弃上清；用6mL PBS再悬浮，加入6mL红细胞裂解液， 轻轻混匀，冰浴静置5min；

5)4℃，1000prm离心10min，弃上清去除红细胞，用PBS重悬细胞，于4℃， 3000prm离心10min，弃上清；

6)用PBS重悬细胞(沉积的细胞恢复1mL容积，即为约1×10⁷/mL的细胞悬液)， 紫外灯照射灭菌备用。

5、精子流式细胞实验

精子的准备

1)取冷冻小鼠精子在37℃水浴10秒解冻，并将精子放入离心管中。 900g离心10min，去掉上层液体，保留沉淀，并用PBS清洗2次。

2）按1:5的比例稀释精液，进行精子计数，稀释成终浓度为1×10⁷/100(个/μl)， 分装成100μl一管；

实验步骤

1）取3管制备好的精液，第一管加入等体积DBY多肽抗血清，第二管加 入等体积对照血清，第三管加入等体积精子稀释液，混合均匀，37℃孵育1h， 900g离心10min；

2）去上清，加入5ml精子稀释液重悬洗涤精子，900g离心10min，去上清， 重复2次；

3）加入100μl精子稀释液重悬，加入FITC标记山羊抗兔荧光二抗至终浓 度1μg/100μl，37℃孵育1h，900g离心10min；

4）去上清，加入5ml精子稀释液重悬洗涤精子，900g离心10min，去上清， 重复2次；

5）加入100μl DAPI工作液，室温孵育5min，900g离心10min；

6）去上清，加入5ml精子稀释液重悬洗涤精子，900g离心10min，去上清；

7a）加入100μl精子稀释液重悬，荧光显微镜下进行镜检。

7b）加入500μl精子稀释液重悬，进行流式细胞分析。

6、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）方法验证XY精子分离

取少量小鼠精液经洗后制片，用二梳苏糖醇和二碘水杨酸锂处理，使精子 头部紧密的染色质去凝集，然后与生物素标记的Y染色体特异的BRY4a 探针作原位杂交；用Ｃｙ3－链亲和素检测杂交信号。BRY4a扩增引物序 列如下：5’TGTACTTCATGTATTAAAACAAAACAC3’和 5’CAAGACCATACATATGTCATTATAGACAG3’.

结果

DBY重组抗原肽原核表达

结果显示DBY-Ⅰ在350bp、DBY-Ⅱ在100bp和DBY-Ⅲ在150bp，其条带 特异亮度很高，都与预期片段大小一致。将3个DBY基因片段PCR产物回收 后分别与pMD18-T载体连接，用PCR方法筛选阳性质粒，经双酶切后，结果 复合预期目的片段大小。将DBY-Ⅰ，DBY-Ⅱ，DBY-Ⅲ用T4连接酶连接后克 隆入pET-32a表达载体中，筛选出阳性克隆质粒pET-32a-DBY，经PCR扩增， 经10g/L琼脂糖凝胶电泳，结果显示与预期目的片段大小一致，表明 pET-32a-DBY重组质粒构建成功。pET-32a-DBY重组质粒经测序也与DBY基 因片段核酸序列一致。

重组质粒经诱导表达后，筛选诱导条件，跑SDS-PAGE电泳分析，确定诱 导条件，结果显示在30℃经IPTG诱导培养6h出现比较单一的目的条带，且为 可溶性表达（见图1）。诱导表达后的蛋白用Ni柱纯化试剂盒，去掉杂蛋白，获 得比较纯的DBY重组蛋白。

脾细胞免疫荧光实验

将对照血清和DBY多肽抗血清分别与雄鼠脾细胞和雌鼠脾细胞进行细胞免 疫荧光反应，结果显示DBY多肽抗血清与雄鼠脾细胞结合，发出绿色荧光；而 与雌鼠脾细胞有微弱的结合（见图2、3）。

精子细胞免疫荧光实验

应用精子细胞免疫荧光实验，将DBY多肽抗血清和未免血清分别与成熟精 子进行反应，并用FITC荧光标记，用于检测DBY多肽抗血清能否将X/Y精子 进行分离。我们用阴性血清和荧光二抗作为对照，DBY多肽抗血清组做三组平 行实验。在200倍视野下，每组随机取3个视野，统计每一个视野下发光精子 数和总数（图4），结果显示对照组精子都不发绿色荧光，而DBY多肽抗血清 组发光精子数占精子总数的61.0±5.1%。用SAS9.0软件对数据进行卡方检验， 卡方值χ²=4.79，荧光标记的精子数与没标记的精子数差异显著（0.01<P<0.05）， 基本符合Y精子理论值1：1(50%)。

为进一步确定DBY多肽抗血清的特异性，将DBY多肽抗血清与成熟精子 反应，然后进行流式细胞技术，结果显示DBY多肽抗血清能标记约63.2±4.5% 精子（每份精子总数为1×10⁴个）（图5）。

精子荧光计数和流式细胞技术结果基本吻合，说明我们制备的抗血清能区 分成熟X/Y精子，具有H-Y抗体的特异性。本研究制备的DBY抗原肽具有较 高H-Y抗原特异性，所形成的研究结果有助于揭示H-Y抗原的分子基础，为 H-Y抗原的相关研究和生产应用提供理论依据。

精子分离准确性评估

精子分离的精确性及有效性可通过分析X和Y精子分离的纯度进行评价， 即以分离精子性染色体种类判断（X或Y）是否准确或分离纯度的高低。精子 分离的效果常用荧光原位杂交技术(FISH)进行评价。FISH方法验证XY精子 分离结果中，在荧光显微镜下可清楚见到带有红色杂交点信号的精子判定为Y 精子。应用Y染色体探针杂交分离Y精子样本表明，Y精子纯度为87±2.7％， X精子所占比例为7±2.5％，这说明DBY抗体在进行X和Y精子免疫分选中， 可筛选出纯度较高的Y精子。FISH方法验证了利用DBY抗体进行小鼠X和Y 精子免疫分选法的可行性。该X和Y精子免疫分选法有助于建立简单、快速的 家畜性别控制方法，从而加速优质家畜育种进程，提高畜牧业的经济效益，促 进畜牧业发展。