裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌与鼻咽癌中的应用

摘要

本发明属于医药领域，提供了一种天然植物裂果薯及其总皂苷提取物的应用。该天然植物提取物为裂果薯（拉丁学名：SchizocapsaplantagineaHance）的总皂苷。本发明提供了裂果薯总皂苷提取物的提取技术和在抗肝癌、抗鼻咽癌治疗方面的应用。该提取物抗肿瘤活性强并具有一定的靶向性，经过血清药理学验证，该提取物经过吸收代谢后仍有很强的药物活性，并且该皂苷提取物可抑制肿瘤细胞VEGF、CD34的表达进而抑制肿瘤组织的微血管生成，抑制肿瘤生长。该提取物的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，有一定种植规模，廉价易得。本发明提供了一种有广阔前景的抗肿瘤提取物，为肿瘤的治疗增添了新的药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及裂果薯及其总皂苷提取物的应用。

背景技术

裂果薯，百合纲，百合亚纲，百合目，蒟蒻薯科，裂果薯属植物，拉丁学名：Schizocapsa plantaginea Hance，别名：屈头鸡、水狗仔、长须果、冬叶七、黑冬叶、箭根薯、客妈连、客妈七、马老头、米荷瓦、曲头鸡、水槟榔、水鸡仔、水萝卜、水三七、水田七、水虾公、田螺七、土贝母、土三七、小田螺七。多生于水沟边、田埂草地上。分布于江西、湖南、广东、广西及贵州等省区。以块茎入药，主治咽喉肿痛，急性肠胃炎，泌尿道感染，牙痛，慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡，风湿性关节炎，月经不调，疟疾，跌打损伤；外用治疮疡肿毒，外伤出血。目前裂果薯的化学成分已经有初步的分离研究，已经从中分离出超过40种单体物质，其化学成分包括：根茎含氨基酸、皂苷元如约茂皂苷元（yamogenin），甾族皂苷类（A-D）包括和裂果薯皂苷（lieguonin或taccaoside），多种甾族苦味成分箭根薯酮内酯（taccalonolide）A-M（高度氧化的甾体），黄酮和生物碱。并对其化学成分活性进行了初步的实验。从裂果薯中提取到的箭根酮内酯A(taccalonolide A)对P388肿瘤细胞有细胞毒作用，并且对鼠疟原虫有杀灭作用，最近的研究还表明箭根酮内酯A和E(taccalonolideAand E)是首个对微管具有类似于taxol作用的天然甾体，并已对其进行了一定的结构改造。C27 甾体皂苷taccaoside C和taccaoside D对人白血病CCRF-CEM 肿瘤细胞株有抑制作用，Eca一109(人类食管癌细胞)，SPC-A-1(人类肺腺癌细胞)，BGC一823(人类低分化胃腺癌细胞， AGS(人类胃腺癌细胞)，K562(人类慢性髓原白血病细胞)等六个肿瘤细胞均有抑制作用(IC50=1．90；6．6；6．5；5．1；8．9；7．9 μg／m1)。可见目前抗肿瘤研究主要集中在非皂苷类的多种甾族苦味成分箭根薯酮内酯taccalonolides,皂苷类仅见taccaoside C，约茂皂苷元（yamogenin）和裂果薯皂苷），裂果薯皂苷甲、乙（（lieguonin或taccaoside A-B）未见文献提及。这些研究仍主要停留在体外初步观察裂果薯活性成分的非特异性抗肿瘤作用，以特异性的、靶向性的针对肿瘤肝癌和鼻咽癌研究仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是利用从广西特色植物裂果薯的块茎中提取出的总皂苷对肿瘤进行治疗。

本发明提供了一种新的抑制肿瘤细胞的提取物，该提取物为裂果薯拉丁学名：Schizocapsa plantaginea Hance中提取的总皂苷成分和包含的各皂苷单体化合物成分。

裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用。

本发明中，肿瘤可以是人肝癌，鼻咽癌。

本发明首次利用裂果薯皂苷作为治疗肝癌，鼻咽癌的药物，在肿瘤细胞中加入所述的裂果薯总皂苷提取物(应包括：茂皂苷元（yamogenin），甾族皂苷类（A-D）)，该皂苷可以明显抑制肝癌细胞或鼻咽癌细胞的增殖，并对正常细胞抑制力较低。

裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用，是在肿瘤细胞中加入和在人肿瘤鼠移植模型中给予所述的裂果薯总皂苷提取物。

本发明中，将裂果薯总皂苷用于肿瘤细胞（例如肝癌细胞株SMMC-7721，BEL-7404和鼻咽癌细胞株CNE-1），结果显示裂果薯总皂苷在体外实验中对肿瘤细胞有明显抑制作用。经过将裂果薯总皂苷用于正常肝细胞HL-7702，对比证明裂果薯总皂苷对癌肿组织有明显的选择性。预示着裂果薯总皂苷在抗肿瘤方面有广阔的研究前景。

本发明中，将裂果薯总皂苷用于血清学实验。每日将裂果薯皂苷制成大鼠耐受剂量浓度的药液灌胃大鼠，连续七日后腹主动脉插管取血，离心取得血清。利用含药血清培养肿瘤细胞（例如肝癌细胞株SMMC-7721，BEL-7404和鼻咽癌细胞株CNE-1），结果显示含药血清对肿瘤细胞有明显抑制作用，证明裂果薯总皂苷经过吸收代谢后仍有抗肿瘤作用。提示裂果薯总皂苷可以口服给药。

肿瘤形成的过程中微小血管的形成对肿瘤组织的生长与扩散有很重要的促进作用。肿瘤细胞会促进组织内血管内皮生长因子（VEGF）的表达，使血管生长加速，微小血管增多，进一步促进瘤体的生长。

本发明中，将一定浓度的裂果薯总皂苷滴加到置于鸡胚绒毛尿囊膜上的无菌醋酸纤维滤纸上，继续孵育三天后取鸡胚绒毛尿囊膜置于显微镜下观察，发现鸡胚鸡胚绒毛尿囊膜上微血管生成明显减弱，且呈浓度依赖关系，提示裂果薯皂苷能减少微小血管的生成，对减少癌肿组织中的微小血管灌流有一定作用。

ELISA测定酪氨酸蛋白激（TPK）含量，裂果薯皂苷对酪氨酸激酶含量亦有抑制作用，但弱于索拉菲尼，说明裂果薯皂苷可通过抑制调控肿瘤细胞和血管生长的酪氨酸激酶发挥上述作用，达到靶向抗肿瘤作用。

本发明中，将裂果薯总皂苷用于裸鼠抑制瘤模型，结果显示裸鼠肿瘤的大小、重量随着给药剂量的增加而减小。HE染色结果发现裂果薯皂苷可致肿瘤细胞小片坏死，灶性坏死及小灶性坏死与不同程度的血管塌缩。免疫组化结果显示，裂果薯总皂苷可使肿瘤内微小血管减少。VEGF的表达染色显示，裂果薯总皂苷可使肿瘤组织VEGF表达量降低。

总的来说，裂果薯总皂苷除可直接抑制人肝癌和鼻咽癌细胞生长外，还可减少肿瘤组织中的血管生成，降低肿瘤组织的血液灌流，起到抑制肿瘤细胞和血管生长的作用，并可减少肿瘤细胞的血路转移。

本发明提供了一种新的治疗肝癌与鼻咽癌的药物，该药物为裂果薯的总皂苷成分。该药物原本应用于咽喉肿痛，胃肠炎，跌打损伤，本发明中首次对其在肝癌与鼻咽癌治疗的机理与应用进行研究，为癌症治疗提供了新的药物储备。该药物有对肿瘤组织有一定的选择性，并能抑制肿瘤微小血管的生成，是一种作用强大的抗肿瘤药物。

该提取物抗肿瘤活性强并具有一定的靶向性，经过血清药理学验证，该提取物经过吸收代谢后仍有很强的药物活性，并且该皂苷提取物可抑制肿瘤细胞VEGF、CD34的表达和TPK含量进而抑制肿瘤组织的微血管生成，抑制肿瘤生长。该提取物的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，现已有一定种植规模，廉价易得。本发明提供了一种有广阔前景的抗肿瘤提取物，为肿瘤的治疗增添了新的药物。

附图说明

    图1为测定含药血清体外抗肿瘤作用的细胞形态图 (100×)。图1-1是30%空白血清细胞图，从图中可以看出，细胞呈正常贴壁生长状态，有重叠生长现象，考虑为血清对细胞的促进生长作用所致，死细胞（漂浮细胞）较少，细胞轮廓清晰，透亮，胞浆中无颗粒；图1-2、图1-3、分别为30%索拉菲尼含药血清组、30%裂果薯皂苷含药血清组细胞图。与图1-1相比，图1-2、图1-3贴壁细胞变少，细胞生长缓慢，死细胞增多，细胞破碎，有明显碎片悬浮于培养基当中，说明含裂果薯皂苷代谢物血清对肿瘤细胞有抑制作用。

    图2为药物对裸鼠移植瘤重量的影响，﹡p<0.01（与阴性对照组相比）。

图3为药物对裸鼠移植瘤体积的影响，﹡p<0.01（与阴性对照组相比）。

图4是药物作用后经HE染色的细胞显微照片。HE染色后细胞核呈蓝色，类圆形，颜色较浅，坏死区域可见细胞核明显皱缩，变小，颜色较深。三五个肿瘤坏死细胞聚集称为小灶性坏死，小块肿瘤坏死细胞聚集称为灶性坏死，根据坏死区域的大小程度可划分小片状坏死，大片状坏死，大片状坏死区域内仅有散个肿瘤细胞。HE染色结果发现阴性对照组肿瘤细胞基本无细胞坏死现象，血管丰富，数量较多。（见图4-1）。索拉菲尼组可见有大片状坏死，小片状坏死及不同程度的灶性坏死，血管明显塌陷，萎缩，数目变少（见图4-2）；裂果薯皂苷高剂量组可见小片坏死，灶性坏死及小灶性坏死（见图4-3）；裂果薯皂苷中剂量组可见灶性坏死及小灶性坏死（见图4-4）；裂果薯皂苷低剂量组坏死部分较少，可见不同程度小灶性坏死（见图4-5）。裂果薯皂苷高中低剂量组均有不同程度的血管塌缩现象。图4-6为索拉菲尼组大片状坏死图（40×）。

    图5为不同药物治疗组对人肝癌SMMC-7721移植瘤中MVD的影响，﹡p<0.01（与阴性对照组相比），﹡﹡p<0.05（与阴性对照组相比）。

    图6是不同药物对人肝癌SMMC-7721移植瘤裸鼠CD34的表达情况影响。1:阴性对照组；2:索拉菲尼组；3:裂果薯皂苷高剂量组；4: 裂果薯皂苷中剂量组；5: 裂果薯皂苷低剂量组。

图7是不同药物治疗组VEGF表达情况。

    图8是肿瘤组织内VEGF的表达（100×），1:阴性对照组；2:索拉菲尼组；3:裂果薯皂苷高剂量组；4: 裂果薯皂苷中剂量组；5: 裂果薯皂苷低剂量组。VEGF的阳性表达染色呈棕黄色，主要弥漫于肿瘤细胞的胞膜和胞浆，细胞核呈蓝色，无阳性染色。阴性对照组中VEGF呈高表达状态（＋＋＋），由图（8-1）可看到大区域棕黄色染色。索拉菲尼组、裂果薯皂苷高剂量VEGF低表达（＋），肿瘤区域内有个别细胞呈阳性染色，与阴性对照组相比差异显著。

    图9为显微镜下（40×）各不同药物组鸡胚血管直观图。1：阴性对照组；2：索拉菲尼组；3：裂果薯皂苷低剂量组；4：裂果薯皂苷中剂量组；5：裂果薯皂苷高剂量组。

具体实施方式

裂果薯总皂苷成分的分离

    1.1醇提

    将药材粉碎后泡在约3倍体积75%的乙醇溶液中，回流提取2h。抽滤得到滤液。将药渣放回圆底烧瓶中加同样浓度、体积乙醇重复一次。合并两次药液，过滤，浓缩至浸膏，移入干净的瓶中备用。每100g干燥药材能提取浸膏约10g，产率为10%。

    1.2极性段萃取

    将上述所得浸膏与适量硅胶混合研磨至成干粉状，置于砂芯漏斗中，安装于抽滤瓶上，加入石油醚抽滤至抽出液无色，收集抽滤所得石油醚溶液旋转蒸发得到石油醚萃取组分，置于60℃烘箱中烘干备用。之后依次加入乙酸乙酯、正丁醇重复以上步骤。共得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三个组分。三组分产率为：石油醚组段20%；乙酸乙酯组段15%；正丁醇组段50%。

    1.3大孔吸附树脂处理

    将3~6g正丁醇组分溶于50倍体积的50%乙醇，缓慢通过（约1~2秒一滴）150ml的D101大孔吸附树脂柱，待液面接近树脂柱顶端时以150倍体积的50%、60%、100%乙醇依次冲洗。收集冲洗液，按不同浓度分别旋转蒸发浓缩，置于60℃烘箱中烘干备用。各洗脱物产率为：50%乙醇洗脱物73%；60%乙醇洗脱物19%；100%乙醇洗脱物7%。

    1.4大孔吸附树脂分离物药效测定

选取人肝癌细胞珠SMMC-7721，使用MTT法测定其IC50，结果如下：

由此可见，该分离方法能够很好的富集药物提取物中的抗肿瘤活性成分。提取所用溶剂低毒且可回收利用，分离柱可重复进行分离并可再生利用，经济高效。

    1.5洗脱组分的化学鉴定

    由鉴别试验可见，该分离方法所得皂苷成分纯度高，并且有很好的富集作用。

因此，D101大孔吸附树脂100%乙醇洗脱分离所得产物为本实验所述总皂苷提取物。

测定裂果薯总皂苷对人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7404、人鼻咽癌细胞CNE-1及人正常肝细胞HL-7702的杀伤作用

2.1药物的浓度配置

将裂果薯皂苷配成0.6mg/ml，以此为原液，对半稀释4次，共得到五个浓度的药液。在安全柜中0.22μm微孔滤膜过滤，保存于-4℃。

2.2 MTT法检测待测药物

2.2.1人肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7404的培养

选取人肝癌细胞珠SMMC-7721、BEL-7404分别置于培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。每日观察，视情况换液。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。细胞长势较好时，取一部分用冻存液冻存于-80℃低温冰箱中。一周后取冻存细胞于37℃水浴中快速溶解，复苏，观察细胞的存活情况。

2.2.2人正常肝细胞HL-7702的培养

选取人正常肝细胞HL-7702置于培养瓶中，用含10%胎牛血清、1μg/mL胰岛素的PRMI-1640培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。每日观察，视情况换液。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。细胞长势较好时，取一部分用冻存液冻存于-80℃低温冰箱中。一周后取冻存细胞于37℃水浴中快速溶解，复苏，观察细胞的存活情况。

2.2.3人鼻咽癌细胞CNE-1的培养

选取人鼻咽癌细胞CNE-1置于培养瓶中，用含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。每日观察，视情况换液。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。细胞长势较好时，取一部分用冻存液冻存于-80℃低温冰箱中。一周后取冻存细胞于37℃水浴中快速溶解，复苏，观察细胞的存活情况。

2.2.4 MTT法检测药物体外抑瘤作用

取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，吸管吹打成细胞悬浮液，显微镜下用血细胞计数板计数细胞。1×104/孔接种于96孔板中，每孔190μL。在培养箱中培养12h以上使细胞连续贴壁后，每孔加入10μL上述提取的不同浓度的药液，每个药液浓度做4个平行孔。继续培养24h，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，15分钟内用酶标仪在490nm波长处测OD值。重复测定三次。计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)=(对照组OD值-实验组OD值)／对照组OD值×100％。

2.3实验结果

裂果薯皂苷对BEL-7404，SMMC-7721、CNE-1、HL-7702细胞的IC50浓度分别为7.16 μg/ml，2.83 μg/ml，5.68μg/ml，42.38μg/ml。裂果薯皂苷对BEL-7404，SMMC-7721、CNE-1细胞抑制效果显著，并对正常细胞有一定区分作用，提示该提取物具有良好的抗肿瘤应用前景。

含裂果薯总皂苷代谢物血清的制备及体外抗肿瘤作用检测

3.1裂果薯总皂苷最大耐受量实验

取体重18~22g小鼠18只，雌、雄各半，随机分为3组，每组6只。分别为空白对照组和给药组，给药组又分为高剂量组与低剂量组。实验前小鼠禁食12h，不禁水。空白对照组灌服生理盐水，给药组灌服裂果薯总皂苷。裂果薯总皂苷高剂量组为300mg/kg，低剂量组为100mg/kg。每个剂量按1mL/1g灌服，3次/d，间隔8h。连续14d观察小鼠死亡、中毒及活动情况，并记录小鼠的体重变化。以刚好没有小鼠死亡的剂量作为该受试药物的最大耐受量。

3.2大鼠灌胃剂量的确定

根据裂果薯皂苷最大耐受量实验，参照动物每公斤体重折系数表，将大鼠的给药剂量确定为300mg/kg/d。索拉菲尼依据临床参考剂量折算确定灌胃量为360mg/kg/d。将药物溶于蒸馏水，配成20mg/mL。索拉菲尼混悬于0.5%羧甲基纤维素钠中制成24mg/mL。

3.3制备含药血清

取200±20g大鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只。分别为空白对照组，索拉菲尼组，裂果薯皂苷组。根据以上所配置药物剂量，按1.5mL/200g灌服，2次/d，间隔12h，连续灌胃7天。最后一次灌胃1h后，10%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血。所取得血液常温中静置1h，5000rpm离心5min，收集血清。同组血清混匀，0.22μm微孔滤膜过滤。56℃，30min灭活。保存于-20℃。

3.4 MTT法检测含药血清的体外抗肿瘤活性

取对数生长期SMMC-7721、CNE-1细胞接种于96孔板，接种密度为1×104/孔，细胞贴壁完全后，吸去上清，加入无血清的培养基，血清饥饿24h后吸去上清液，加入不同浓度的含药血清（含药血清在培养体系中的体积比分别为5%，10%，15%，25%，30%）的培养基200μL，每组设3个复孔，继续培养48h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，15分钟内用酶标仪在490nm波长处测OD值。重复检测三次。计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)=(空白血清组OD值-含药血清组OD值)／空白血清组OD值×100％。

3.5实验结果

3.5.1、含药血清体外抗肿瘤试验结果

索拉菲尼组、裂果薯皂苷组均有不同程度的体外抑制肿瘤细胞的作用。其中，15%、25%、30%的索拉菲尼组含药血清对SMMC-7721的抑制率分别为15.49%、24.65%、32.26%， 10%、15%、25%、30%裂果薯皂苷组含药血清组为11.15%、17.12%、25.31%、27.30%。

15%、25%、30%的索拉菲尼组含药血清对CNE-1的抑制率分别为13.12%、22.67%、34.88%， 10%、15%、25%、30%裂果薯皂苷组含药血清组为13.81%、18.59%、24.33%、30.18%。

与空白血清组相比，组间差异显著，具有统计学意义（p<0.01）。10%裂果薯皂苷含药血清组与10%索拉菲尼含药血清组相比，其体外抑瘤作用显著（p<0.05）。

表1含药血清体外对SMMC-7721作用影响( ±s, n=6)

Table1 The In vitro antitumor effect of medicated serum(±s, n=6)

表2 含药血清体外对CNE-1作用影响(±s, n=6)

Table2 The In vitro antitumor effect of medicated serum(±s, n=6)

    该结果证明裂果薯皂苷经过口服吸收代谢后仍然具有抑制肿瘤的作用，说明其具有体内作用并且有可能口服给药。

免疫组化法测定裂果薯总皂苷对人肝癌裸鼠模型肿瘤组织内CD34、VEGF表达的影响

4.1人肝癌裸鼠模型的建立

选取3-4周龄，体重16~18g的裸鼠32只，雌雄各半。取对数生长期的肝癌SMMC-7721，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，用PBS制成细胞悬浮液，调制成5×107ml-1，在裸鼠的一侧腋窝皮下，分别接种0.2ml细胞悬浮液。在接种后第15d，选择接种成功的裸鼠，随机分为5组，每组6只，雌雄各半，分别为空白对照组，索拉菲尼组，裂果薯皂苷高、中、低剂量组。将裂果薯皂苷溶于灭菌双蒸水中配置成不同浓度，裂果薯皂苷组分别灌服40mg/kg/d、20mg/kg/d、5mg/kg/d，索拉菲尼组给予30mg/kg/d。0.1ml/10g，1次/d，连续灌胃21d。空白对照组不做任何处理。从给药第一天开始，每隔1天称量裸鼠体重，游标卡尺测量肿瘤最长径(A)和与其垂直径长（B），按公式计算肿瘤体积（V）。颈椎脱臼处死，取瘤组织，称瘤重，解剖裸鼠，观察肿瘤转移情况，计算抑瘤率，肿瘤相对体积（RTV）。取肿瘤组织，浸入10％甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色及免疫组化染色。

 

4.2免疫组化法检测肿瘤组织内VEGF、CD34的表达

实验中每组均设阴性阳性对照染色，阳性对照分别为肝癌，阴性对照用同种组织切片以PBS代替性第1抗体。

烤片：石蜡切片放置于60℃恒温箱中烘烤20min。脱蜡、水化：常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，二甲苯Ⅰ20min--二甲苯Ⅱ20min—100%酒精10min—95%5min—80%5min—70%5min。0.01MPBS液（pH7.4）洗三次，每次5min。抗原修复：VEGF(碱性修复)：将组织切片置于装有沸腾的EDTA缓冲液（PH8.0±0.1）烧杯中，煮沸20min后，置于室温冷却。CD34（酸性修复）：将1500ml 0.01M枸橼酸缓冲液（pH6.0）置于不锈钢高压锅内，煮沸后放入切片，继续加热至喷气，喷气开始计时，1.5min后用自来水冲洗冷却至室温。取出切片用PBS冲洗三次，每次5min，除去PBS液。每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育10min。PBS冲洗3次，每次5min。滴加一抗50ul，4℃下冰箱孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3min。滴加50ul二抗试剂C，37℃孵育10min。PBS冲洗3次，每次5min。滴加二抗试剂D50μL，37℃孵育10min。PBS洗3次，每次5min。滴加50ul新鲜配制的DAB溶液反应染色，显微镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，透明，干燥，中性树胶封片。

VEGF是肿瘤细胞胞浆抗原，判定切片染色后肿瘤细胞及内皮细胞胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张切片随机选取5个高倍视野（×100）进行结果判定。按照染色的强度和阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比进行综合计分。按染色程度计分：未染色0分，浅色1分，中度染色2分，强阳性染色为3分。阳性细胞百分率：染色细胞数＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞51%为3分。将每张切片的染色程度与染色细胞百分率各自相加后为其最后得分。0分计为阴性(－)，1～2分计为（+），3～4分计为(++)，5～6分计为(+++)。

CD34位于胞膜和胞浆，细胞胞膜和胞浆呈棕黄色为表达阳性。参照Weidner的方法，在低倍镜下（×100）选择微血管密集区，即hot-spots，然后在高倍镜下（×400）随机选择５个视野计数微血管数目，取５个视野平均值作为 MVD值（个微血管/×400）。微血管的统计标准：肿瘤区域内任何细胞膜染色呈棕黄色的单个或多个内皮细胞、且与周围肿瘤细胞及间质细胞有明确分界者，计数为1个微血管；肌层比较厚的血管不被计数；管腔超过８个红细胞直径的血管不被计数；排除纤维化及边缘反应区、出血区域等。

4.3实验结果

4.3.1、人肝癌裸鼠移植瘤的一般情况及生长特征

整个处理过程中，给药前期，药物处理组、对照组裸鼠精神状态良好，未有明显的不安，多动或者拒食现象。裸鼠接种后约5~6天皮下肿瘤开始生长，肉眼可见瘤体呈局限性膨胀生长，手指按压可触及包块，有包膜。32只裸鼠无一例重复接种，其中30只裸鼠成瘤，成瘤率93.75%。至实验结束，全部裸鼠存活。瘤体呈类球形，有结节状，偏硬，可滑动。肿瘤附近及瘤块可见丰富血管，与肌肉、皮肤相粘连，基底部可见不同程度的浸润，部分可至肌肉和肋骨。

4.3.2、裂果薯皂苷、索拉菲尼对人肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤的影响

结果表明，各不同药物治疗组与阳性对照索拉菲尼组均能不同程度的抑制人肝癌细胞移植瘤的生长。灌胃给药后，索拉菲尼组、裂果薯皂苷高剂量组、裂果薯皂苷中剂量组的肿瘤瘤重与阴性对照组相比明显下降，其差异具有统计学意义（p<0.01）。索拉菲尼组、裂果薯皂苷高剂量组、中剂量组的肿瘤相对体积（RTV）为别为3.56±0.59、3.83±0.62、5.21±0.77，与阴性对照组的RTV7.27±0.55相比，均显著减少（p<0.01）。各治疗组中，索拉菲尼与裂果薯皂苷高剂量组对肿瘤的抑制率最为明显，为别为51.75%，47.71%。见表3。

表3不同治疗组对人肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤的影响

Table 3 Effect of different drug treatment group of human liver SMMS-7721 transplant tumors

﹡p<0.01（与阴性对照组相比）

4.3.3、不同药物组对肿瘤生长及其血管情况的影响

正常肿瘤细胞经HE染色后细胞核呈蓝色，类圆形，颜色较浅，坏死区域可见细胞核明显皱缩，变小，颜色较深。三五个肿瘤坏死细胞聚集称为小灶性坏死，小块肿瘤坏死细胞聚集称为灶性坏死，根据坏死区域的大小程度可划分小片状坏死，大片状坏死，大片状坏死区域内仅有散个肿瘤细胞。HE染色结果发现阴性对照组肿瘤细胞基本无细胞坏死现象，血管丰富，数量较多。索拉菲尼组可见有大片状坏死，小片状坏死及不同程度的灶性坏死，血管明显塌陷，萎缩，数目变少；裂果薯皂苷高剂量组可见小片坏死，灶性坏死及小灶性坏死；裂果薯皂苷中剂量组可见灶性坏死及小灶性坏死；裂果薯皂苷低剂量组坏死部分较少，可见不同程度小灶性坏死。裂果薯皂苷高中低剂量组均有不同程度的血管塌缩现象。

4.3.4、不同药物组对人肝癌裸鼠移植瘤中MVD的影响

免疫组化结果显示，微血管可呈现单个内皮细胞或内皮细胞簇，其形态和大小有较明显差异，局部可形成条索状或者环状。对照组的MVD为46.40±1.30，与索拉菲尼组19.03±1.63，裂果薯皂苷高剂量组26.40±1.25相比差异显著（p<0.01）。裂果薯皂苷中剂量组的MVD为43.80±1.25，与对照组相比，差异显著（p<0.05）。裂果薯皂苷低剂量组与阴性对照组无明显差异。见表4。

表4 不同药物治疗组对人肝癌SMMC-7721移植瘤中MVD的影响(±s,n=6)

Table 4 Effects of different drug treatment groupon MVDof SMCC-7721xenografted tumor(±s,n=6)

﹡与阴性对照组相比 p<0.01，﹡﹡与阴性对照组相比p<0.05

4.3.5、不同药物治疗组对人肝癌裸鼠移植瘤中VEGF表达的影响

肿瘤组织内VEGF的阳性表达染色呈棕黄色，主要弥漫于肿瘤细胞的胞膜和胞浆，细胞核呈蓝色，无阳性染色。阴性对照组中VEGF呈高表达状态（＋＋＋），可看到大区域棕黄色染色。索拉菲尼组、裂果薯皂苷高剂量VEGF低表达（＋），肿瘤区域内有个别细胞呈阳性染色，与阴性对照组相比差异显著（p<0.01）。裂果薯皂苷中剂量VEGF表达情况为＋＋，与阴性对照组相比差异显著（p<0.01）。见表5。

表5 不同药物治疗组VEGF表达情况(±s,n=6)

Table 5 The expression of VEGF in different drug group(±s,n=6)

﹡与阴性对照组相比p<0.01

该结果说明裂果薯皂苷对移植瘤有很强的抑制作用，在动物整体试验中也体现抗肿瘤活性，其作用可能是通过抑制移植瘤细胞并减缓瘤体中微血管的生长，减少肿瘤营养供应实现的。

裂果薯总皂苷对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型血管生长作用

5.1假气室的制备及加药

取体积相似的7日鸡胚随机分为给药组和空白组，每组10枚。温水冲洗干净，75％酒精棉球擦洗两遍消毒，鸡蛋气室向上，长托与蛋托呈45℃，放入温度（37.0±0.5）℃，相对湿度60%的CO2培养箱中孵育。第2天，在超静工作台上，在气室上方蛋壳处敲破蛋壳，用眼科镊开1.5cm×1.5cm窗口，暴露下方的卵壳内膜，将预先剪成直径5mm的灭菌定性滤纸圆片放在CAM上较少血管处，实验组加入100μL不同浓度的药物，空白对照组加入100μL氯化钠注射液。然后用灭菌的透明胶纸封闭卵壳开口，并将鸡胚做好分组标记，继续放入培养箱中孵育。

给药组设定为索拉菲尼组12.5mg/L,裂果薯皂苷高中低剂量组分别为5mg/mL，2.5mg/mL，1.25mg/mL。

5.2 CAM标本的制作

加药孵育48h后，加入甲醇∶丙酮（1∶1）的固定液1.5mL，室温下固定15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳和卵壳膜，并用眼科剪以滤纸载体为中心，完整剪下CAM，置盛有蒸馏水的碟皿中，用眼科镊舒展CAM，将其平铺于载玻片上。阴干。在显微镜下（×40）观察血管生长情况，并用数码相机拍照。血管计数记录以载体为中心，半径5mm内的血管数。用倒置显微镜观察出大、中、小血管的粗细，计数。根据血管直径将血管分为三类：①＞0.2mm为大血管；②＞0.05mm＜0.2mm为中血管；③＜0.05mm为小血管。

5.3实验结果

观察各不同给药组鸡胚尿囊膜血管，与空白对照组相比，从表6看到，与空白对照组相比，裂果薯皂苷中低剂量组对三级血管有明显抑制作用（p <0.01），高剂量组对一、二、三级血管均表现出抑制作用（p <0.01）。裂果薯皂苷高剂量组对二级、三级血管抑制作用明显（与空白对照组相比p <0.01）。

表6 不同药物组对鸡胚CAM血管生成的影响(±s, n=10)

Table6 The effect of different drug group on angiogenesisin chorioallantoic membrane(CAM) (±s, n=10)

*与空白对照组比p<0.01

该结果说明裂果薯皂苷可抑制微小血管生成，减少肿瘤的血液灌流，对抑制肿瘤生长起积极作用。

5.4酪氨酸激酶含量测定结果

由表7可以看到，药物作用24h，索拉菲尼给药组、裂果薯皂苷高剂量组与空白对照组相比，其酪氨酸激酶含量有显著差异（p<0.01）。药物作用48h，不同给药组与空白对照组相比，其酪氨酸激酶有明显差异（p<0.05），其中索拉菲尼组、裂果薯皂苷高、中剂量组（p<0.01）。不同时间不同剂量的酪氨酸激酶含量变化见表7。

 

表7 不同时效、量效的酪氨酸激酶含量结果

Table 3-6 The results of tyrosine kinase content on different ageing, concentration-response relationship

﹡与空白组比p<0.01，﹟与空白组比p<0.05，﹡﹡与索拉菲尼低剂量组相比p<0.05

综上所述，裂果薯总皂苷对肿瘤细胞的抑制作用明确，效果良好，并且在动物实验中对移植瘤有着良好的作用，是一种很好的新抗肿瘤药物的研究方向。

本发明所用实验材料及试剂

1.1细胞株

人肝癌SMMC-7721、BEL-7404、HL-7702、CNE-1购自中国科学院细胞库，由本实验室传代培养。

1.2动物来源及饲养

Wistar小鼠，SPF级，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供。

Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供。

鸡胚：购自南宁市良凤农牧有限责任公司。

BALB/C裸小鼠（4～5周），体重（15～18）g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心，饲养于广西医科大学实验动物中心SPF级动物房内。

1.3主要仪器和设备

CO2培养箱（美国Thermo公司），MK3酶标仪（美国Thermo公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），Hfsafe 1200安全柜香港热力发展有限公司），TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），LDZX-50FBS立式高压灭菌器（上海申安医疗器械厂），孵育盒（福州迈新），3K15高速冷冻离心机（德国sigma公司）

1.4主要试剂

人脾脏酪氨酸酶ELISA检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司），1640培养基（美国Gibco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），DMSO（美国Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），MTT（美国AMRESCO公司），羧甲基纤维素钠（成都市科龙化工试剂厂），PBS（南宁中健生化公司），D101大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所），乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇（成都市科龙化工试剂厂），Leupeptin（进口分装），Aprotinin（进口分装），PMSF（碧云天生物技术研究所），RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所），DMR+Q550病理图像分析仪（德国莱卡），恒温箱（福州迈新），塑料耐高温切片架（福州迈新），游标卡尺（上海计量制品厂），EDTA（广东西陇化工厂），Motic Med 6.0数码医学图像分析系统

1.5主要试剂的配制

药物的配制：药物浸膏溶解于适量三蒸水中配成所需浓度，超净台中0.22μm微孔滤膜过滤除菌。不溶于三蒸水的药物溶于于适量DMSO中配成一定浓度，使加入作用体系中的DMSO含量不大于0.1%。

PRMI-1640培养基的配制：PRMI-1640粉剂充分溶解于1000mL中，加入2.0g NaHCO3，加入青霉素、链霉素使体系中含青霉素、链霉素的终浓度为100U·mL－1，超净台中过滤除菌并分装，保存于–20℃冰箱，使用前加入胎牛血清，配制成10%胎牛血清的PRMI-1640培养基。

PBS的配制：取一包PBS粉剂，完全溶解于2L三蒸水中，分装后高压灭菌，常温保存。

MTT溶液的制备：取250mgMTT，用50mLPBS配成5mg/mL，充分溶解后在安全柜中用0.22μm微孔滤膜过滤。根据使用情况分装于EP管中，每管1mL，冻存于-20℃。配制分装以及冻存过程中都采用锡箔纸遮住避光。

0.25%胰酶的配制：准确称取胰酶0.25g，常温下溶于100mLPBS中，在安全柜中用0.22μm微孔滤膜过滤，并分装，每瓶10mL。分装完毕后采用封口胶封口。-20℃保存，使用前放解冻，并置于37℃水浴中平衡。

细胞冻存液的配制：RPMI-164070%、新生牛血清20%、DMSO10%。

含药血清的制备：含药血清放置56℃水浴30min灭活，超净台中0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用无血清PRMI-1640培养基调配成终浓度为5%，10%，15%，25%，30%。