唾液酸衍生物在制备PEG脂质衍生物修饰制剂中的应用

摘要

本发明属于药物制剂领域，具体涉及使用唾液酸衍生物消除或减弱PEG化制剂的加速血液清除现象。PEG化脂质体、PEG化乳剂、PEG化纳米粒等PEG化制剂在重复注射时，二次注射制剂从血液中的清除速度会大大加快，即ABC现象。将唾液酸衍生物修饰于PEG化制剂表面后可以消除甚至减弱ABC现象。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及唾液酸衍生物在制备PEG脂质衍生物修饰制剂中的应用，该制剂能消除或减弱PEG化制剂的加速血液清除现象。

背景技术

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇，系环氧乙烷与单乙二醇（或双乙二醇）在碱性催化剂催化之下聚合而成，分子质量因聚合度不同而异，通常在200～35 000之间，其化学通式为HOCH₂(CH₂>2)n>2OH。

聚乙二醇水溶性良好并能与很多有机物组分较好的相容，还具有低毒、对机体无刺激性、免疫原性低的特点，因此在药剂学领域具有广泛的应用。如可以作为溶剂增加药物的溶解度，作为片剂的润滑剂和黏合剂，作为缓控释制剂的骨架材料，作为软膏剂的基质，或是作为蛋白类药物的稳定剂。PEG是经美国食品药品管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一，1991年第1种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG腺苷脱氨酶获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已经有多种PEG修饰蛋白药物上市，如PEG化天冬酰胺酶、PEG化干扰素a-2b和PEG化粒细胞集落刺激因子等（胡永祥，牛津梁，张文博，等．聚乙二醇修饰药物技术的研究进展[J]．中国生化药物杂志，2004，25(6)：369．373）。

将聚乙二醇或其衍生物用于药物分子的修饰，可以降低蛋白多肽类药物的免疫原性和抗原性；增加药物的稳定性，降低酶降解作用；延长药物的血浆半衰期，减小血药浓度波动；改善体内药物分布，增强靶向性等。若将聚乙二醇或其衍生物修饰于载体表面也可获得相似的效果。例如，脂质体具有良好的生物相容性，可改变所包封药物的体内分布而提高药物的治疗指数，但普通脂质体进入体内后较易被单核巨噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，MPS）摄取，导致其迅速从血液中清除并在MPS相关器官(如肝和脾)蓄积。若将聚乙二醇脂质衍生物修饰于脂质体表面（称为PEG化脂质体），从而形成“构象云”(conformational clouds)和水化膜，为脂质体提供了较大的空间位阻并掩盖其表面疏水性结合位点，降低MPS对脂质体的识别和摄取，延长其体内循环时间，从而可以更好地借助EPR（enhanced permeability and retention effect）效应或靶向基团的作用实现脂质体药物的靶向分布，同时也使药物的物理、化学和生物学稳定性得到改善。1995年底，PEG化的阿霉素脂质体Doxil^®经FDA批准在美国上市用于乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、艾滋病引起的卡波氏肉瘤的治疗。

鉴于PEG化载体/药物的独特优势，以及上市产品所带来的可观社会效益和经济效益，世界各国政府都投入大量的人力、财力和资源，进行诸如PEG化脂质体、PEG化树枝状（dendrimer）给药系统、PEG化纳米粒、PEG化胶束、PEG化药物、PEG化酶等方面的研究，特别是PEG化结合主动靶向配体、基因转染、细胞穿透肽、RNA干扰治疗等21世纪主攻方向的研究。

由于大多数PEG化制剂在临床应用上需要多次给药，Dams等（Dams ETM, Laverman P, Oyen WJG, et al. Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes [J]. J Pharmacol exp Ther, 2000, 292: 1071–1079）以⁹⁹_mTc标记脂质体，研究大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情况，意外的发现第二次注射的脂质体血浆水平表现出极大降低（20分钟时的浓度约为首次注射的10%），且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%，此即为加速血液清除（Accelerated>

更多的研究表明，ABC现象并不是PEG化脂质体所专有的，Lu等（LU, W., WAN, J., SHE, Z., et al., Brain delivery property and accelerated blood clearance of cationic albumin conjugated pegylated nanoparticle[J]. Journal of Controlled Release, 2007, 118(1): 38-53.）的研究发现阳离子牛血清白蛋白修饰的PEG与PLA交联形成的纳米粒（CBSA-NP）在小鼠体内的重复注射时也产生了ABC现象；KOIDE等（KOIDE, H., ASAI, T., HATANAKA, K., et al., Particle size-dependent triggering of accelerated blood clearance phenomenon[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2008, 362(1-2): 197-200.）发现PEG化的胶束亦能诱导ABC现象的产生；我们课题组的研究也证明PEG化的胶束和固体脂质纳米粒对于大鼠和比格犬的重复注射可以产生强烈的ABC现象（国家自然科学基金资助项目81072602）。由此可见，ABC现象是PEG化纳米载体所共有的。虽然目前对ABC现象的研究主要集中于PEG脂质体、PEG纳米粒等PEG化的药物载体，但Cheng等（Cheng, T. L., P. Y. Wu, et al. (1999). "Accelerated clearance of polyethylene glycol-modified proteins by anti-polyethylene glycol IgM." Bioconjug Chem 10(3): 520-528.）发现PEG化蛋白能产生抗PEG抗体，从而导致蛋白药物在体内的存留时间缩短。此现象与ABC现象可能具有接近甚至相同的产生机理，所以ABC现象可能是PEG化载体甚至是PEG化药物存在的共性问题。

ABC现象所引发的PEG化制剂药动学特性的改变在其临床应用中是一个不容忽视的问题，会严重影响药物治疗的的安全性、有效性和患者的顺应性。Semple等（Semple SC, Harasym TO, Clow KA, et al. Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312: 1020–1026）的研究证明，重复注射包封寡核苷酸（ODN）、pDNA或RNA核酶的PEG化脂质体会诱导强烈的免疫应答，导致制剂血液循环时间缩短和小鼠死亡率显著增加。我们在研究工作中发现，比格犬在重复注射PEG化乳剂、纳米粒和脂质体时，ABC现象的产生往往伴随着严重的过敏现象，如呕吐、腹泻、面部充血水肿和困倦等。

为了寻找ABC现象的解决方法，研究者们对ABC现象的产生机制和影响因素做了大量研究。目前认为注射制剂的磷脂剂量、注射间隔、载体表面PEG修饰密度、PEG链长、PEG化载体的粒径、PEG化载体的的荷电情况等均会对ABC现象的产生及强度产生影响（徐缓, 王凯乾, 黄微崴, et al., 聚乙二醇修饰脂质体的 ABC 现象研究进展[J]. 药学学报, 2010. 45(6): 677-683.）。

磷脂的剂量>

PEG-DSPE的浓度>

PEG的分子量>

粒径Dams等的研究表明：ABC现象与首次注射PEG化脂质体的粒径、表面性质和放射性标记均无关。未标记的小（85>

注射时间间隔以及连续注射>

不同动物模型>

相关文献及我们的实验表明，通过延长两次注射给药的间隔或者是调整注射剂量可以减轻甚至避免二次注射的PEG化药物发生ABC现象。此外，某些细胞毒类药物装载于PEG化脂质体中时亦能避免ABC现象的产生。但通过这些手段来克服ABC现象将大大限制PEG化修饰技术的应用范围。我们还发现通过可断裂PEG脂质衍生物修饰脂质体或囊泡可以消除或减轻ABC现象（Xu H, Wang KQ, Deng YH, et al. Effects of cleavable PEG-cholesterol derivatives on the accelerated blood clearance of PEGylated liposomes. Biomaterials, 2010;31(17):4757-63.），但可断裂PEG脂质衍生物对于延长脂质体的血液循环时间效果不大。可以说，现在并未寻找到解决PEG化载体/药物ABC现象的理想手段。

本发明中所述的唾液酸（Sialic acid，SA），学名叫作“N-乙酰基神经氨酸”，又称糖酸，是一类九碳单糖，同时也是所有神经氨酸或酮基-脱氧壬酮糖酸(KDN)的N-或O-衍生物的总称，唾液酸的分子通式为：

与唾液酸有关的衍生物已超过百余种，其中最主要的两种唾液酸为 5-乙酰氨基 -3, 5-二 脱 氧 -D -甘 油 -D -半 乳 壬 酮 糖 ( NANA,Neu5Ac,N -乙酰神经氨酸 )和 3-脱氧 -D -甘油 -D -半乳壬酮糖 ( KDN ) ，其中的N -乙酰神经氨酸在脊椎动物体内更为常见。其余的唾液酸衍生物均是在这两种化合物的基础上衍生而成。聚唾液酸是唾液酸单体以α-2,8和 /或α-2, 9酮苷键 ( Ketosidic linkage)连接的线性同聚物。

唾液酸广泛存在于各种生物的组织中，是构成细胞表面复合糖质的主要成分，大多通过2-位异头碳的羟基以α-糖苷键连接在糖蛋白、糖脂和寡糖的末端。神经节苷脂是人类了解较为深入的唾液酸衍生物，其作为一类含唾液酸的鞘糖脂，在脑内的含量非常丰富，它不但能够促进神经细胞分化、神经突生长以及突触形成，而且参与了神经可塑性的凋节和脑损伤后的功能恢复。单唾液酸四己糖神经节苷脂（Monosialylganglioside GM₁，简称GM₁）是迄今研究最为深入的神经节苷脂,>

目前，GM₁已被广泛用于帕金森病、卒中、新生儿缺血缺氧性脑病、脑外伤、脊髓损伤以及周围神经病的治疗（如我国山东齐鲁制药有限公司生产的单唾液酸神经节苷脂钠注射液，商品名为“申捷”）。Allen,>1用于脂质体表面修饰，增加脂质体（EPC>1（2:1：0.14）的1.7；DSPC：CH（2:1）的0.007提高到DSPC：CH：GM₁（2:1：0.14）的3.2）。

除GM₁外，目前常见的神经节苷脂还有GM₂、GM₃、GD₁、GD₂、GD₃等，具体分类及结构见下表，其中GM表示含1个唾液酸基团，GD表示含2个唾液酸基团，GT表示含有3个唾液酸基团，GQ表示含4个唾液酸基团。Cer表示神经酸胺残基，组成寡糖链的糖主要为D-葡萄（Glc）、D-半乳糖（Gal）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰神经氨酸（NeuNAc）和N-羟乙酰神经氨酸（NeuGc）。

唾液酸的衍生物还包括唾液酸的胆固醇甙（SA-CHOL），日本公开特许昭 62-265229(1987)；以及平1-93529( 1989)描述了这种化合物的合成和表征方法。

存在于天然神经节苷脂中的N-乙酰神经氨酸的键合结构是α型，然而，近年来通过化学合成方法已经合成了N-乙酰神经氨酸的键合结构是β型的表唾液酸（episialo）复合碳水化合物。日本专利（KOKOKU）1-49354和美国专利4968786报道了表唾液酸神经节苷脂epiGM₃的合成和表征方法；日本专利（KOKAT）61-282391和美国专利4751290报道了表唾液酸神经节苷脂epiGM₄的合成和表征方法；日本专利（KOKAT）63-452931和美国专利4730058报道了表唾液酸神经节苷脂epiGM₅的合成和表征方法。

由于唾液酸荷负电并普遍存在于细胞膜表面，是细胞膜负电荷的主要来源，因此研究者认为唾液酸与细胞的粘附有关。在细胞和细胞之间、细胞和环境之间、唾液酸残基起着首当其冲的作用。已经证实：细胞在生长、分化、衰老、恶变等过程中，常伴有表面复合糖的变化。唾液酸与细胞的寿命也有关，未成熟和刚成熟的红细胞表面的唾液酸含量高于衰老的红细胞，研究还发现经唾液酸酶处理过的红细胞寿命从原来的120 天缩短到几个小时。此外，细胞表面唾液酸含量与细胞恶性程度有关，即细胞膜表面唾液酸含量高的肿瘤细胞，肿瘤转移性也高。唾液酸的生物学功能基本上可以分为3类：唾液酸本身能被识别的受体作用、细胞之间的信息传递和通过阻止或减弱细胞或分子对其特异性识别部位的接触所起到的掩蔽作用。基于此认识，中国专利200780033741.8描述了使用聚唾液酸修饰蛋白药物以增加蛋白药物疗效的方案；中国专利CN91101721.6提供了使用表唾液酸神经节苷脂（epiGM）制备癌症诊断药物的用途。

动物实验研究表明，神经节苷脂水平的降低与早期营养不良和学习能力降低有关，而补充唾液酸可以提高动物的学习行为。足够的唾液酸供应对于低出生体重儿脑功能的正常发育可能尤其重要。婴儿出生后，母乳中的唾液酸对于保证他们的正常发育至关重要。调查显示，分娩后母亲体内唾液酸水平随着时间的推移成下降趋势。因此，在孕期及孕后持续摄入足量唾液酸，可以帮助维持体内的唾液酸水平。所以目前唾液酸衍生物的一个用途即作为营养补充剂，如中国专利200510069325.6所述。

发明内容

本发明人在对PEG化制剂ABC现象的研究中意外的发现，将唾液酸衍生物修饰于PEG化制剂表面时，可以减弱甚至消除PEG化制剂的ABC现象，发明所述的唾液酸衍生物具有式（1）的结构：

其中R₁是-OCH₂CHOH，其中与羟基相连的碳跟7号碳相连，或是-OCHCH₂OH，其中与醚键相连的碳与7号碳相连，当n为1或者通式（1）中除R₅以外的结构处于端基时，R₁是OHCH₂OHCH-；

R₂是N>3是H、乙酰基、甲基；R₄是H、羟基或是氟，R₄与3号碳的连结键可以为α构型，或是β构型；R₅是带有寡糖链残基的神经酰胺，糖脂、脂类残基、蛋白质或肽、药物或药物递送系统；式（1）中2号碳上的糖苷键或是酮苷键可以为α构型，或是β构型；n为1~100间的一个整数。

作为优选，通式（1）化合物中R₁是-OCH₂CHOH，其中与羟基相连的碳跟7号碳相连，或是-OCHCH₂OH，其中与醚键相连的碳与7号碳相连；或是OHCH₂OHCH-；R₂是N>3是H、乙酰基；R₄是H或者羟基，当R₄是羟基时其连结键可以为α构型，或是β构型；其中R₅是带有寡糖链残基的神经酰胺、糖脂、脂类残基；其中2号碳上的糖苷键或是酮苷键可以为α构型，或是β构型；n为1~100间的一个整数。

作为最优选，式（1）化合物是GM₁、GM₂、GM₃、GM₄、GM₅、epiGM₁、epiGM₂、epiGM₃、epiGM₄、epiGM₅或是SA-CHOL。

本发明所述的PEG脂质衍生物修饰制剂是PEG化乳剂，PEG化微乳，PEG化脂质体，PEG化固体脂质纳米粒，PEG化纳米结构载体，PEG化胶束或PEG化囊泡，制备这些制剂所用的材料包括各种磷脂、各种表面活性剂、高分子物质。

本发明带来的有益结果

使用唾液酸衍生物与PEG脂质衍生物对制剂进行共同修饰后可以明显减弱甚至是完全消除ABC现象。

唾液酸衍生物，特别是其中的神经节苷脂，属于生物体的内源性物质，所以当其作为药物载体或药物分子修饰物进入机体后可以被吸收和降解，不会增加所修饰制剂的安全性风险。

本专利所用的唾液酸衍生物大多为内源性物质，随PEG化制剂进入体内后可被机体利用，即可作为人体的营养补充剂。

附图说明

图1为实施例1中不含GM₁的PEG化乳剂首次注射（以control表示）和相隔3天、5天和7天后二次注射的药时曲线（n=3）。

图2为实施例1中含GM₁的PEG化乳剂首次注射（以control表示）和相隔3天、5天和7天后二次注射的药时曲线（n=3）。

图3为实施例2中不含GM₁的PEG化乳剂不同首剂量的二次注射的药时曲线（n=3），其中control组表示以磷脂剂量为2>

图4为实施例2中含GM₁的PEG化乳剂不同首剂量的二次注射的药时曲线（n=3），其中control组表示以磷脂剂量为2>

具体实施方式：

实施例中所用各成分的简称如下

TN 维生素E烟酸酯

MCT 中链甘油三酸酯

S₇₅>

mPEG-DSPE 甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺

CF钙黄绿素

CHOL 胆固醇

GMS十八(烷)酸丙三醇酯

PEG 聚乙二醇

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但这些实施例不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由权利要求书所限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

在对ABC现象进行研究时模型药物的选择至关重要，由于ABC现象与生物体的免疫反应关系密切，所以我们应当选择对机体特别是免疫系统无伤害或伤害较小的药物。同时还要考虑是否便于装载于所选择的PEG化载体中并能真实的反映载体在体内的变化情况。综合考虑，我们选择维生素E烟酸酯（Tocopheryl Nicotinate，简称TN），钙黄绿素（Calein，简称CF）和辅酶Q10（Coenzyme>

实施例1

GM₁对ABC影响

按照表1处方组成制备乳剂

表1 TN乳剂处方

成分/处方12TN（mg）1212MCT（mg）3030S₇₅（mg）7.07.0mPEG-DSPE>2.82.810%GM₁注射液1.8 mL-5%葡萄糖注射液-1.8 mL

mPEG-DSPE修饰乳剂的制备工艺：将处方量水相（5 %葡萄糖注射液）55 ℃预热备用。将处方量油相（TN、MCT、S75、mPEG-DSPE）于55 ℃下搅拌至全部溶解。搅拌下将水相加入油相，高速分散，即得初乳。探头超声（200 w×2 min；400 w×6 min）处理后，过0.22 μm微孔滤膜除菌即得。

GM₁与mPEG-DSPE共修饰乳剂的制备工艺：以10%的GM₁注射液作为水相，其余制备工艺与mPEG-DSPE修饰乳剂的工艺相同。

给药方案：雄性Wistar大鼠标记称重后，于尾静脉注射乳剂，首次注射3天、5天或7天后进行第二次注射，磷脂剂量均为2 µmol/kg，并于注射前30min于眶静脉取血400μL，静置2h后离心分离上层血清，于注射后的5min、15min、30min、1h、2h、4h眶静脉取血400μL，置于涂有肝素的1.5 mL离心管中，离心分离上层血浆，-20℃保存待测。

标准曲线：取内标溶液、空白比格犬血浆适量，精密配制一系列浓度的TN溶液，提取分离处理后，取上清液进行HPLC分析。以药物浓度C（µg/mL）为横坐标，药物和内标物的峰面积比（A_s/A_i）为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归，并计算回归直线方程为A_s/A_i>

样品处理：取血浆样品100 μL于2 mL离心管中，加入内标液50μL、甲醇150 μL、正己烷600 μL。涡旋5 min混匀，于10,000 rpm离心10 min，移取正己烷层500 μL，氮气挥干。加入流动相100 μL，涡旋1 min混匀，于10,000 rpm离心10 min，取上清液，进行HPLC分析。

结果见图1及图2，图1表示仅用mPEG-DSPE修饰的乳剂首次注射（以control表示）和相隔3天、5天和7天后二次注射的药时曲线；图2表示含使用GM₁和mPEG-DSPE共同修饰的乳剂首次注射（以control表示）和相隔3天、5天和7天后二次注射的药时曲线。由图可知，mPEG-DSPE修饰的乳剂的重复注射可以产生强烈的ABC现象；在PEG化乳剂中加入GM₁后，若间隔3天进行第二次注射，未观察到ABC现象，若间隔5天或7天，ABC现象减弱，且产生的ABC现象强度无显著性差异。

实施例2

所用乳剂的处方及制备工艺同“实施例1”。

给药方案：雄性Wistar大鼠标记称重后，于尾静脉注射乳剂，磷脂剂量为0.1 µmol/kg、0.5 µmol/kg、1 µmol/kg或2 µmol/kg，首次注射7天后进行第二次注射，磷脂剂量为2 µmol/kg，于注射前30min于眶静脉取血400μL，静置2h后离心分离上层血清，于注射后的5min、15min、30min、1h、2h、4h眶静脉取血400μL，置于涂有肝素的1.5 mL离心管中，离心分离上层血浆，-20℃保存待测。分析方法同“实施例1”.

图3表示仅用mPEG-DSPE修饰的乳剂在不同首剂量的情况下二次注射的药时曲线，其中control组表示以磷脂剂量为2 µmol/kg进行单次注射时的药时曲线；图4表示用GM₁和mPEG-DSPE混合修饰的乳剂在不同首剂量的情况下二次注射的药时曲线，其中control组表示以磷脂剂量为2>1和mPEG-DSPE混合修饰的乳剂在上述各种首次剂量条件下，均无明显的ABC现象。

实施例3不同PEG密度制剂的ABC现象

所用乳剂的处方如表2所示，制备工艺同“实施例1”。

表2 不同PEG密度制剂的处方组成

成分/处方123456TN>121212121212MCT>303030303030S₇₅>7.07.07.07.07.07.0mPEG-DSPE>-0.71.42.85.68.410 %GM1注射液(mL)1.81.81.81.81.81.8

实验动物的选择、给药方案和分析过程同“实施例1”。结果表明在不同的表面PEG修饰密度下，GM₁的加入均使ABC现象减弱甚至是消除。

实施例4

所用乳剂的处方如表3所示，制备工艺同“实施例1”。

表3不同mPEG分子量的乳剂处方

成分/处方123TN>121212MCT>303030S₇₅>7.07.07.0mPEG₇₅₀-DSPE>1.5--mPEG₅₀₀₀-DSPE>-10.7-mPEG₂₀₀₀₀-DSPE>--38.810 %GM1注射液(mL)1.81.81.8

备注：mPEG₇₅₀-DSPE分子量为750+748.1=1498.1；mPEG₅₀₀₀-DSPE分子量5748.1；mPEG₂₀₀₀₀-DSPE分子量20748.1

实验动物的选择、给药方案和分析过程同“实施例1”。结果表明使用不同链长的PEG对乳剂进行修饰时，GM₁的加入均使ABC现象减弱甚至是消除。

实施例5

GM₃对PEG化胶束ABC现象的影响

GM₃结构如下

GM₃按照文献（朱振元>3的有效合成[J]，化学学报，2004，24：2909-2916）所述的方法进行合成和表征。

所制备胶束的处方如表4所示

表4 胶束处方

制备工艺：将处方量的Q₁₀、S₇₅、DPPC、mPEG₂₀₀₀-DSPE、GM₃用适量乙醇溶解，将乙醇挥干后，在60℃水浴超声情况下加入处方量5%葡萄糖注射液。

使用粒径测定仪测得所得胶束粒径约在10-30 nm之间。

选用雄性比格犬作为实验动物，禁食10 h后称重。以Q₁₀剂量0.8>

分析方法：取 0.1 mL比格犬血浆于 1.5 mL 离心管中，加入内标10 μL（维生素 K1 15 μg/mL），混匀后，加入甲醇 0.2 mL，正己烷 0.6 mL，涡旋 3 min，10000 rpm 离心 10 min，移取正己烷 0.5 mL 于 1.5 mL 离心管中；剩余残渣中再加入正己烷 0.6 mL，涡旋 3 min，10000 rpm 离心 10 min，移取正己烷 0.6 mL，合并正己烷层,离心浓缩挥尽正己烷，残留物用 100 μL 流动相溶解，取 20 μL 进样。

由于Q₁₀为生物体内源性物质，所以我们在实验前对每只比格犬血液中的Q₁₀浓度进行了测定并在血浆样品测试时扣除了此本底值。

结果表明，处方1的胶束首次注射30 min后血液中剩余50%的注射剂量，二次注射后30 min血液循环中仅剩余注射剂量的7 %，发生了明显的ABC现象；处方2的胶束首次注射30 min后血液中剩余65%的注射剂量，二次注射后30 min血液循环中剩余注射剂量的51 %，可以认为没有产生ABC现象；处方3的胶束首次注射30 min后血液中剩余58%的注射剂量，二次注射后30 min血液循环中仅剩余注射剂量的9 %，产生了明显的ABC现象；处方4的胶束首次注射30 min后血液中剩余66%的注射剂量，二次注射后30 min血液循环中剩余注射剂量的56 %，可以认为没有产生ABC现象。

上述实验证明GM₃的加入能够显著减弱PEG化胶束的ABC现象。

实施例6

唾液酸的胆固醇甙（SA-CHOL）采用日本公开特许昭 62-265229(1987)；以及平1-93529( 1989)所述的方法进行合成和表征。

所制备囊泡的处方如表5所示

表5 囊泡处方

分别制备使用mPEG-DSPE修饰的囊泡和SA-CHOL与mPEG-DSPE共同修饰的囊泡并使用凝胶层析除去外水相的CF。选用小鼠作为实验动物，禁食10 h后称重。以CF剂量0.1mg/kg给药。分别于给药后0 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min取血。经离心后分离血浆，-20℃保存待测。

分析方法建立及样品处理方法：

以PBS (pH 7.4，含10% Triton X-100) 配置不同浓度的CF溶液，每份样品中含有同样体积的小鼠血浆。荧光分光光度计 (Ex=490 nm, Em=520 nm) 测定荧光强度值F。

线性方程：F = 13.129*C + 23.564, R²=>

线性范围：1.5 - 75.0 ng/mL。

血浆100μL，以PBS（pH 7.4，含10% Triton X-100）定容至5mL，混匀，荧光分光光度计（Ex=490 nm，Em=520 nm）测定荧光强度F，代入标准曲线，计算血浆中CF的含量。

试验结果表明：当给药间隔在7、14或21天时，仅用mPEG-DSPE进行修饰的囊泡可以出现明显的ABC现象，而在膜材中加入SA-CHOL后，ABC现象基本消除。

实施例7

epiGM₄按照日本专利（KOKAT）61-282391和美国专利4751290所述的方法进行合成并表征。(计算分子量约为1143)

分别制备含有epiGM₄和不含epiGM₄的PEG化脂质体。

称取HSPC 96 mg，CHOL 32 mg，mPEG₂₀₀₀-DSPE>4>

使用Wistar大鼠作为试验动物，结果表明，在给药间隔为7天且磷脂剂量为5 µmol/kg时，没有epiGM₄的PEG化脂质体产生了明显的ABC现象，二次注射之后的15>4修饰的PEG化脂质体没有出现ABC现象。

实施例8

以GM₁修饰PEG化固体脂质纳米粒。

表6PEG固体脂质纳米粒处方

成分/处方12TN（mg）2020GMS（mg）5050mPEG₂₀₀₀-DSPE>7710%GM₁注射液>-35%葡萄糖注射液加至5mL5mL

按常规方法分别制备mPEG-DSPE修饰的固体脂质纳米粒及用mPEG-DSPE和GM₁混合修饰的固体脂质纳米粒。给药方案及分析方法同“实施例1”。

结果表明，仅用mPEG-DSPE修饰的固体脂质纳米粒在注射间隔为7天时产生了明显的ABC现象，而mPEG-DSPE和GM₁混合修饰的固体脂质纳米粒几乎没有ABC现象的产生，

实施例9

采用聚合度为40~60的聚唾液酸，唾液酸分子间通过α-2，8-糖苷键连接，聚唾液酸与脂质片段间的连接反应按照中国专利200780033741.8和中国专利86100178.8所述的方法进行，所用脂质片段为十六烷基。

用所合成的聚唾液酸脂质衍生物对“实施例8”中处方1的PEG化固体脂质纳米粒进行修饰，使用小鼠为试验动物且注射间隔为9天时，相比于仅使用mPEG-DSPE进行修饰的PEG化固体脂质纳米粒，其ABC现象基本消除。