治疗用途的来自人血浆的内-α抑制剂蛋白质的制备和组合物

摘要

本发明涉及内-α抑制剂蛋白质(IαIp)。本发明还涉及纯化IαIp组合物的方法及其用于治疗人疾病如脓毒症和败血症性休克、类风湿性关节、癌症和传染病的用途。

说明书

本申请是申请日为2004年11月5日，申请号为200480040150.X的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。 

相关申请 

本申请包含2003年11月8日申请的发明名称为“治疗用途的来自人血浆的内-α抑制剂蛋白质的制备和组合物”的临时专利申请系列No.60/_______中所公开的相关主题，该申请的公开内容在此以其整体引入作为参考。 

政府支持 

本发明的一部分由国家健康研究所拨款R01GM053008、R01GM057468和R43GM065667支持。 

发明背景 

内-α抑制剂蛋白质(IαIp)家族是一组血浆伴生的丝氨酸蛋白酶抑制剂。该家族的成员由重链和轻链多肽亚基构成，通过糖氨基聚糖共价连接。轻链，也称为bikunin，担负分子的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。名字“bikunin”反映出存在2个Kunitz型的蛋白酶抑制结构域。正常的血浆中，发现大部分bikunin是复合形式，如内-α抑制剂(IαI)，其具有225kDa的分子量，和前-α抑制剂(PαI)，其具有120kDa的分子量。IαI中，bikunin连接2个多肽重链，H1和H2，而，PαI中，只有单个重链(H3)连接bikunin。这些复合形式中，bikunin保持钝化直至通过部分蛋白水解降解来释放，这是作为调节活性方式的机理。从复合物中分裂后，通过肾小球滤过作用将激活的bikunin从血浆快速清除，这是通过低分子量和受体介导的吸收来促进的过程。US专利No.6,489,128和6,660,482各自涉及诊断癌症和脓毒症的用途。还公开了抑制转移和治疗脓毒症的方法，然而，实质上组合物不是纯的并具有稳定性的问题，即短半衰期的问题。 

尽管在五十年多前引入了抗生素，其的确看到了脓毒症诱导的死亡率从55％降低至35％，医学没有从脓毒症个体死亡率显著降低而受益。实际上，脓毒症继续是重病监护室死亡原因之一和大量的脓毒症个体死于随后的败血症性休克和多器官衰竭。脓毒症是对感染例如细菌感染的全身性反应。其通常是由革兰氏阴性细菌的内毒素或革兰氏阳性细菌的外毒素(其可以引发内毒素样反应)引起的。全身性反应可以导致败血症性休克，其特征在于血压下降、心血管虚脱和/或多器官衰竭。诊断为败血症性休克个体中的死亡率可以高达35-45％。已经难以使用常规药物来快速而可靠地治疗脓毒症。 

脓毒症和败血症性休克与先天免疫和凝血系统的激活相关。脓毒症和败血症性休克临床上的特征为全身炎症、凝血病、低血压和多器官机能障碍(J.-L.Vincent等，Annuals of Medicine 34(2002)606-613)。几个脓毒症过程中，特定蛋白酶的网激活凝血因子、血纤维蛋白溶解因子和补体因子。这些蛋白酶还可以引发组织和器官损伤并提高血浆中凝血因子和互补因子的非特异性蛋白水解(J.Wite等，Intensive CareMedicine 8(1982)215-222；S.J.Weiss，New England Journal ofMedicine 320(1989)365-376)。 

发明简述 

本发明涉及纯化人血浆的内-α抑制剂蛋白质(IαIp)的方法及其用途，用于治疗人疾病，如脓毒症、急性炎症疾病、严重休克、败血症性休克、类风湿性关节炎、癌症、癌转移、传染病和早产分娩；或用于降低脓毒症、急性炎症疾病、严重休克、败血症性休克、类风湿性关节炎、癌症、癌转移、传染病和早产分娩相关的死亡率风险。 

根据一方面，产生源自血浆的IαIp组合物的方法，其中IαI和PαI以生理比例存在于混合物中，包括从血浆分离含有IαI和PαI的血浆级分，其中IαI和PαI以生理比例存在；和纯化血浆级分来获得IαIp纯度为约85％至约100％纯的IαIp组合物。 

根据另一方面，IαIp组合物包括内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中，约85％至约100％纯。 

相关方面中，IαIp组合物包括内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋 白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中并具有高的胰蛋白酶抑制比活性。 

另一相关方面中，IαIp组合物包括半衰期高于一小时的IαI和PαI。 

再一相关方面中，IαIp组合物包括IαI和PαI，其中IαI和PαI由与三个重链H1、H2和H3中的至少一个结合的内-α抑制剂蛋白质的轻链组成。 

另一相关方面中，IαIp的组合物包括内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于混合物中，包括与四个重链H1、H2、H3和H4中的至少一个结合的内-α抑制剂蛋白质的轻链。 

再一相关方面中，根据以下方法制得IαIp，该方法包括从血浆中分离出含有IαI和PαI的血浆级分，其中IαI和PαI以生理比例存在；和纯化血浆级分来获得IαIp纯度为约85％至约100％纯的IαIp组合物。 

另一方面中，根据本发明的药物组合物包括治疗有效量的在此所述的IαIp组合物和药物学上可接受的载体。 

另一方面涉及治疗个体的炎症相关疾病、癌症或传染病的方法，其包括给药治疗有效量的通过以下所述任何方法产生的IαIp。 

另一相关方面中，治疗个体的方法包括测定IαI、PαI、IαIp、H3、H4、H1、H2和LC中一个或多个的治疗前水平；并将治疗有效量的IαIp给药于个体。 

相关方面中，描述了预测对IαIp治疗反应的方法。该方法包括测试从个体获得的样品来检测IαI、PαI、IαIp、H3、H4、H1、H2和LC中一个或多个的水平；其中所检测的水平鉴定可以良好反应IαIp治疗的个体。 

另一相关方面中，描述了监控IαIp治疗的治疗个体进展的方法，并包括测定IαI、PαI、IαIp、H3、H4、H1、H2和LC中一个或多个的治疗前水平；将治疗有效量的IαIp给药于个体；并在IαIp治疗初期后测定个体的一个或多个水平，其中IαIp治疗后个体水平的提高表示个体可能对IαIp治疗具有良好的临床反应。 

另一方面中，描述了用于IαIp治疗的药盒，包括IαI、PαI、IαIp、 H3、H4、H1、H2和LC中的一个或多个；和用于治疗使用的说明书。 

相关方面中，描述了包括容器的组合物，容器中包括IαIp和插有有关将IαIp给药于个体说明的标签或包装。 

再一相关方面中，描述了药盒，其包括如上所述的组合物以及用于治疗使用的说明书。 

以下公开了本发明的其他实施方案。 

附图简述 

图1描绘了脾的组织病理学。对照动物(A)中，保护白髓围绕帚形动脉，大范围失去红髓细胞基本组分，对IαIp治疗动物(B)中，具有正常围绕的白髓和轻微超细胞的红髓(H&E染色，放大20×)。 

图2描绘了H4的氨基酸序列。 

图3描绘了盲肠结扎和穿刺(CLP)或假手术(Sham)后5和20小时时肝脏中bikunin mRNA表达的改变。数据表示为平均±SE(n＝8/组)并通过方差的一尾分析(ANOVA)和Tukey测试来比较：^＊P＜0.05对假手术。图3a显示了扩增和通过凝胶上大小分离的mRNA，和图3b用图表描绘了标准化至G3PDH表达的bikunin水平的结果。 

图4描绘了盲肠结扎和穿刺(CLP)或假手术(Sham)后5和20小时时125I-IαI的t_1/2的改变。数据表示为平均±SE(n＝5/组)并通过方差的一尾分析(ANOVA)和Tukey测试来比较： 

图5描绘了载体治疗盲肠结扎和穿刺和盲肠切除(CLP+载体)与内α抑制剂治疗盲肠结扎和穿刺(CLP+IαIp)10天后存活率的改变。每组12只动物。通过Kaplan-Meier方法计算存活率并使用对数级测试来比较。^＊P＜0.05对CLP+载体。 

图6描绘了载体治疗盲肠结扎和穿刺和盲肠切除(CLP+载体)与内α抑制剂治疗盲肠结扎和穿刺(CLP+IαIp)10天后存活率的改变。每组11至12只动物。通过Kaplan-Meier方法计算存活率并使用对数级测试来比较。^＊P＜0.05对CLP+载体。 

图7描绘了载体治疗盲肠结扎和穿刺和盲肠切除(CLP+载体)与内α抑制剂治疗盲肠结扎和穿刺(CLP+IαIp)10天后存活率的改变。每组16只动物。通过Kaplan-Meier方法计算存活率并使用对数级测试来比较。^＊P＜0.05对CLP+载体。 

图8a和8b描绘了根据本发明从人血浆纯化IαIp的略图。 

图9用图表表示了高度纯化的IαIp在脓毒症动物研究中的有益效果。 

发明详述 

在此公开的是从血浆纯化IαIp的新方法。在此进一步公开的是纯化IαIp的治疗组合物，用于给药于个体来治疗急性炎症疾病、脓毒症、严重休克、败血症性休克、类风湿性关节炎、癌症、癌转移、传染病和早产分娩。 

之前已知的纯化含有因子X(FX)的污染物，通过蛋白质印迹分析检测为80kDa条带。在凝血测试中也检测到FX。除去FX是重要的，因为认为FX是形成血栓的且如果给药于人是有害的。在此所述的方法解决了之前IαIp组合物的FX污染问题。 

内-α抑制剂蛋白质(IαIp)是结构上相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，发现在人血浆中为相对高的浓度(400-800mg/L)。IαIp是大的、多成分复合物，作为胰岛素-型蛋白酶抑制剂。和其他抑制剂分子不同，该家族的抑制剂由多肽链(轻链和重链)的组合物独特地共价连接硫酸软骨素链组成。内-α蛋白质的重链(H1、H2和H3)也称为透明质酸(HA)结合蛋白。人血浆中发现的主要形式是内-α-抑制剂(IαI)，其由两个重链(H1&H2)和单个轻链(L)组成，和前-α-抑制剂(PαI)，其由一个重链(H3)和一个轻链(L)组成。已知轻链(也称为bikunin(双-kunitz抑制剂，具有两个Kunitz结构域)广泛抑制血浆丝氨酸蛋白酶。复合物已经显示出在抑制蛋白酶阵列中的重要性，蛋白酶阵列包括嗜中性弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶G和精子酶。 

已经发现IαI和PαI与H4复合，H4是IαIp蛋白质的另一条重链。根据本发明特定实施方案的IαIp组合物包含与PαI、IαI或PαI和IαI两者复合的H4。 

不希望受到任何科学理论的限制，我们推测IαIp的重链从复合物释放出来后结合HA，以防止HA结合其受体CD44。IαIp的重链不存在时，HA将结合CD44并引发前炎症因子的分泌。例如，TNF-α，并导致炎症。其间，IαIp的轻链，一旦从复合物中释放出了就呈现抗蛋 白酶活性。 

“IαIp组合物”指的是IαIp蛋白质的制剂，包括生理比例的IαI和PαI。如在此所用的生理比例指的是包括没有遭受感染或病症的人或动物中发现的比例，和/或人血浆中天然出现的IαI和PαI的比例。生理比例通常为约60％至约80％IαI和约40％至约20％PαI。由于个体基因构成的正常变化，生理比例可以不同于这些范围。 

如在此所用的，“内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物”指的是含有IαI和PαI复合体两者的组合物。混合物还可以含有缓冲剂、盐或用于分离IαIp复合物的其他成分。特定方面中，IαI和PαI以生理比例存在于混合物中。 

血浆级分中存在的IαI和PαI具有约60至约280kDa的表观分子量。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定分子量。 

如在此所用的“半衰期”指的是给药的IαIp活性是给药时一半的时间量。根据本发明IαIp组合物的半衰期为，例如，大于约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7.5或10小时。优选的实施方案中，IαIp组合物的半衰期高于约5小时。特别优选的实施方案中，IαIp组合物的半衰期高于约10小时。优选较长的半衰期，例如，因为随着时间需要给药于个体的剂量较低。 

本发明的IαIp组合物具有高的胰蛋白酶抑制活性。根据本发明的IαIp组合物的胰蛋白酶抑制比活性为约1000至约2000IU/mg。优选胰蛋白酶抑制比活性为约1200IU/mg，更优选约1500IU/mg。通过胰蛋白酶抑制测试使用L-BAPA作为底物来测量胰蛋白酶抑制比活性。参见，HU Bergmeyer，编辑：vol 5，第3版，119(1984)Verlag Chemie，Weinheim：Chromogenic substrate for the assay of trypsin(测试胰蛋白酶的发色底物)：R.Geiger，H.Fritz，Methods of Enzymatic Analysis。 

IαIp的组合物是内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中，包括内-α抑制剂蛋白质的轻链结合三个重链H1、H2和H3中的至少一个。根据本发明的组合物还具有内-α抑制剂蛋白质的轻链结合四个重链H1、H2、H3和H4中的至少一个。IαIp复合体中每个蛋白的实例如下：Bikunin Genbank登录号：AAB84031、P02760；H1GenBank登录号：P19827、NP_002206；H2 GenBank登录号：NP_002207、P19823； H3 GenBank登录号：NP_002208；H4 GenBank登录号：Q14624、NP_002209，每个在此以其整体引入作为参考。 

如在此所用的“源自血浆”指的是最初从血浆分离或纯化的。即，组合物的自然环境是血浆。 

如在此所用的“血浆级分”是来自分离或纯化步骤例如色谱的级分，最初源自血浆。根据本发明的血浆级分可以是，例如，从纯化凝血因子IX获得的副产物，从纯化凝血酶原复合浓缩物获得的副产物，从冷沉淀血浆获得的冷上清液(描述于Hoffer等，Journal ofChromatography B 669(1995)187-196)，或冷贫瘠血浆(poor plasma)，冷贫瘠血浆在此与冷上清液交替使用。冷贫瘠血浆是从冷沉淀获得的上清液。 

根据本发明的副产物实例是从纯化凝血因子IX获得的。已经表明IαI/PαI混合物存在于因子IX(FIX)纯化过程产生的副产物中。从纯化凝血因子IX获得副产物的方法描述于Hoffer等，Journal ofChromatography B 669(1995)187-196，其在此以其整体引入作为参考。副产物的其他实例包括来自纯化FIX的副产物或来自纯化凝血酶原复合浓缩物的副产物，如描述于D.Josic等，Thrombosis Research 100(2000)433-441，其在此以其整体引入作为参考；以及作为血浆冷沉淀获得冷上清液分离的副产物。(例如，合适的冷沉淀方法描述于Hoffer等，Journal of Chromatography B 669(1995)187-196)。用于从血液纯化IαIp复合体的其他血浆级分包括强阴离子交换级分和整体色谱级分，将在以下的实施例中描述。 

根据本发明，血浆级分可以来自人、灵长类、牛、猪、猫或犬来源。 

如在此所用的，术语“获得”包括购买、合成、分离或另外获得本发明实施中所用的一种或多种物质。 

因此，如在此所用的“获得血液”，包括例如从人、灵长类、牛、猪、猫或犬来源获得血液。例如，可以从血库、医院、收容所、私人公司、研究基金会或任何其他血液来源来获得和/或购买血液。 

如在此所用的“获得血浆”，包括例如从人、灵长类、牛、猪、、猫或犬来源获得血浆。例如，可以从血库、医院、收容所、私人公司、研究基金会或任何其他血液来源来获得和/或购买血浆。或者，一旦获 得血液，也可以从血液分离血浆。分离血浆的合适方法包括重力和离心。 

如在此所用的，“获得从纯化凝血因子IX获得的副产物级分”，包括例如从日常纯化因子IX的公司或医院获得和/或购买从纯化凝血因子IX获得的副产物级分。 

如在此所用的，“获得从纯化凝血酶原复合浓缩物获得的副产物级分”，包括例如从纯化凝血酶原复合物的公司、研究组织或医院获得和/或购买副产物级分。 

如在此所用的，“获得从血浆冷沉淀获得的冷上清液”包括例如从以适用于本发明的方式冷沉淀血浆的医院、研究组织或公司获得和/或购买冷上清液。 

“固体载体”指的是可以用捕获试剂衍生或另外连接捕获试剂的固体材料。实例固体载体包括探针、微量滴定板和色谱树脂。 

“吸附”指的是分析物与吸附剂或捕获试剂的可检测非共价结合。吸附剂表面指的是结合吸附剂(也称为“捕获试剂”或“亲和试剂”)的表面。吸附剂是能够结合分析物(例如，目标多肽或核酸)的任何材料。 

色谱吸附剂指的是色谱中通常所用的材料。色谱吸附剂包括，例如，离子交换材料，金属螯合剂(例如，次氮基乙酸或亚氨基二乙酸)，固定金属螯合物，疏水性交换吸附剂，亲水性交换吸附剂，染料，简单生物分子(例如，核苷酸，氨基酸，单糖和脂肪酸)和混合模式的吸附剂(例如，疏水性吸附/静电推斥吸附剂)。 

生物特异性吸附剂指的是包括生物分子的吸附剂，生物分子例如，核酸分子(例如，适配子)，多肽，多糖，脂质，类固醇或这些的缀合物(例如，糖蛋白，脂蛋白，糖脂，核酸(例如，DNA)-蛋白质缀合物)。特定实施例中，生物特异性吸附剂是大分子结构如多蛋白复合物，生物膜或病毒。生物特异性吸附剂的实例是抗体、受体蛋白质和核酸。生物特异性吸附剂对目标分析物的特异性通常比色谱吸附剂高。 

“洗脱剂”或“洗涤溶液”指的是用于影响或改变分析物和吸附剂表面的吸附和/或从表面除去未结合材料的试剂，通常是溶液。例如洗脱剂的洗脱特性取决于pH、离子强度、疏水性、混乱向性的程度、去污剂强度和温度。 

“分析物”指的是样品中期望得到检测的任何成分。术语可以指样品中的单种成分或多种成分。 

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可交替使用，用来表示氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是天然产生氨基酸相应的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然产生的氨基酸聚合物。多肽可以是修饰的，例如，通过添加碳水化合物来形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。 

“免疫测试”是使用特异性结合抗原(例如，IαIp复合物)的抗体的测试。免疫测试的特征在于使用特定抗体与分离物、目标的特异性结合特性，和/或定量抗原。 

“抗体”指的是实质上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性地结合和识别抗原决定部位(例如，抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括κ和γ轻链恒定片段基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定片段基因，和无数的免疫球蛋白可变片段基因。例如抗体作为完整的免疫球蛋白或作为各种肽酶消化产生的充分表征的多个片段存在。这包括，例如，Fab’和F(ab)’₂片段。抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，嵌合体，单链和人化抗体，以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表达文库的产物。 

短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)免疫反应”，当涉及蛋白质或肽时，指的是蛋白质和其他生物制品的多种群体中决定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测试条件下，特定的抗体结合特定蛋白至少两倍于背景且基本上没有与样品中存在的其他蛋白质以显著量结合。这样条件下与抗体的特异性结合需要选择抗体对特定蛋白的特异性。例如，可以选择引起特定物种如大鼠、小鼠或人的IαIp复合物的多克隆抗体来获得只与IαIp复合体特异性免疫反应且没有与其他蛋白质反应的那些多克隆抗体，除了多形变体和IαIp复合体的等位基因。通过排除与其他物种的IαIp复合体分子交叉反应的抗体来获得这种选择。可以使用各种免疫测试形式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测试来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了用于测定 特异性免疫反应性的免疫测试形式和条件)。通常特异性或选择性反应至少两倍于背景信号或噪音，更通常高于10至100倍背景。 

如在此所用的“功能等价物”指的是能够呈现与在此所述IαIp蛋白质基本上相似的体内或体外活性的任何蛋白，例如，影响脓毒症的降低。 

例如，通过HPLC或其他本领域技术人员已知的色谱方法来证实IαIp产物的结构和纯度。 

如在此所用的“IαIp复合体”用来包括IαIp蛋白质的所有天然生成的生物活性变体，包括含有删除、插入、添加和取代的蛋白质。IαIp蛋白质的“天然变体”定义为从血浆获得的具有一个或多个氨基酸改变序列的肽。变体可以具有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，异亮氨酸替代亮氨酸。另一实施方案中，变体可以具有“非保守性”改变，例如色氨酸替代甘氨酸。相似变体还可以包括氨基酸删除或插入，或两者。使用本领域公知的计算机程序，例如，DNASTAR软件，可以发现测定哪个和多少氨基酸残基被取代、插入或检测而没有消除生物或免疫活性的指导。 

“删除”定义为其中一个或多个氨基酸或核苷酸残基各自不存在的氨基酸或核苷酸序列改变。 

“插入”或“添加”是与天然生成的IαIp复合体相比较，各自使得一个或多个氨基酸或核苷酸残基添加的氨基酸或核苷酸序列改变。 

各自通过不同的氨基酸或核苷酸替代一个或多个氨基酸或核苷酸形成“取代”。 

术语“生物活性”指的是具有天然生成IαIp复合体的结构、调节或生化功能。同样，“免疫活性”定位为天然、重组或合成IαIp复合体或其任何寡肽诱导合适动物或细胞中特异性免疫反应并与特定抗体结合的能力。 

如在此所用的术语“衍生物”指的是编码IαIp复合体的核酸或编码的IαIp复合体的化学修饰。这样的修饰通过烷基、酰基或氨基替代氢来说明。核酸衍生物将编码保留天然IαIp复合体实质性生物特性的多肽。 

如在此所用的“纯化”指的是从IαIp除去不需要的或污染的蛋白或成分来产生纯化IαIp复合体的步骤。例如，可以通过连续色谱步骤 处理含有生理比例的IαI和PαI的血浆级分来纯化IαIp组合物。 

如在此所用的“分离”指的是从血浆产生血浆级分，其含有生理比例的IαI和PαI。例如，根据本发明通过将血浆进行色谱来获得分离血浆级分。分离的指的是从其原始环境(例如，如果是天然产生的为自然环境)中取出来的材料，并因此从其天然状态“通过人”来改变。例如，分离的多肽或蛋白质可以是血浆的成分，或可以包含于细胞内并认为是“分离的”，因为血浆或特定细胞可以不是多肽的原始环境。 

如在此所用的色谱可以包括阴离子交换色谱。阴离子交换色谱可以是基于颗粒的，例如，DEAE Sepharose，DEAE Sephadex A50，Toyopearl DEAE，TMAE Fractogel，DEAE Fractogel或Q-Sepharose。阴离子交换色谱还可以通过整体载体，例如，带有固定化阴离子交换配体的CIM如DEAE-CIM或Q-CIM。SEPHAROSE是新泽西Pharmacia，Inc.对高分子量物质的商品名，该物质用于大分子凝胶过滤的分离。阴离子交换柱具有两个部分，基质和配体。基质可以是例如纤维素、葡聚糖、琼脂糖或聚苯乙烯。配体可以是二乙基氨基乙基(DEAE)，聚乙烯亚胺(PEI)或季铵官能团。阴离子交换柱的强度指的是配体的离子化状态。强阴离子交换柱，如具有季铵配体的那些，在宽的pH范围内带有永久的正电荷。弱阴离子交换柱中，如DEAE和PEI，正电荷的存在取决于柱子的pH。优选强阴离子交换柱如QSepharose FF或金属螯合Sepharose(例如，Cu2+-螯合Sepharose)。阴离子交换柱通常装填pH高于α-葡糖苷酶pI的低盐缓冲剂。 

本发明的IαIp组合物优选约85％至约100％纯。如在此所用的，术语“纯”指的是从其自然环境中取出的IαIp组合物，分离的或分开的，并至少约85％至约100％无，优选90％无，更优选95％无与其天然相关的其他成分。优选实施方案中，基本上纯化的蛋白质将构成组合物中高于85％、87.5％、90％、92.5％、95％、99％或甚至更高的蛋白质。 

如运用至本发明的“纯化至均一”的肽、多肽或蛋白质意思是肽、多肽或蛋白质具有其中肽、多肽或蛋白质基本上无其他蛋白质和生物成分的纯度水平。任何合适的材料和方法可以用来进行血浆的一个或多个分离步骤来获得纯化的IαIp。 

通常，IαIp的制备涉及样品的分离并收集用来测定含有目标蛋白 的级分。分离的方法包括，例如，固相提取，色谱，例如，阴离子交换色谱，大小排阻色谱，离子交换色谱，肝素色谱，亲和色谱，连续提取，凝胶电泳和液相色谱。制备还可以包括纯化，其包括色谱步骤，例如，离子交换色谱，肝素色谱，亲和色谱，连续提取，凝胶电泳和液相色谱。 

本发明的一实施方案中，通过阴离子交换色谱将样品纯化两次。阴离子交换色谱根据它们的电荷特征将样品中蛋白质粗略地纯化。例如，可以使用Q阴离子交换树脂(例如，Q HyperD F，Biosepra)，并用不同pH的洗提液连续洗提样品。阴离子交换色谱使得样品中更多负电荷的生物分子从其他类型的生物分子中分离出来。用高pH的洗提剂洗提的蛋白可能是弱负电荷的，用低pH的洗提剂洗提的级分可能是强负电荷的。因此，除了降低样品的复杂性，阴离子交换色谱根据它们的结合特性来分离蛋白质。 

再一实施方案中，通过肝素色谱将样品进一步纯化。肝素色谱使得样品中的IαIp复合体进一步纯化，也是基于与肝素相互作用的亲和性和电荷特征。肝素，硫酸化粘多糖，将结合具有正电荷部分的IαIp复合体，并用不同pH或盐浓度的洗提剂连续洗提样品。用低pH的洗提剂洗提的IαIp复合体更可能是弱正电荷的。用高pH的洗提剂洗提的IαIp复合体更可能是强正电荷的。因此，肝素色谱还降低了样品的复杂性并根据它们的结合特性来分离IαIp复合体。 

可以用固定于载体的捕获试剂来捕获IαIp复合体，载体如任何生物芯片、多孔微量滴定板、树脂或随后作为蛋白存在探针的硝基纤维素膜。特别地，可以在表面-提高的激光解吸/离子化(SEIDI)蛋白生物芯片上捕获本发明的IαIp复合体。可以在色谱表面或生物特异性表面上捕获。包括反应性表面的任何SELDI蛋白质生物芯片可以用于捕获和检测本发明的IαIp复合体。这些生物新片可以用特异性捕获IαIp复合体的抗体来衍生，或可以用捕获试剂来衍生，捕获试剂如结合免疫球蛋白的蛋白A或蛋白G。然后使用特异性抗体将IαIp复合体捕获于溶液中和通过捕获试剂在芯片上分离捕获的IαIp复合体。 

根据本发明的公开内容定量蛋白、多肽或肽纯化程度的各种方法是本领域技术人员公知的。这些包括，例如，测定级分的特定蛋白质活性，或通过凝胶电泳测定级分中多肽的数量。 

除了以下详述的那些技术，适用于蛋白质纯化的各种其他技术是本领域技术人员公知的。这些包括，例如，用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性，接着离心；色谱步骤如离子交换步骤，凝胶过滤步骤，反相步骤，羟磷灰石步骤，卵磷脂亲和步骤，免疫亲和色谱和其他亲和色谱步骤；等电点聚焦；凝胶电泳，HPLC；和这些和其他技术的结合。此外，如果认为需要，可以使用本领域标准的方法来进行另外的纯化步骤。这些方法能够充分给予蛋白质的高度纯制备。 

其他实施方案中，可以使用凝胶色谱或分子筛色谱。凝胶色谱是基于分子大小的特定类型分配色谱。凝胶色谱后的原理是柱子，用含有小孔的细颗粒惰性物质制得，当穿过或围绕孔时根据大小将较大分子的从较小分子中分离出来。只要制成颗粒的材料没有吸附分子，决定流速的唯一因素是大小。因此，以递减的大小从柱子中洗提出分子，只要形状是相对恒定的。凝胶色谱对于分离不同大小的分子是不胜任的，因为分离与所有其他因素如pH、离子强度、温度等无关。实际上还不存在吸附，减少的区域分布和洗提体积是与分子量相关的简单因素。 

另一实施方案中，可以使用亲和色谱。亲和色谱是依靠待分离物质和特异性结合分子之间特异性亲和性的色谱方法。即，例如，受体-配体型相互作用。可以通过将结合配偶体之一共价结合不溶基质来合成柱子材料。然后柱子材料能够从溶液中特异性吸附物质。例如，通过将条件改变成不会发生结合的那些来进行洗提(例如，改变pH、离子强度和温度)。 

在此所述的方法适于大规模生产，并形成蛋白质，包括适于治疗给药形式的IαIp复合体和H4。 

如果需要，可以重复在此所述方法的任何分离或纯化步骤来获得较高的纯度。色谱步骤可以是成批的或柱子形式。 

生产本发明的源自血浆的IαIp组合物的优选方法包括从血浆中分离出含有IαI和PαI的血浆级分，其中IαI和PαI以生理比例存在；并纯化血浆级分来获得纯度约85％至约100％纯的IαIp组合物。 

根据本发明的方法还可以包括血浆级分的进一步纯化，例如，通过肝素亲和柱并收集通过(未结合)级分的流出物。 

实施本发明中有用的方法还可以包括在纯化和分离步骤之前和/或 之后将血浆级分和/或纯化IαIp病毒灭活。通常方法包括通过溶剂/去污剂处理或热灭活将病毒灭活。本发明组合物的热灭活或巴氏杀菌，可以为例如约55至约65℃或70至120℃的干热。 

对于溶剂去污剂处理，溶剂和去污剂的特定组合，如，0.3％三-n-丁基磷酸盐(TnBP)结合1％吐温-80，24℃6小时，有效灭活包膜病毒(Horowitz等(1985)Transfusion 25，pp.516-522)。或者，在稳定剂存在下将级分或纯化的IαIp在55-65℃巴氏杀菌足以灭活存在的任何病毒。 

在纯化或分离步骤的过程中，加入稳定剂。IαIp的最终组合物还可以含有稳定剂。例如，合适的稳定剂包括清蛋白，聚乙二醇，α，α-海藻糖，氨基酸，盐，甘油，ω氨基酸如赖氨酸、聚赖氨酸、精氨酸，ε氨基己酸和抗血纤溶环酸，糖，如蔗糖，或其组合。 

本发明的IαIp蛋白质和组合物可以用于治疗人疾病。这样的疾病包括，例如，急性炎症疾病、脓毒正、严重休克、败血症性休克、类风湿性关节炎、癌症、癌转移、早产分娩和传染病。通过从血浆中分离出含有IαI和PαI的血浆级分来制得用于治疗疾病的IαIp组合物，其中IαI和PαI以生理比例存在；和纯化血浆级分来获得IαIp纯度为约85％至约100％纯的IαIp组合物。 

本发明还包括IαIp的药物组合物。IαIp的药物组合物可以是治疗有效量的在此所述的任何IαIp组合物和药物学上可接受的载体。 

例如，根据本发明的药物组合物可以是治疗有效量的IαIp组合物，其是内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中，为约85％至约100％纯。药物组合物还可以是治疗有效量的IαIp组合物，其是内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中，包括与三个重链H1、H2和H3或H1、H2、H3和H4中的至少一个结合的内-α抑制剂蛋白质的轻链。药物组合物还可以是治疗有效量的IαIp组合物，其是内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合物中，并具有高的胰蛋白酶抑制剂特异活性。药物组合物还可以是治疗有效量的IαIp组合物，其是内-α抑制剂蛋白质(IαI)和前-α蛋白质(PαI)的混合物，其中IαI和PαI以生理比例存在于所述混合 物中，并具有高于一小时、五小时或十小时的半衰期。 

术语“药物学上可接受的载体或佐剂”指的是与本发明的组合物一起给药于个体且以足够传送治疗量组合物给药时没有破坏其药物活性并是非毒性的载体或佐剂。 

本发明的药物组合物中所用的药物学上可接受的载体、佐剂和赋形剂包括，但不限于，离子交换剂，铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物传送系统(SEDDS)如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，药物剂型中所用的表面活性剂如吐温或其他相似的聚合传送基质，血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如α-、β-、γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精，或其他溶解的衍生物也可以有利地用于提高在此所述组合物的传送。 

本发明的药物组合物可以口服、非肠道、吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入贮器来给药，优选通过口服给药或通过注射给药。 

本发明的药物组合物可以含有任何常规非毒性的药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。一些情况中，用药物学上可接受的酸、碱或缓冲剂调节制剂的pH来提高配制组合物或其传送形式的稳定性。在此所用的术语非肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑液内、腹板内、膜内、腔内和颅内注射或灌输技术。合适的给药方法可以是片剂、胶囊，或通过静脉内注射。尤其优选注射形式的给药。 

药物组合物可以是无菌注射制剂的形式，例如，作为无菌注射水或油质悬浮液。可以根据本领域已知技术来配制该悬浮液，使用合适的分散或润湿剂(如，例如，吐温80)和悬浮剂。无菌注射制剂还可以是无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如，作为1，3-丁二醇溶液。可接受载体和溶剂中使用的是甘露醇，水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合 成的单-或二甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射制剂中，以及天然的药物学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或通常用于药物学可接受剂型如乳化液和或悬浮液配制中的相似分散剂。为了配制的目的，药物学上可接受固体、液体或其他剂型的制造中常用的其他常用表面活性剂如吐温或司盘和/或其他相似乳化剂或生物利用度提高剂也可以使用。 

本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型来口服给药，包括，但不限于，胶囊、片剂、乳浊液和含水悬浮液、分散体和溶液。在口服使用的片剂的情况中，通常所用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服给药含水悬浮液和/或乳浊液时，将悬浮或溶解于油相中的活性成分结合乳化剂和/或悬浮剂。如果需要，可以加入特定的甜味剂和/或调味剂和/或色素。 

本发明的药物组合物还可以以栓剂的形式给药用于直肠给药。通过将本发明的组合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，该赋形剂在室温是固体的但在直肠温度是液体并因此在直肠中融化来释放活性成分。这样的材料包括，但不限于，可可脂、蜜蜡和聚乙二醇。 

当所需的治疗涉及局部应用容易接近的部位或器官时，本发明药物组合物的局部给药是有用的。对于皮肤的局部应用，应当将药物组合物与含有悬浮或溶解于载体中的活性成分的合适软膏一起配制。用于本发明组合物局部给药的载体包括，但不限于，矿物油，液体石油，白石油，聚丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯组合物，乳化蜡和水。或者，药物制剂可以与合适的洗液或乳剂和合适的乳化剂一起配制，洗液或乳剂含有悬浮或溶解于载体中的活性组合物。合适的载体包括，但不限于，矿物油，山梨聚糖硬脂酸单酯，聚山梨酸酯60，十六烷基酯蜡，鲸芳基醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。本发明的药物组合物还通过直肠栓剂或合适的灌肠制剂局部运用至下肠道。本发明还包括局部经皮的补片。 

本发明的药物组合物可以通过鼻气溶胶或吸入来给药。根据药物制剂领域公知的技术来制备这样的组合物并可以制成盐溶液，使用苯 甲醇或其他合适的防腐剂，提高生物利用率的吸收促进剂，碳氟化合物和/或本领域已知的其他稳定剂或分散剂。 

根据本发明治疗个体疾病的方法，包括给药根据本发明方法产生的治疗有效量的IαIp组合物，这些疾病包括炎症相关疾病例如，类风湿性关节炎、脓毒症或败血症性休克、头部创伤/损伤和脑膜炎，炎症性肠病(节段性回肠炎)，慢性梗阻性肺病，鼻炎；癌症，早产分娩或传染病。 

在此组合物的给药剂量为约1至50mg/kg体重，优选剂量为500mg至1000mg/剂，每4至120小时，或根据特定药物的需要。在此的方法包括给药有效量的组合物来获得所需的或所述的效果。通常，本发明的药物组合物每天或隔天以连续灌输给药约1至约6次。这样的给药可以用作慢性或急性治疗。结合载体物质来产生单次剂量形式的活性成分含量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。典型制剂将含有约5％至约95％的活性组合物(w/w)。或者，这样的制剂含有约20％至约80％的活性组合物。 

高于或低于上述那些的剂量也是有利的。对于特定个体的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定组合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，膳食，给药时间，排泄率，药物组合，疾病的严重程度和过程，病症或症状，个体对疾病、病症或症状的处置，和治疗医生的判断。 

如果需要，病症改善时，可以给药维持剂量的本发明组合物或混合物。随后，作为症状的函数，可以将给药的剂量或频率或两者，减少至维持改善病症的水平，当症状已经缓解至所需水平，治疗应当停止。然而，基于疾病症状的任何复发，个体需要长期的间歇治疗。还可以基于肝脏中的IαIp水平来判断病症的改善。如果发现肝脏中的IαIp为正常生理水平以及通过患者和治疗医生判断患者的症状得到了改善，用维持剂量治疗个体。 

当本发明的组合物包括IαIp组合物和一种或多种其他治疗剂或预防剂的混合物时，组合物和其他药剂存在的剂量水平为通常单治疗方案中给药的约1至100％，更优选约5至95％剂量。其他的药剂可以与本发明的组合物分开给药，作为多剂量方案的一部分。或者，那些药剂可以是单次剂量形式的一部分，与本发明的组合物混合于单个组 合物中。 

治疗个体急性炎症疾病，脓毒症，严重休克，败血症性休克，类风湿性关节炎，癌症，癌转移，传染病，和/或早产分娩的方法，包括以下步骤：测定IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC中一个或多个的治疗前水平；并将治疗有效量的IαIp给药于个体。IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC的治疗前水平是第一次给药IαIp或任何IαIp复合蛋白质前的个体蛋白质水平。治疗后的水平是给药IαIp后测量的IαIp水平。本发明的方法包括测定IαIp治疗初期后IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC中一个或多个的治疗后水平。IαIp水平的调节表示治疗正在产生良好的临床反应。治疗的初期阶段是获得稳定状态的IαIp血浆浓度需要的时间。 

例如通过免疫方法来测定IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC的水平。例如，可以通过各种检测方法来检测和/或测量IαIp复合体，包括，例如，气相离子光谱方法，光学方法，电化学方法，原子力显微镜法，射频方法，表面等离子体共振，椭圆对称免疫和原子力显微镜方法。 

另一实施方案中，可以使用免疫测试来检测和分析样品中的IαIp复合体。该方法包括：(a)提供特异性结合IαIp复合体的抗体；(b)将样品与抗体接触；和(c)检测结合样品中IαIp复合体的抗体复合物的存在。用于本发明方法中的合适抗体包括，MAb69.31，MAb69.26，抗IαIp多克隆抗体(R16或R20)，和抗bikunin单克隆或多克隆抗体。 

免疫测试是使用特异性结合抗原(例如，IαIp复合体)的抗体的测试。免疫测试的特征在于使用特定抗体与分离物、目标的特异性结合特性，和/或定量抗原。短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)免疫反应”，当涉及蛋白质或肽时，指的是蛋白质和其他生物制品的多种群体中决定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测试条件下，特定的抗体结合特定蛋白至少两倍于背景且基本上没有与样品中存在的其他蛋白质以显著量结合。这样条件下与抗体的特异性结合需要选择抗体对特定蛋白的特异性。例如，可以选择引起特定物种如大鼠、小鼠或人的IαIp复合物的多克隆抗体来获得只与IαIp复合体特异性免疫反应且没有与其他蛋白质反应的那些多克隆抗体，除了多形变体和IαIp复合体的等位基因。通过排除与其他物种 的IαIp复合体分子交叉反应的抗体来获得这种选择。 

适于用IαIp治疗的个体可以鉴定为患有炎症、创伤/损伤、肿瘤入侵、肿瘤转移、脓毒症、败血症性休克或传染病。个体可以是自我鉴定或由医师诊断为患有炎症、肿瘤入侵、肿瘤转移、脓毒症、败血症性休克或传染病。个体可以是灵长类、人或其他动物。 

方法还包括和其他治疗剂的共同给药。例如，其他的治疗剂可以是抗癌剂、抗炎剂、抗凝血剂或免疫调节剂。例如，二脱氧核苷，例如，齐多夫定(AZT)，2’，3’-二脱氧次黄苷(ddI)和2’，3’-二脱氧胞苷(ddC)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)和TRIZIVIR(阿巴卡韦+齐多夫定+拉米夫定)，非核苷，例如，efavirenz(DMP-266，DuPontPharmaceuticals/Bristol Myers Squibb)，nevirapine(BoehringerIngleheim)和delaviridine(Pharmacia-Up i ohn)，TAT拮抗剂乳Ro3-3335和Ro 24-7429，蛋白酶抑制剂，例如，印地那韦(Merck)，利托那韦(Abbott)，沙奎那韦(Hoffmann LaRochw)，奈非那韦(AgouronPharmaceuticals)，141W94(Galxo-Wellcome)、atazanavir(BristolMyers Sq uibb)，安普那韦(GlaxoSmithKline)，fosamprenavir(GlaxoSmithKline)，替普那韦(Boehringer Ingleheim)，KALETRA(洛匹那韦+利托那韦，Abbott)，和其他药剂乳9-(2-羟乙氧基甲基)鸟嘌呤(无环鸟苷)，干扰素，例如，α-干扰素，白细胞间介素II和膦酰基甲酸盐(Foscarnet)或登记的抑制剂，例如T20(enfuvirtide，Roche/Trimeris)或UK-427，857(Pfizer)，左旋咪唑或胸腺素，顺铂，卡波铂，多烯紫杉醇，紫杉醇，氟脲嘧啶，卡培他滨，吉西他滨，伊立替康，拓扑替康，足叶乙甙，丝裂霉素，gefitinib，长春新碱，长春碱，阿霉素，环磷酰胺，塞来昔布，罗非昔布，伐地昔布，布洛芬，萘普生，酮洛芬，地塞米松，强的松，强的松龙，氢化可的松，醋氨酚，米索硝唑，氨磷汀，坦索罗新，非那吡啶，恩丹西酮，格非司琼，阿洛司，帕洛诺司琼，异丙嗪，曲美苄胺，aprepitant，氰苯哌酯和阿托品，和/或洛哌丁胺。抗凝血剂如抗凝血酶III，活性蛋白质C和蛋白酶抑制剂如furin抑制剂。 

方法还包括预测对IαIp治疗的反应，测定从个体获得的样品来检测IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC中一个或多个的水平；其中检测的水平表示个体可以良好地反应IαIp治疗。例如，IαI和/或 PαI可检测水平的降低表示个体从IαIp的给药获益。 

方法还包括监控IαIp治疗的个体进程，测定IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC中一个或多个的治疗前水平；将治疗有效量的IαIp给药于个体；并测定IαIp治疗初期后个体中一个或多个的水平，其中IαIp治疗后个体水平的提高表示个体可能对IαIp治疗具有良好的临床反应。 

用于IαIp治疗的药盒包括IαI，PαI，IαIp，H3，H4，H1，H2和LC中的一个或多个；和用于治疗使用的说明书。药盒还包括在此所述的IαIp组合物和使用说明书。例如，药盒可以含有IαI，PαI和提供相关剂量信息、给药形式和保存条件的说明书。 

还涉及容器，容器包括IαIp和插有将IαIp给药于个体的说明书的标签或包装。说明书提供了剂量、给药形式和保存条件的说明。 

实施例

将认识到不应当认为本发明受限于目前所述的实施例；相反，应当认为本发明包括在此提供的任何和所有应用和本领域技术人员技术范围内的所有等价变化。 

实施例1 

作为IαIp复合体一部分的H4的特征 

SELDI-TOF质谱分析表明重链4(H4)也存在于125kDa条带(PαI)和250kDa条带(IαI)中(数据未显示)。250kDa条带中的H4存在更明显。这表示IαI(H1+H2+LC)和PαI(H3+LC)以外的另一种复合体蛋白质可能存在于本发明的一些组合物中。迄今为止，还没有描述过复合形式的H4。游离H4小于125或250kDa。由于质谱结果，我们认为H4可能与bikunin(轻链)或其他的复合。 

实施例2 

脓毒症的动物模型 

将雄性Sprague-Dawley大鼠(275-325g)圈养在控制温度的房间里，12-h亮/暗循环并喂食标准Purina大鼠固型饲料。在诱导脓毒症之前，将大鼠禁食过夜，但可以随意饮水。用异氟烷吸入麻醉大鼠，将 腹颈部、腹部和腹股沟剃毛并用10％聚维酮碘洗涤。进行2-cm中线剖腹术。将盲肠暴露，在回盲瓣末梢结扎以避免肠梗阻，用18-规格的针穿刺两次，轻微挤压使少量的粪便物从孔中流出，并回到腹腔；然后一层层缝合腹部切口。假手术动动物(即，对照动物)经受相同的程序，除了盲肠既没有结扎液没有穿刺。手术后立即用皮下3ml/100g BW生理盐水使动物苏醒。然后在盲肠结扎和穿刺(CLP)或假手术后的不同时间间隔将动物麻醉来收集组织样本。所有实验根据国家健康学会(National Institutes of Health)的实验动物使用准则来进行。该项目得到North Shore Long Island Jewish Research Institute的Institutional Animal Care and Use Committee的批准。 

人IαIp的制备和给药 

作为从人血浆纯化凝血因子VIII而设计的程序的副产物来分离人IαIp(IαI和PαI两者)。该程序涉及冷沉淀物的离子交换和大小排阻色谱。色谱分离后获得约70％的纯度。该含有IαIp的制剂就毒性、血栓形成或低血压而言具有很小的副作用。脓毒症发作后1、5、10或20h时，在异氟烷麻醉下用聚乙烯50-管插管于左股静脉中。通过股导管以恒定的灌输率静脉内给药30mg/kg BW剂量的人IαIp浓缩物或等体积的载体(生理盐水，1.5ml/大鼠)。在之前的实验中，人IαIp的给药在灌输过程中或此后没有改变平均动脉压或心率(数据未显示)。 

RNA提取和肝脏bikunin基因的测定 

肝是bikunin的主要来源。因此，我们测量肝脏中的bikunin mRNA表达。通过Tri-Reagent(Molecular Research Center，Cincinnati，OH)从肝脏提取总RNA。将1.5mlTri-Reagent中的100mg肝组织均质，通过加入氯仿分离成水相和有机相，并离心。通过加入异丙醇从水相中分离出RNA，并用乙醇洗涤。将沉淀溶解于0.1％DEPC-处理的、去离子的蒸馏水中。通过在260和280nm测量吸光率来测定RNA的浓度和纯度。将每个组织的5μg RNA在20μl反应体积中逆转录，反应溶液含有50mM KCl，10mM Tris-HCl，5mM MgCl2，1mM dNTP，20U RNA酶抑制剂，2.5mM寡d(T)16引物和50U逆转录酶。将逆转录反应溶液在42℃孵育1h，接着在95℃加热5分钟。用各自0.15μM 的3’和5’引物扩增lμl的cDNA，引物对大鼠bikuin特异性(633bp)(5’TGA GGA ATA TGC CAT TTT CC 3’，5’CCA CAG TAC TCCTTG CAC TCC 3’)(登录号No.S87544)，大鼠甘油醛-3-磷酸盐-脱氢酶7(G3PDH)(24)(983bp)(5’TGA AGG TCG GTG TCA ACGGAT TTG GC 3’，5’CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC 3’)，在25μl PCR混合物中，含有50mM KCl，10mM Tris-HCl，2mMMgCl2，0.2mM dNTP和0.7U Am pliTaq DNA聚合酶。在Bio-Rad热循环仪上进行PCR。RT-PCR后，将5μl的反应混合物在含有0.22g/ml溴乙锭的1.2％TBE-琼脂糖中电泳。然后产生凝胶并使用Bio-Rad图象系统(Hercules，CA)通过G3PDH将条带强度标准化。 

蛋白质的放射性碘化和IαIp半衰期的测定 

用Na¹²⁵I(Amersham，Arlington Heights，IL)放射性碘化纯化的IαIp，使用1，3，4，6-四氯-3a-6a-二苯基甘脲(IODO-GEN碘化剂；Pierce，Rockford，IL)将。将反应混合物运用至Excellulose GF-5脱盐柱(Pierce)上来除去未掺入的¹²⁵I。在γ粒子计数管(Pharmacia-LKB，Piscataway，NJ)中测定放射性。CLP和假手术后12小时时，用异氟烷吸入将动物麻醉。随后静脉内注射戊巴比妥钠(～30mg/kg BW)来维持镇静的稳定状态。将聚乙烯-50导管放入右颈静脉和左股动脉中，并通过颈套管给药125I-标记的IαIp造影剂团注射(～500,000cpm/大鼠)。用γ粒子计数管测量注射器中剩余的放射性，并从最初的注射前计数减去放射性计数来测定净注射的放射性。注射后立即收集血样，然后每2小时测定循环中₁₂₅I-IαIp的半衰期(t_1/2)8小时。使用γ粒子计数管测量每个样品的放射性(cmp)。根据Wu R，Zhou M，Cui X等：在多微生物脓毒症的晚期降低了ghrelin的清除(Chrelin clearanceis reduced at the late stage of polymicrobial sepsis)来计算t_1/2。Int JMol Med.2003；12：777-782。 

存活研究 

如上所述进行CLP。在CLP后1、5、10或10和20小时时，静脉内灌输人IαIp浓缩物(30mg/kg BW)或载体(生理盐水，1.5ml/大鼠，CLP后1小时时或CLP后10和20小时时)。CLP后20小时 时，切除坏死的盲肠并使用40ml温热的无菌生理盐水溶液将腹腔洗涤两次。然后将腹部切口层层缝合。模拟只要有可能就除去脓毒病灶的临床情况来进行CLP动物中的盲肠切除程序。然后允许动物随意进食和饮水并监控10天来记录存活。 

统计学分析 

将结果表示为平均±SE。使用方差一尾分析(ANOVA)和Tukey测试来比较不同组的实验动物。通过Kaplan-Meier方法来计算存活率并通过对数级测试来比较。如果P＜0.05认为值的差异是显著的。 

CLP后bikunin mRNA表达的改变 

Bikunin是IαIp的活性部分。肝脏是bikunin的主要来源。因此，我们选择肝脏中的bikunin mRNA表达来反应IαIp的产生。如图3所示的，在CLP后5h时，肝脏中bikunin的mRNA表达没有改变，然而，在CLP后20h时于假手水的动物相比较，发现降低32％(P＜0.05)。 

CLP后¹²⁵I-IαIp的t_1/2改变 

通过测量脓毒症发作后12h时注射的放射性标记IαIp的血液含量改变来计算IαIp的半衰期。如图4所示的，CLP后¹²⁵I-IαIp的t_1/2从5.6±0.3h显著提高至11.8±2.7h(P＜0.05) 

IαIp对存活率的效果 

CLP和盲肠切除后单次载体给药(CLP后1h时)的存活率在第2天为75％并在第5-10天降低至50％(图5)。然而，CPL后1h时给药人IαIp在整个10天的观察阶段中将存活率提高至92％(P＜0.05；图5)。尽管在CLP后5或10h时给药人IαIp各自将存活率提高至64％和73％，这些提高没有统计学显著性(图6)。CLP和盲肠切除后两次载体给药(CLP后10和20h时)的存活率在第2天为56％并在第5-10天降低至44％(图7)，与一次载体给药(图5)相比没有显著差异。然而，CLP后10和20h时给药人IαIp在整个10天的观察阶段中将存活率提高至81％，与载体组相比是显著差异的(P＜0.05；图7)。 

脓毒症是特征在于全身炎症、凝血病、呼吸衰竭、心肌功能障碍、 肾机能不全和神经认知缺陷的临床症状。通常认为这种症状是由入侵微生物过量引发的内源炎症介质引起的。这些介质包括激活的单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和嗜中性白细胞释放的物质如细胞因子、反应性氧物质和蛋白酶。严重的炎症反应中，各种血液和组织细胞，包括多核型粒细胞，胞外释放溶菌蛋白酶并进入循环中。这样的蛋白酶以及吞噬过程中正常产生的胞内氧化物质，可以引发组织和器官损伤并提高血浆凝固和补体因子的非特异性水解作用。嗜中性粒细胞蛋白酶的释放，尤其是人白细胞弹性蛋白酶，已经涉及脓毒症个体并发症的进展。他们的血浆水平与感染诱导炎症的严重程度和即将出现的器官衰竭的高度预测性密切相关。 

人败血症性休克的过程中，除了提高的蛋白酶活性，还报道了降低的IαIp水平。IαIp浓度严重降低的个体具有较高的死亡率。我们的结果表明CLP动物肝脏中bikunin的基因表达显著低于假手术动物中的。已经在灵长类、猪和啮齿动物的各种组织中检测到与内-α抑制剂家族蛋白相关的mRNA表达。这些研究表明IαIp家族所有成员来源的基因主要在肝脏中转录。我们的结果也表明了与假手术相比较，在CLP后5或20小时时，其他器官(即，肠和肾脏)中的bikunin基因表达没有显著改变(数据未显示)。 

CLP后20小时时只在肝脏中观察到显著下调表明该器官是IαIp的重要来源，此外，在脓毒症的晚期，肝脏中的bikunin基因表达显著降低。在治疗上，已经报道作为防止胃切除术后的胰腺炎或缓解心脏手术后的器官损伤的预防性治疗，bikunin对人具有有益效果。测定bikunin在致病大肠杆菌菌血症的急性犬模型中效果的研究表明了相似的结果，具有血液动力学变量和心输出量的标准化和平均动脉压的改善。因为bikunin的血浆半衰期非常短(约10分钟)，因此延长bikumin的半衰期来维持该药剂持续的有益效果显现出重要性。我们的结果表明假手术动物中的IαIp半衰期为5.6h。当我们在脓毒症发作后12h时注射放射性标记的IαIp时，我们发现IαIp的半衰期延长至11.8h。这些结果表明在脓毒症过程中IαIp清除率显著降低。然而，即使具有降低的清除率，脓毒症个体中IαIp的血浆水平仍然显著较低。我们之前的研究已经表明脓毒症发作后早期(即，CLP后1小时)给药低纯度IαIp维持心输出量和全身氧传递和提高的全身氧消耗和全身 氧提取率。此外，CLP后20h时IαIp下调TNF-α的产生并减少肝细胞损伤和乳酸酸中毒。此外，脓毒症发作后1h时给药IαIp提高了脓毒症动物的存活。 

作为工业规模血浆分级的副产物来分离人IαIp蛋白。分离方法高度、同时富集了含bikunin蛋白(IαI和PαI)的主要血浆形式。因此，该制备中，获得了血浆IαIp的生理组合物。所进行的死亡率研究结果表明在CLP后1小时时给药IαIp将CLP和盲肠切除后10天时的存活率从50％提高至92％。尽管在CLP后5或10小时时给药人IαIp各自将存活率提高至64％和73％，这些提高没有统计学显著性。 

然而，在CLP后10和20h时给药人IαIp显著地将存活率从44％提高至81％。因此，IαIp看来似乎是有用的添加剂来用于提高多微生物脓毒症进展过程中的存活率。总之，在脓毒症的过程中，肝脏中的bikunin基因表达降低和IαIp的半衰期从5.6±0.3小时提高至11.8±2.7小时，表明尽管清除率降低但下调了脓毒症中的bikunin。CLP后1小时时给药IαIp将存活率从50％提高至92％，而当CLP后5或10h时给药IαIp没有显著提高。然而，CLP后10和20小时两次注射IαIp将存活率从44％提高至81％。延迟但重复的给药人IαIp提高了CLP后的存活率。 

实施例3 

IαIp的纯化 

应用渗析或超滤/渗滤后的洗出液用DEAE Sephadex A50固相提取后，用pH6.0含0.28M氯化钠的0.005M柠檬酸纳/0.0055M磷酸钠缓冲液从DEAE-Sepharose FF柱洗提弱结合的成分(描述于Hoffer等，Journal of Chromatography B 669(1995)187-196)。之前的步骤中，用pH6.0含0.20M氯化钠的0.005M柠檬酸纳/0.0055M磷酸钠缓冲液洗涤柱子。 

对pH7.0的0.005M磷酸钠缓冲液渗析或超滤/渗滤(UF/DF)后，将洗出液运用至羟磷灰石柱。IαIp不结合柱子并作为流出级分收集。可以使用递增浓度的磷酸钠缓冲液梯度来洗提杂质蛋白质，主要是FII、FVII和FX。IαI/PαI含有高于90％的目标蛋白，主要是IαI和PαI。 

实施例4 

从因子IX流出级分中纯化IαIp 

将肝素琼脂糖亲和色谱的未结合蛋白质(L.Hoffer等，J.ofChromatography B)运用至DEAE-Sepharose FF阴离子交换树脂柱上。用最小的三柱体积pH7.0的0.005M磷酸盐缓冲液洗涤柱子后，用pH7.0的含有0.55M氯化钠的0.005M磷酸盐缓冲液(洗提缓冲液)来洗提含IαIp/PαI的级分。洗出液含有约30-40％的IαI/PαI。对pH7.0的0.005M磷酸钠缓冲液渗析或超滤/渗滤(UF/DF)后，将DEAESepharose FF的洗出液运用至羟磷灰石柱。IαI/PαI不结合柱子并作为流出级分收集。可以使用递增浓度的磷酸钠缓冲液梯度来洗提杂质蛋白质，主要是FII和FX。纯化的IαI/PαI含有高于90％的目标蛋白。 

实施例5 

将冷贫瘠血浆在DEAE-Sephadex A50(L.Hoffer等，J.ofChromatography B)或Q-Sephadex A50(D.Josic等，ThrombosisResearch，参考以上的)上的固相提取的洗提液运用至具有80mL柱体积的DEAC-CIM管独石柱上(参考，K.Branovic等，J.ofChromatography A，903(2000)21-32)。收集未结合的级分(流出物)。随后用三柱体积的pH7.4的0.02M Tris-HCl(平衡缓冲液)洗涤柱子。第一步骤中用含有0.35Mol/L氯化钠的pH7.4的0.02M Tris-HCl洗提未结合的蛋白质(洗出液1)，第二步骤中用含有0.55M氯化钠的pH7.4的0.02M Tris-HCl(洗提2)。在流出级分和洗出液1中发现了IαI/PαI。流出级分含有约35-45％的IαI/PαI。洗出液1中这些目标蛋白的量为20-30％。将含有IαI/PαI的级分接受对pH7的0.005M磷酸钠缓冲液的渗析或超滤/渗滤(UF/DF)并运用至羟磷灰石柱。IαIp不结合柱子并作为流出级分收集。流出级分含有高于90％的IαI/PαI。 

图8a和8b描述了如实施例3-5呈现的以流程图表示的IαIp的示例性纯化方案。 

实施例6 

高度纯化的IαIp在动物研究中的有益效果 

在雄性Sprague-Dawley大鼠中通过盲肠结扎和穿刺(CLP)来诱 导多微生物脓毒症。在进行CLP前将动物进食过夜但可以随意饮水。实验时，通过甲基氟烷吸入将大鼠麻醉，并进行2-cm中线剖腹。将盲肠暴露，只在回盲瓣远侧结扎来避免肠阻塞，用18-规格的针穿刺两次，温和地挤压来挤出少量粪便，然后返回腹腔。将腹部切口层层缝合，CLP后将动物立即皮下接受30mL/kg体重生理盐水溶液作为流体苏醒。该实验中使用两组大鼠，每组n＝12。在CLP后10和20小时时治疗组接受30mg/kg体重的高度纯化的IαIp。对照组接受盐水。CLP后20小时时，切除坏死的盲肠并用40mL温热的无菌生理盐水溶液将腹腔洗涤两次。然后将腹部切口层层缝合。进行CLP动物中的盲肠切除程序来模拟其中除去脓毒病灶的临床情况。允许实验动物随意进食并监控10天来记录非存活者的死亡。使用对数级测试来比较不同组动物之间的死亡率并通过Kaplan-Meier方法来测定p值。与盐水对照组相比较，观察到治疗组中存活的显著提高(治疗组中81.3％存活动物对对照组中44％存活(p值＝0.0293))，表明高度纯化的IαIp在降低脓毒症动物的脓毒症相关死亡中是生物活性的和有效的。结果显示于图9中。 

表1.IαIp抑制比活性的比较 

TIU＝胰蛋白酶抑制单位；平均±SD来自单个独立的实验 

计算高度纯化的IαIp(来自冷贫瘠血浆)的抑制比活性并与冷沉淀物纯化的IαIp相比较，冷沉淀物是FVIII因子生产的副产物。在胰蛋白酶抑制测试中使用产色底物L-BAPA(N(α)-苯甲酰-L-精氨酸-4-硝基酰苯胺盐酸盐)(Fluka Chemicals)来测量IαIp的生物活性。该测试是基于IαIp抑制L-BAPA水解的能力。通过410nm处的δ吸光率/分钟的速率降低来监控抑制。通过BioRad蛋白质测试来定量测量蛋白质浓度，并通过竞争性ELISA使用MAb69.31来测量IαIp浓度，如Lim等，J.of Infectious Disease，2003中所述的。从冷贫瘠血浆和冷沉淀物纯化的IαIp制剂之间的特异性胰蛋白酶抑制活性没有显著差异(p值＝0.939)，表明两种级分中的IαIp具有相当的生物活性。 

实施例7 

来自FIX纯化的副产物 

“洗涤级分”来自DEAE-Sepharose FF上的凝血因子FIX色谱纯化(Josic等，Journal of Chromatography，以上所引的)。用pH6.0的含有0.25M氯化钠的0.01-0.1M柠檬酸钠/0.005-0.1M磷酸钠缓冲液来洗提该级分。IαI和PαI是该级分中的主要成分。在下一步骤中用pH6.0的含有0.3-0.6M氯化钠的0.01-0.1M柠檬酸钠/0.005-0.1M磷酸钠缓冲液从DEAE-Sepharose FF柱洗提含FIX的级分。该级分中还含有其他维生素K依赖性凝血因子如凝血因子II(FII)、凝血因子X(FX)、较低含量的凝血因子VII(FVII)和残留量的IαIp。降低渗透压和盐浓度的渗析后，通过固定肝素上的亲和色谱以及递增盐浓度和渗透压缓冲剂中的洗提步骤来收集FIX级分中的残余IαIp。早期洗提步骤的洗涤缓冲液中的级分含有超过80％的IαIp和非常低的FIX杂 质。FIX的洗提发生在较后的较高盐浓度和渗透压缓冲液步骤中。还存在不结合柱子的流出级分，是无FIX的并含有IαIp(30-40％)、维生素K依赖性凝血因子和用于病毒灭活的溶剂/去污剂(S/D)的混合物。可以在另外的DEAE-Sepharose FF色谱步骤中除去S/D。 

从DEAE-Sepharose收集含IαIp的级分，固定于肝素或肝素的流出物可以单独地进一步纯化或作为羟磷灰石的集合。使用任一种方法，最终的制剂含有高于90％的ITI。 

使用这些程序纯化的浓缩物含有高于90％的IαI/PαI。已经通过溶剂/去污剂处理将病毒灭活。可以引入用或不用稳定剂的最后容器中的最终加热超过30分钟或在稳定剂存在下55-65℃巴氏杀菌来作为第二个病毒灭活步骤而活性没有显著丢失。 

用S/D处理或作为第二个灭活步骤，用或不用稳定剂将纯化的蛋白质最终加热30分钟，或者，在稳定剂存在下55-65℃巴氏杀菌将所得到的含有高于90％IαI/PαI的浓缩物灭活病毒。 

强阴离子交换级分 

替代弱阴离子交换DEAE Sephadex A50固相提取后的洗出液，可以使用强阴离子交换Q Sephadex A50固相提取后的洗出液。洗提的条件描述于德国专利DE 4342131C1中。IαI和PαI的混合物不结合或只是微弱地结合整体阴离子交换载体DEAE-CIM。在分开的级分中洗提出其他蛋白质如凝血因子FII、FVII、FIX和FX，凝血抑制剂PC、PS和PZ，粘着蛋白玻连蛋白和蛋白酶FSAP。在下一步骤中使用羟磷灰石色谱可以获得剩余杂质的进一步分离。 

整体色谱级分 

DEAE CIM整体(膜)可以用于FIX纯化中的色谱分离来替代DEAE Sepharose FF或其他基于颗粒的阴离子交换器(参见DE4342132C1)。令人惊讶地，IαI和PαI不结合或只是微弱地结合整体载体。其他蛋白质，如FIX、玻连蛋白和FII、FVII(低量)和FX作为分开的级分得到洗提。在该纯化步骤中，主要来自因子VII激活蛋白酶(FASP)的蛋白水解活性(J.Roemisch，Biological Chemistry 383(2002)1119-1124)也得到了充分地分离。在下一步骤中使用羟磷灰 石色谱来获得含IαI/PαI级分的剩余杂质的进一步分离，即痕量维生素K依赖性凝血因子FII、FVII和FX。 

该申请中引用的所有出版物和专利文件以其整体引入作为参考用于所有目的至相同程度，好像每个独立的出版物和专利文件是单独表示的。除非另外指出，在此所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意思。以下的参考文献给技术人员提供了本发明中所用的许多术语的一般定义：Singleton等，微生物和分子生物学字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；剑桥科技字典(The Cambridge Dictionary of Science andTechnology)(Walker编辑，1988)；遗传学术语(The Glossary ofGenetics)，第5版，R.Rieger等(编辑)，Spring Verlag(1991)；和Hale&Marham，Harper Collins生物学字典(The Harper CollinsDictionary of Biology)(1991)。 

引入参考文献 

贯穿本申请所引用的所有参考文献(包括参考文献，公开的专利，公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容在此特意以其整体引入作为参考。 

等价物 

本领域技术人员使用不超出常规的实验将认识到或能够确定在此所述的本发明特定实施方案的许多等价物。确定这样的等价物由以下的权利要求所包括。