副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及制备方法，该疫苗由已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种作为抗原，以及兽医学可接受的佐剂制成，可同时免疫预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌引起的猪链球菌病及二者的混合感染，该疫苗副作用小，不含内毒素和血清中不含杂蛋白，具有较好的免疫安全性，临床上达到一针多防的效果，降低成本，并可以满足不同用户的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及畜类生物制药技术领域，具体地说，本发明涉及一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法。 

背景技术

副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病是目前我国猪群中最主要的两种细菌传染病。副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率可达40％，死亡率可达50％。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于我国目前饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。 

猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病，表现为急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等，在特定诱因作用下，发病猪死亡率可达80％，严重影响养猪业的发展。猪链球菌病在我国华南、西南、华东、江西及江苏等地曾大面积爆发流行过，发病率和死亡率都较高，造成了严重的经济损失，主要血清型为兰氏C群，其次为兰氏D群、E群。近年来，在猪链球菌 众多血清型中，猪链球菌2型(R群)是猪的最主要病原，致病性最强，从表征健康的猪体扁桃体内分离的所有猪链球菌中，2型多达50.6％，而且可感染特定人群发病，并可致死亡，危害严重，其中1998年江苏部分地区爆发的猪链球菌，造成25人感染，14人死亡；2005年四川部分地区爆发2型疫情，造成205人感染，37人死亡；根据流行病学调查资料显示，我国C群链球菌依然存在，而猪链球菌2型有后来居上的趋势。 

采用疫苗进行免疫预防是国内外控制副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病的根本手段，而市场销售的商品疫苗只有副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322+血清5型SH0165)、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清1型SV1+血清6型SV6)，猪链球菌C群活疫苗、猪链球菌二价灭活疫苗(2型+马链球菌兽疫亚种)，这些疫苗的应用起到了一定的预防作用，但随着病原流行株和混合感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大；另外同时针对控制副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病的疫苗，国内外也还是空白。因此，需要发明一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株)以解决上述问题。 

专利CN101745105A公开了一种猪链球病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法，该疫苗是以已灭活的兰氏C群马连球菌兽疫亚种C55138株培养液，猪链球菌2型HA9801株培养浓缩液，巴氏杆菌荚膜A群菌培养浓缩液、巴氏杆菌荚膜B群菌培养浓缩液等菌量混合作为抗原，以氢氧化铝凝胶作为佐剂制成，其浓缩过程采用沉淀法，去除毒素过程中不能最大限度去掉内毒素和培养基中的血清杂蛋白。 

专利CN101721696A公开了一种猪副嗜血菌血清4型、5型、13型三价油乳剂灭活疫苗。它是应用我国猪副嗜血菌三个主要的流行血清型和分离株作为抗原，通过用TSB肉汤培养扩繁24h后，经过0.3％甲醛灭活11～13h，三个血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合，然后加入与抗原总体积相等的油相，再经乳化制备而成。该疫苗佐剂为白油，此佐剂疫苗副反应较大，会在注射部位形成炎症或肿胀；另外据研究 资料显示，使用矿物油佐剂会在一定程度上激发和提高猪圆环等猪病的发病率。而且，该疫苗制备过程中，所获得的抗原没有灭活后灭活效果的判定及相关检验，无法得知抗原灭活是否完全，所获得的抗原不能作为制苗用抗原。 

因此，现急需发明一种副作用小，不含内毒素和不含杂蛋白，可同时免疫预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌引起的猪链球菌病及二者的混合感染，安全有效的疫苗及其制备技术。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足提供一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及制备方法，该疫苗由已灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus Parasuis Serotype4，Strain JS；保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；保藏日期为2011年5月18日，保藏号为CCTCC NO：M 2011172)、5型ZJ株(Haemophilus Parasuis Serotype 5，Strain ZJ；保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；保藏日期：2011年5月18日，保藏号：CCTCC NO：M 2011173)、猪链球菌血清2型SC株(Streptococcus suis Serotype 2，Strain SC；保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；保藏日期：2011年10月12日，保藏号：CCTCC NO：M 2011351)和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus；购于美国菌种保藏中心，American Type Culture Collection，简称ATCC)抗原，以及兽医学可接受的佐剂制成，可同时免疫预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌引起的猪链球菌病及二者的混合感染，该疫苗副作用小，不含内毒素和血清中不含杂蛋白，具有较好的免疫安全性。 

为此，本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗，包括：抗原和佐剂，其中，所述抗原包含副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的灭活抗原浓缩-重悬稀释液。所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的灭活抗原浓缩-重悬稀释液的总含量为疫苗总量的 70％～90％(V/V)。所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的灭活抗原浓缩-重悬稀释液的体积比为2.5∶2.5∶1∶1～3.5∶3.5∶1∶1。 

上述用语“疫苗总量”指的是抗原和佐剂的总量。 

在本发明的一个优选实施例中，所述疫苗含副猪嗜血杆菌血清4型JS株灭活抗原浓缩-重悬稀释液灭活前活菌数不少于1.0×10⁹CFU/mL；所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株灭活抗原浓缩-重悬稀释液灭活前活菌数不少于1.0×10⁹CFU/mL；所述猪链球菌2型SC株灭活抗原浓缩-重悬稀释液灭活前活菌数不少于5×10⁸CFU/mL；所述马链球菌兽疫亚种灭活抗原浓缩-重悬稀释液灭活前活菌数不少于5×10⁸CFU/mL。 

在本发明的一个其他实施例中，本发明所述抗原还可以采用其他致病性副猪嗜血杆菌血清型菌株以及其他猪链球菌血清型菌株；所述其他致病性副猪嗜血杆菌血清型菌株包括副猪嗜血杆菌血清2型、血清12型、血清13型等中的一种或两种；其他猪链球菌血清型菌株为猪链球菌血清7型。 

根据本发明，所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂，其含量为10％～30％(V/V)。所述兽医学可接受的水性佐剂为Montanide GEL系列佐剂，包括GEL 01PR或Montanide PET GEL A。 

在本发明的一个优选实施例中，所述疫苗中还含有防腐剂，包括硫柳汞、二甲基汞或叠氮钠，其含量为疫苗总量的0～0.01％(V/V)。 

本发明还提供了一种本发明所述疫苗的制备方法，包括： 

步骤A，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种分别进行繁殖制备其生产用毒株，并对该产物进行纯粹检验； 

步骤B，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种生产用毒株分别接种到其制苗用培养基中进行增殖培养制得抗原液，并对该产物进行纯粹检验及活菌计数； 

步骤C，副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2 型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种抗原液分别经灭活制得其灭活抗原液，并对该产物进行灭活检验和安全性检验； 

步骤D，副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种灭活抗原液分别经浓缩制得其灭活抗原浓缩液； 

步骤E，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种灭活抗原浓缩液与佐剂混合乳化制备副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活乳剂疫苗，并对该产物进行无菌检验、安全检验和效力检验； 

步骤F，副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活乳剂疫苗分装、贮存； 

其中，步骤E包括用稀释剂将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原浓缩液重悬稀释；将所获得的四种抗原浓缩-重悬稀释液混合，再加入佐剂混合乳化，并在乳化结束前加入防腐剂，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗。 

根据本发明，步骤E中所述稀释剂为生理盐水；所述重悬稀释包括：将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原浓缩液稀释至浓度为2.8×10⁹CFU/mL～4.5×10⁹CFU/mL，将猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原浓缩液均稀释至5.0×10⁹CFU/mL～5.5×10⁹CFU/mL。 

根据在本发明方法，步骤A包括对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种进行一级种子繁殖及二级种子繁殖制得副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种生产用毒株。 

在本发明的一个具体的实施例中，对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种进行一级种子繁殖。将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD平板上，于37℃条件下，培 养18～24h，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，于37℃条件下，培养12～16h，作为一级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株冻干菌种，分别划线接种于Clumbia羊血平板上，于37℃条件下，培养18～24h作为一级种子。 

在本发明的另一个实施例中，对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型R群SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种进行二级种子繁殖。将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株取一级种子的培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16h，经检验纯粹后作为二级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株分别选取符合要求的一级种子，接种于含有15ml/L犊牛血清的改良马丁肉汤培养基中，于37℃条件下，静置培养12～16h，经羊血平板纯粹检验合格后作为二级种子；将所获得的二级种子用作生产用毒株。 

根据本发明方法，步骤B中所述制苗用培养基包括：副猪嗜血杆菌培养基及其辅助因子，猪链球菌培养基及其辅助因子；其中，所述副猪嗜血杆菌培养基为胰酪胨大豆肉汤培养基，其辅助因子包括小牛血清、葡萄糖；所述猪链球菌培养基为改良马丁肉汤培养基，其辅助因子包括犊牛血清、葡萄糖。 

在本发明的一个具体的实施例中，接种副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株生产用毒株所采用的制苗用培养基为市售副猪嗜血杆菌培养基(TSB：胰蛋白胨17.0g/L、大豆蛋白胨3.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾15.0g/L)；接种猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种生产用毒株所采用的制苗用培养基为猪链球菌培养基(改良马丁肉汤：蛋白胨5.0g/L、硫酸镁0.5g/L、葡萄糖20.0g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L)。 

在根据本发明方法的一个实施例中，步骤C分别向增殖培养获得的副猪嗜血杆菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液和猪链球菌2型SC株、猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种抗原液中按总量的0.2％(V/V)分别加入甲醛溶液，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次。 

在根据本发明方法的另一个实施例中，也可以采用β-丙内酯 (BPL)、缩水甘油醛(GDA)、⁶⁰Co照射和加热等其他灭活方法。 

根据本发明方法，步骤D采用切向流超滤系统进行浓缩，并同时除去毒素和杂蛋白，所用超滤膜的截留分子量为500KD～1000KD。 

在本发明的一个其他的实施例中，步骤D还可以采用其他分离技术进行浓缩，并同时除去毒素和杂蛋白。所属其他技术包括：离心法、中空纤维超滤法、石棉及活性碳吸附法、凝胶层析法、铝胶吸附沉淀法等。 

在根据本发明方法的一个实施例中，步骤F以适量体积分装副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗，盖上瓶塞，并压铝盖。 

根据本发明方法，所述疫苗的制备过程中，步骤A包含对所获得的生产用毒株进行纯粹检验；步骤B包含对所获得的四种抗原液进行纯粹检验及活菌计数；步骤C包含对所获得的灭活抗原液进行灭活检验和安全性检验；步骤E包含对所获得的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗进行物理性状检验、无菌检验、安全检验和效力检验。以确保疫苗的安全性、可靠性。 

根据本发明，所述纯粹检验是在培养结束后，取样，并根据《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录对样品进行纯粹检验，结果应为纯粹。所述活菌计数是在培养结束后，取样，副猪嗜血杆菌用TSA/NAD平板培养进行活菌计数；猪链球菌用血琼脂平板进行活菌计数，以确定培养的菌数。所述无菌检验是按照《中华人民共和国兽药典》附录对待测样品进行无菌检验，结果应为无菌生长。 

在根据本发明方法的一个具体实施例中，步骤C对所获得的灭活抗原液进行灭活检验，是取已经灭活的副猪嗜血杆菌抗原液5mL接种于100mL含0.01％～0.05％NAD、5％～10％的血清、0.1％～5％的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37℃培养24h，再移植于上述100mL培养基中37℃培养24h；取灭活的副猪嗜血杆菌抗原液0.5mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24h。两种方法培养后，均应无菌生长。 

取已经灭活的猪链球菌抗原液5mL接种于100mL加入1.5％的犊牛血清、0.1％～5％的葡萄糖改良马丁肉汤培养基，37℃培养24h，再 移植于上述100mL培养基中37℃培养24h；取已经灭活的猪链球菌菌液0.5mL划线接种于羊血琼脂平板培养基，37℃培养24h。两种方法培养后，均应无菌生长。 

在根据本发明方法的另一个具体实施例中，步骤C对已灭活抗原液进行安全性检验，是取已灭活的菌液分别静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。 

在根据本发明方法的又一具体实施例中，步骤E对副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗进行安全检验。 

对小白鼠的安全性：取三批副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗分别接种18～22g的Balb/C小鼠，每只皮下注射0.4ml，观察14日，无局部反应且全部健活为合格。 

对仔猪的安全性：取三批副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗各肌肉注射30日龄健康易感猪5头，每头4mL，14日内无局部反应且全部健活为合格。 

根据本发明方法，对副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗进行效力检验。 

Balb/C小鼠效力试验：18～22g的Balb/C小鼠，皮下接种0.1mL二联灭活苗，免后28天分成3组，连同对照组每组各10只，分别用副猪嗜血杆菌血清4型JS株腹腔注射5LD₅₀(含菌量为4.0×10⁹CFU)，5型ZJ株进行腹腔注射5LD₅₀(含菌量为2.5×10⁹CFU)；猪链球菌2型SC株皮下注射2LD₅₀(含菌量为1.0×10²CFU)，猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株皮下注射5LD₅₀(含菌量为4.0×10²CFU)另外10只设为空白对照，观察14天。 

仔猪效力试验：取副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗，每组疫苗各用21～35日龄的健康易感猪20头，每头肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为四组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株各自攻毒。对照猪20头，分四组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株。 

副猪嗜血杆菌血清4型JS株：选取免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量的血清4型JS株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病。 

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量的血清5型ZJ株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病。 

猪链球菌2型SC株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，静脉注射1个致死量的猪链球菌2型SC株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。 

马链球菌兽疫亚种ATCC35246株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，静脉注射1个致死量的猪链球菌马链球菌兽疫亚种ATCC35246株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。 

本发明基于现有技术不足而提供一种可以同时预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌引起的猪链球菌病及二者的混合感染的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种)。该疫苗副作用小，不含内毒素和血清中不含杂蛋白，具有较好的免疫安全性，临床上达到一针多防的效果，降低成本，并可以满足不同用户的要求。 

菌种保藏

副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus Parasuis Serotype 4，Strain JS)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号：CCTCC NO：M 2011172。 

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus Parasuis Serotype 5，Strain ZJ)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞 珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号：CCTCC NO：M 2011173。 

猪链球菌血清2型SC株(Streptococcus suis Serotype 2，Strain SC)，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期：2011年10月12日，保藏号：CCTCC NO：M 2011351。 

猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus)，购于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，简称ATCC)。 

为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。 

具体实施方式

下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。 

本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二○一○年版)》及附录。其他未注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。 

实施例 

实施例1：制备副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株) 

1.制备生产用毒株 

对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株进行一级种子繁殖及二级种子繁殖制得副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的生产用毒株。 

(1)一级种子繁殖 

对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株进行一级种子繁殖。将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD 平板上，于37℃条件下，培养18h，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，于37℃条件下，培养12h，作为一级种子；猪链球菌2型SC株、、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株冻干菌种，划线接种于Clumbia羊血平板上，于37℃条件下，培养18h作为一级种子。 

(2)二级种子繁殖 

对副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株一级种子进行二级种子繁殖。将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株一级种子，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12h，经纯粹检验合格后作为二级种子；猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株选取符合要求的一级种子，接种于含有15ml/L犊牛血清的改良马丁肉汤培养基中，于37℃条件下，静置培养12h，经羊血平板纯粹检验合格后作为二级种子，将所获得的二级种子用作生产用毒株。 

2.制备抗原液 

(1)制备抗原液 

在副猪嗜血杆菌培养基(市售TSB：胰蛋白胨17.0g/L、大豆蛋白胨3.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾15.0g/L)中，加入0.05％NAD、10％的血清、5％的葡萄糖配制成制苗培养基，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株生产用毒株分别按1％的量加进制苗培养基中，各自混合均匀后，分别进行培养。培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为180rmp，DO为80～0，pH值为7.2～6.5，培养时间为18h。当培养液液的浓度OD₆₀₀达到2.5以上、DO值降至0后又开始上升、pH值降低至6.5以下时停止培养，分别收获抗原液。 

在猪链球菌培养基(市售改良马丁肉汤：蛋白胨5.0g/L、硫酸镁0.5g/L、葡萄糖20.0g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L)中，加入1.5％的犊牛血清、5％的葡萄糖配制成制苗培养基，将猪链球菌2型SC株、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株生产用毒株按5％的量加进制苗培养基中，混合均匀后进行培养。培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为200rmp，DO为80～0，pH值7.4～6.5，培养时间为18h。 当培养液的浓度OD₆₀₀达到2.5以上、DO值降至0后又开始上升、pH值降低至6.0以下时停止培养，分别收获抗原液。 

(2)纯粹检验 

培养结束后，分别从所获得的四种抗原液中取样，根据《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录进行纯粹检验，应纯粹。 

(3)活菌计数 

分别从所获得的四种抗原液中取样，副猪嗜血杆菌用TSA/NAD平板培养进行活菌计数；猪链球菌用血琼脂平板进行活菌计数，以确定培养的菌数。 

3.抗原液灭活 

(1)抗原液灭活 

检验合格的抗原液分别进行灭活。向上述四种培养好的抗原液中，按总量的0.2％(V/V)加入甲醛溶液，并于37℃条件下灭活24h，期间搅拌5次。 

(2)灭活检验 

分别取已经灭活的2种副猪嗜血杆菌抗原液5mL接种于100mL含有0.05％NAD、10％的小牛血清、5％的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，在37℃条件下培养24h，再移植于上述100mL培养基中，并于37℃条件下培养24h；取灭活的2种副猪嗜血杆菌菌液0.5mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，于37℃条件下培养24h。两种方法培养后，均应无菌生长。 

取已经灭活的猪链球菌抗原液5mL接种于100mL，含有1.5％的犊牛血清、5％的葡萄糖的改良马丁肉汤培养基中，于37℃条件下培养24h，再移植于上述100mL培养基中，于37℃条件下培养24h；取已经灭活的猪链球菌抗原液0.5mL划线接种于羊血琼脂平板培养基，于37℃条件下培养24h。两种方法培养后，均应无菌生长。 

(3)安全性检验 

取上述四种灭活抗原液分别静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。 

4.超滤浓缩 

将上述四种灭活抗原液用美国Millipore公司的Pellicon切向流超滤系统浓缩，制得其灭活抗原浓缩液。 

5.配制副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株) 

(1)第一批(批号09001) 

用生理盐水重悬稀释上述四种灭活抗原浓缩液，参照菌落计数结果，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原浓缩液稀释至浓度至少为4.5×10⁹CFU/mL，将猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的抗原浓缩液稀释至浓度为5.0×10⁹CFU/mL。将四种抗原浓缩-重悬稀释液按2.5∶2.5∶1∶1的体积比混合。按照70％(V/V)的量取四种抗原浓缩-重悬稀释液混合物，再按照30％(V/V)量加入佐剂混合乳化，并在乳化结束前加入疫苗总量的0.01％(V/V)的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗。 

(2)第二批(批号09002) 

用生理盐水重悬稀释上述四种灭活抗原浓缩液，参照菌落计数结果，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原浓缩液稀释至浓度为3.3×10⁹CFU/mL，将猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的抗原浓缩液稀释至浓度为5.5×10⁹CFU/mL。将四种抗原浓缩-重悬稀释液按3.0∶3.0∶1∶1的体积比混合。按照80％(V/V)的量取四种抗原浓缩-重悬稀释液混合物，再按照20％(V/V)量加入佐剂混合乳化，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗。 

(3)第三批(批号09003) 

用生理盐水重悬稀释上述四种灭活抗原浓缩液，参照菌落计数结果，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原浓缩液稀释至浓度为2.8×10⁹CFU，将猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的抗原浓缩液稀释至浓度为5.5×10⁹CFU/mL。将四种抗原浓缩-重悬稀释液按3.5∶3.5∶1∶1的体积比混合。按照90％(V/V)的量取四种抗原浓缩-重悬稀释液混合物，再按照10％(V/V) 量加入佐剂混合乳化，并在乳化结束前加入疫苗总量的0.01％(V/V)的二甲基汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗。 

6、疫苗的物理性状检测、无菌检验 

对所制备的3批副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种)(批号分别为09001、09002、09003)进行物理性状检测，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，结果无菌生长(见表1)。 

表1二联灭活疫苗物理性状检验及无菌检验 

注：T.G表示硫乙醇酸盐培养基，G.A表示酪胨琼脂培养基，G.P葡萄糖蛋白胨培养基；“-”表示无菌生长。 

7、分装、贮存 

以20mL/瓶、50mL/瓶、100mL/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖，于2～8℃贮存。 

实施例2：安全性研究 

(1)疫苗对Balb/C小鼠的安全性试验 

取制备的三批疫苗(批号09001、09002、09003)分别接种18～22g的Balb/C小鼠，每只皮下注射0.4ml，观察14天，结果见表2，所有Balb/C小鼠无局部反应且全部健活。 

表2疫苗对Balb/C小鼠的安全性试验结果 

  疫苗批次   注射只数   死亡只数   局部反应只数   合格率   09001   10   0   0   5/5   09002   10   0   0   5/5   09003   10   0   0   5/5   对照组   10   0   0   5/5

(2)疫苗对仔猪的安全性试验 

取制备的三批疫苗(批号09001、09002、09003)分别肌肉注射30日龄健康易感猪各5头，每头4mL，14天内无局部反应且全部健活，检验结果见表3。 

表3疫苗试验结果 

  疫苗批次   注射头数   死亡头数   局部反应头数   合格率   09001   5   0   0   5/5   09002   5   0   0   5/5   09003   5   0   0   5/5   对照组   5   0   0   5/5

从安全性试验结果可以看出，副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株)对Balb/C小鼠、仔猪安全。 

实施例3：效力试验(在本公司试验动物房进行试验) 

(1)疫苗对Balb/C小鼠效力试验 

18～22g的Balb/C小鼠，皮下接种0.1mL二联灭活苗，免后28天分成3组，连同对照组每组各10只，分别用副猪嗜血杆菌血清4型JS株腹腔注射5LD₅₀(含菌量为4.0×10⁹CFU)，5型ZJ株进行腹腔注射5LD₅₀(含菌量为2.5×10⁹CFU)；猪链球菌2型SC株皮下注射2LD₅₀(含菌量为1.0×10²CFU)，猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株皮下注射5LD₅₀(含菌量为4.0×10²CFU)另外10只设为空白对照，观察14天，检验结果见表4。 

表4疫苗对Balb/C小鼠效力试验结果 

(2)仔猪效力试验 

每组疫苗各用21～35日龄的健康易感猪20头，每头肌肉注射2mL，含1个使用剂量，28天后，将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为四组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株各自攻毒。对照猪20头，分四组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株。 

副猪嗜血杆菌血清4型JS株：选取免疫猪各5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量(2.0×10¹⁰CFU)的血清4型JS株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病。 

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射1个发病量(1.0×10¹⁰CFU)的血清5型ZJ株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病。 

猪链球菌2型SC株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，静脉注射1个致死量(5.0×10⁸CFU)的猪链球菌2型SC株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡。 

马链球菌兽疫亚种ATCC35246株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，静脉注射1个致死量(3.0×10⁹CFU)的猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株菌液，观察14天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡，疫苗效力检验结果见表5。 

表5疫苗对仔猪效力检验结果 

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。 

从上述实施例可以看出，副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联Montanide GEL PR佐剂灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株)对Balb/C小鼠的保护率能达到90％以上、对仔猪保护率达到80％以上，均对副猪嗜血杆菌、猪链球菌感染具有良好的保护力，且四种组份抗原最佳混合体积比为3.5∶3.5∶1∶1，按照90％(V/V)的量取四种抗原浓缩-重悬稀释液混合物，按10％(V/V)量加入Montanide GEL PR佐剂制备的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗免疫效果良好，且成本最低。 

实施例4：疫苗对比试验 

随机抽取检验合格的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株)批号为09003的疫苗若干瓶和市场上出售的由武汉科前生物公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型+5型)批号为100409、上海海利生产的猪链球菌病灭活疫苗(马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型)批号为10080，分别在仔猪体进行安全性和免疫猪攻毒保护效力分别作对比试验，试验结果见表5、6。 

表5安全性试验结果 

 疫苗批号   仔猪头数   死亡头数   局部反应头数  09003   20   0   0  市售产品(4型+5型)   20   0   5

 市售产品(马链球菌兽疫 亚种+猪链球菌2型)   20   0   0  对照组   5   0   0

表6免疫攻毒试验结果 

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。 

根据试验结果可以看出，用Montanide GEL PR为佐剂制成的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+马链球菌兽疫亚种ATCC35246株)不仅使用方便，更为安全，而且免疫效果与单独两种单苗联用效果相当；并能预防副猪嗜血杆菌和链球菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病，达到一针多防，低成本，具有很好的市场前景。