一种疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤：1）在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白混合；2）将混合的蛋黄和蛋白下反复冻融三次以上；3）将冻融后的混合样与PBS缓冲液混合均匀；4）将混合均匀的混合液离心，取上层清液备用；5）采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中五种病的抗原。采用本发明的疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，不需到SPF鸡舍采集种鸡血液进行检测SPF蛋的质量，由SPF蛋中的蛋白和蛋黄即可快速检测SPF蛋内不易检测到的五种病毒，方便SPF蛋的疫苗生产厂家在应用SPF蛋之前检测SPF蛋的质量检测，减少生产风险。

说明书

技术领域

本发明涉及SPF蛋，尤其涉及疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法。

背景技术

兽用生物制品是一种特殊的药品，其质量的好坏直接关系到畜禽疫病防控效果和我国畜牧业的发展，由于原材料的原因，常使疫苗污染外源病毒，而这也是我国疫苗与进口疫苗产生质量差距的主要原因。

SPF蛋（无特定病原体的蛋）作为一种特殊的疫苗生产原材料，不论是在病毒学、营养学、病理学研究，还是在生物制品生产、检验中，都是不可缺少的标准实验材料。SPF蛋质量的好坏直接关系到科学研究的成果和生物制品的质量。目前监控SPF蛋的质量检测手段主要是通过采种鸡的血液，分离血清，检测血清中的抗体进行间接性判定。

按照国家标准，SPF蛋需检测的19种病源是：鸡白痢沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸡毒支原体、滑液囊支原体、禽流感病毒、新城疫病毒传染性、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、马立克氏病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽腺病毒Ⅲ群、禽腺病毒Ⅰ群、禽痘病毒。以上19中病源中，禽痘病毒是不经过蛋传播的，在做蛋的检验时可以不要检验，其他的病毒很多都是可以用比较简单的办法排除，具体如下表格1。但是淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒这五种病毒不但可以经蛋传播，同时也是疫苗出厂前外源病毒检测的重点和难点，直接影响疫苗的安全性，所以在SPF蛋投入应用生产疫苗前检测以上这五种病毒是十分必要的。

表格1：

病原细菌分离平板凝集血凝性琼脂扩散禽腺病毒Ⅲ群  √ 禽腺病毒Ⅲ群  √ 鸡白痢沙门氏菌√√  副鸡嗜血杆菌√√√ 多杀性巴氏杆菌√   鸡毒支原体√√  滑液囊支原体√√  禽流感病毒  √ 新城疫病毒传染性  √ 传染性支气管炎病毒  √ 传染性喉气管炎病毒   √传染性法氏囊病病毒   √马立克氏病毒   √

生产疫苗厂家往往因为生物安全问题无法直接接触到SPF种鸡，故通过SPF种鸡血清检验SPF蛋质量对疫苗生产单位不现实，甚至无法实现。受疫苗生产的时间限制，SPF蛋在投入使用前需要检测其质量，从而减少疫苗生产厂家的生产成本，但根据目前SPF蛋的检验方法还无法快捷、方便地进行SPF蛋的质量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种疫苗厂家可直接方便、快捷地对SPF蛋进行质量检测，从而降低企业生产成本的疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明一种疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤： 

1）：在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白按体积比2-3：1混合；

2）：将步骤1）混合的蛋黄和蛋白在-70℃条件下反复冻融三次以上；

3）：将步骤2）冻融后的混合样与PH7.2的PBS缓冲液按1：2-3的体积比混合均匀；

4）：在2-8℃下，将步骤3）混合均匀的混合液离心10-15分钟，取上层清液备用；

5）：采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；

6）：判定：当试剂盒检测结果成立条件时，若结果为阳性，判定该批蛋不符合SPF蛋规定；反之，则符合规定。

所述步骤2）中，每次冻融时间达三小时以上。

所述步骤4）中，离心力为8000-12000g。

本发明步骤2）在-70℃下反复冻融三次以上，不但可避免蛋白胶原等物质对检测的干扰，还可充分游离出抗体。

本发明步骤3）中采用PBS缓冲液溶解抗体，一方面避免环境污染，另一方面尽量多的溶解抗体。

本发明步骤5）中采用ELISA试剂盒可快速和高灵敏度地检测出淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原，使检测方法做到快速准确。

所述EIISA试剂盒为市售产品，购买于上海丽臣生物技术有限公司、美国爱德士（IDEXX）公司、北京索奥生物医药科技有限公司或美国R&D公司。

所述PBS缓冲液为PH7.2的磷酸盐缓冲液。

采用本发明的检测方法对SPF进行快速检测，可在SPF蛋投入使用前尽早发现问题，避免造成损失。

采用本发明的疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，不需到SPF鸡舍采集种鸡血液进行检测SPF蛋的质量，由SPF蛋中的蛋白和蛋黄即可快速检测SPF蛋内不易检测到的五种病毒，方便SPF蛋的应用厂家在应用SPF蛋之前检测SPF蛋的质量，减少SPF蛋应用厂家的生产风险。

具体实施方式

本发明一种疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤： 

1）：在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白按体积比2-3：1混合；

2）：将步骤1）混合的蛋黄和蛋白在-70℃条件下反复冻融三次以上；

3）：将步骤2）冻融后的混合样与PH7.2的PBS缓冲液按1：2-3的体积比混合均匀；

4）：在2-8℃下，将步骤3）混合均匀的混合液离心10-15分钟，取上层清液备用；

5）：采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；

6）：判定：当试剂盒检测结果成立条件时，若结果为阳性，判定该批蛋不符合SPF蛋规定；反之，则符合规定。

实施例1  取济南斯帕法斯家禽有限公司生产的SPF蛋进行检查

疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤： 

1）：在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白按体积比2：1混合；

2）：将步骤1）混合的蛋黄和蛋白在-70℃条件下反复冻融三次；每次冻融时间达三小时；

3）：将步骤2）冻融后的混合样与PH7.2的PBS缓冲液按1：2的体积比混合均匀；

4）：在2-8℃下，将步骤3）混合均匀的混合液在10000g的离心力下离心12分钟，取上层清液备用；

5）：采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；

6）：判定：试剂盒检测结果成立条件，检测结果为阴性，判定该批蛋符合SPF蛋规定。

实施例2  取北京梅里亚维通实验动物技术有限公司生产的SPF蛋进行检查

疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤： 

1）：在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白按体积比3：1混合；

2）：将步骤1）混合的蛋黄和蛋白在-70℃条件下反复冻融4次；每次冻融时间达5小时；

3）：将步骤2）冻融后的混合样与PH7.2的PBS缓冲液按1： 3的体积比混合均匀；

4）：在2-8℃下，将步骤3）混合均匀的混合液在8000g的离心力下离心15分钟，取上层清液备用；

5）：采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；

6）：判定：试剂盒检测结果成立条件，检测结果为阴性，判定该批蛋符合SPF蛋规定。

实施例3  取新兴大华农禽蛋有限公司生产的SPF蛋进行检查

疫苗生产厂家内控SPF蛋质量的快速检测方法，其包括以下步骤： 

1）：在无菌条件下将SPF蛋的蛋黄和蛋白按体积比2：1混合；

2）：将步骤1）混合的蛋黄和蛋白在-70℃条件下反复冻融5次；每次冻融时间达4小时；

3）：将步骤2）冻融后的混合样与PH7.2的PBS缓冲液按1：2的体积比混合均匀；

4）：在2-8℃下，将步骤3）混合均匀的混合液在12000g的离心力下离心10分钟，取上层清液备用；

5）：采用ELISA试剂盒检测步骤4）得到的上层清液中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；

6）：判定：试剂盒检测结果成立条件，检测结果为阴性，判定该批蛋符合SPF蛋规定。