一种SPF蛋外源病毒的检验方法

摘要

本发明公开了一种SPF蛋外源病毒的检验方法，包括鸡胚检查法和细胞检查法，其中，鸡胚检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚，并收集尿囊液测血凝，观察鸡胚是否病变，大小是否正常；细胞检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，接种尿囊液和卵黄，盲传二代，观察接种后细胞的病变情况，收集部分细胞反复冻融做5种病的抗原检测和做红细胞吸附检验。采用本发明的检验方法，不需到SPF鸡舍采集种鸡血液进行检测SPF蛋的质量，只需采用SPF蛋本身就可检测SPF蛋是否存在外源病毒，进而确认SPF蛋的质量，减少进出SPF鸡舍造成的生物安全风险，便于SPF蛋的应用对象进行SPF蛋外源病毒的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及SPF蛋外源病毒的检验方法。

背景技术

SPF蛋（无特定病原体的蛋）作为一种特殊的生物原材料，不论是在病毒学、营养学、病理学研究，还是在生物制品生产、检验中，都是不可缺少的标准实验材料。SPF蛋质量的好坏直接关系到科学研究的成果和生物制品的质量。

目前检验SPF蛋的外源病毒的惯用方法是：先采集种鸡的血液，再分离出血清，检测血清中的抗原抗体，从而进行判断SPF鸡群是否感染外源病毒，进而确定SPF蛋的质量是否合格。

而目前的科研单位、生物制品厂家等SPF蛋应用对象往往因为生物安全问题无法直接接触到种鸡，更无法采集到种鸡的血液，间接造成SPF蛋的质量无法监控。而SPF蛋的生产厂家也不方便频繁进出SPF鸡舍采集种鸡血液，进而检验。故通过血清检验SPF蛋对SPF蛋应用对象（例如疫苗生产单位）不现实，甚至无法实现。

按照国家标准，SPF蛋需检测的19种病源是：鸡白痢沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸡毒支原体、滑液囊支原体、禽流感病毒、新城疫病毒传染性、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、马立克氏病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽腺病毒Ⅲ群、禽腺病毒Ⅰ群、禽痘病毒。以上大部分病毒都能在鸡胚的尿囊液和卵黄里面分离出来。有些病毒甚至能导致细胞病变，或盲传过程中出现病变，有些病毒则会出现胚胎病变。在19中病源中，禽痘病毒是不经过蛋传播的，我们在做蛋的检验时可以不要检验，其他的病毒很多都是可以通过比较简单的办法排除，具体如下表格1。但是淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒这五种病毒不但可以经蛋传播，同时也是疫苗出厂前外源病毒检测的重点和难点，直接影响疫苗的安全性，用ELISA试剂盒检测以上这五种病毒是十分必要的。

表格1：

病原细菌分离血凝性鸡胚明显病变细胞病变禽腺病毒Ⅲ群 √  禽腺病毒Ⅲ群 √  鸡白痢沙门氏菌√   副鸡嗜血杆菌√√  多杀性巴氏杆菌√   鸡毒支原体√   滑液囊支原体√   禽流感病毒 √  新城疫病毒传染性 √  传染性支气管炎病毒 √  传染性喉气管炎病毒  √ 传染性法氏囊病病毒  √ 马立克氏病毒   √

发明内容

本发明的目的是提供一种不需进出SPF鸡舍采集种鸡血液，通过SPF蛋本身即可检验SPF蛋是否含有外源病毒的SPF蛋外源病毒的检验方法。

为实现上述目的，本发明一种SPF蛋外源病毒的检验方法，其包括鸡胚检查法和细胞检查法，其中，

鸡胚检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况，观察鸡胚是否病变；

细胞检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后分别接种10-15日龄尿囊液和卵黄，盲传二代，观察接种后细胞的病变情况，最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；再分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融，离心，取上层清液 用ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原，观察检查结果；

判定：若鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，则表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格；若以上其中一项不合格则判定该批蛋不符合SPF蛋要求。

本发明所述的鸡胚检查法中用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况的具体操作为：所述鸡胚检查法中用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况的具体操作为：在微量反应板上，从第1孔至12孔，每孔加入PBS缓冲液0.025ml，每孔加入9-12日龄鸡胚的尿囊液0.025ml，从第1孔起，采用PBS缓冲液依次对尿囊液稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096，至最后1个孔，弃去0.025ml液体，每孔继续加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，以不加样品的红细胞对照孔，然后在微量反应板振摇器上摇匀，置室温40分钟或置2～8℃60分钟，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

采用以上鸡胚检查法，可观察鸡胚生长发育是否正常，有无病变或病痕，红细胞是否有血凝现象。若鸡胚生长发育正常，无病变或病痕，则表示无至鸡胚生长异常的病毒；若红细胞全部无血凝现象，则表示无至红细胞吸附现象的病毒。 

所述细胞检查法的具体操作为：

A、在36-38℃孵化箱中孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后备用； 

B、然后在无菌条件下收集10-15日龄鸡胚尿囊液，反复冻融3次以上，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，将尿囊液接种到步骤A得到的单层细胞中；

C、无菌条件下收集10-15日龄鸡胚的卵黄，反复冻融3次以上，用生理盐水按卵黄与生理盐水1：3的体积比进行稀释，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，取上层清液接种到步骤A得到的单层细胞中，置37℃吸附60分钟，弃去接种液，用含3%的新生牛血清的MEM培养液继续培养5~7天；

D、盲传二代步骤B和步骤C接种并培养的单层细胞，观察细胞病变情况；

E、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞，用0.2%鸡红细胞悬液和0.2%豚鼠红细胞悬液等量混合后的混合液做红细胞吸附检验；

F、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融3次，2-8℃下以4000-6000g的离心力离心10-15分钟，取上层清液后，ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。

以上细胞检查法中，采用10-15日龄鸡胚尿囊液和卵黄接种鸡胚细胞，盲传两代检验是否有病变，并用盲传二代后的尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验，若无红细胞吸附，表明无至红细胞吸附的病毒。

同时，盲传二代后的尿囊液组细胞和卵黄组细胞还用ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。若试剂盒检测为阴性，则表明细胞中不存在以上五种病毒。

本发明中，所述经鸡胚检查法和细胞检查法结合进行检查SPF蛋外源病毒后，进行验证的方法为：孵化SPF蛋，取1日龄小鸡采血，分离血清，按国家标准检测SPF蛋的19种病原。

本发明通过以上的验证方法可证明采用鸡胚检查法和细胞检查法相结合对SPF蛋外源病毒的检测是否可行。

所述用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况的操作，借鉴《中华人民共和国兽药典》2010版，附录12页上记录的操作。

本发明中，分别取10-15日龄鸡胚尿囊液和卵黄接种鸡胚细胞，一代培养5-7天后，盲传两代，具体操作如下：用分散液（0.25%的胰酶）消化细胞，按1：2-3的原细胞数量比传代细胞数量继续培养；二代培养5-7天，用分散液（0.25%的胰酶）消化细胞，按1：2-3的原细胞数量比传代细胞数量继续培养5-7天。

所述ELISA试剂盒为市售产品，购买于上海丽臣生物技术有限公司、美国爱德士（IDEXX）公司、北京索奥生物医药科技有限公司或美国R&D公司。

所述PBS缓冲液为pH7.2的磷酸盐缓冲液。

所述MEM培养液为市售产品，采购于美国gibco公司。

所述新生牛血清为市售产品，采购于美国gibco公司。

本发明采用以上的方法，应用鸡胚检查法观察SPF蛋孵化的鸡胚的生长发育是否正常，有无病变或病痕；用细胞检查法检测SPF蛋孵化的鸡胚是否有细胞病变，是否存在红细胞吸附现象，用ELISA试剂盒检测SPF蛋孵化的鸡胚是否存在淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原；最后孵出1日龄小鸡，用一日龄小鸡血清验证本发明采用鸡胚检查法和细胞检查法相结合检验SPF蛋是否存在外源病毒的可行性。

总之，采用本发明的检验方法，不需到SPF鸡舍采集种鸡血液进行检测SPF蛋的质量，只需采用SPF蛋本身就可检测SPF蛋是否存在外源病毒，进而确认SPF蛋的质量，该检验方法操作简单，减少进出SPF鸡舍造成的生物安全风险，便于SPF蛋的应用对象（科研单位、生物制品厂家等）进行SPF蛋外源病毒的检测。

具体实施方式

本发明一种SPF蛋外源病毒的检验方法，其包括鸡胚检查法和细胞检查法，其中，

鸡胚检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况，观察鸡胚是否病变；

细胞检查法为：孵化SPF蛋，取9-12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后分别接种10-15日龄尿囊液和卵黄，盲传二代，观察接种后细胞的病变情况，最后一代培养5-7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；再分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融，离心，取上层清液，用ELISA试剂盒测淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原，观察检查结果；

判定：若鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，则表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格；若以上其中一项不合格则判定该批蛋不符合SPF蛋要求。

实施例1    取济南斯帕法斯家禽有限公司生产的SPF蛋

以上SPF蛋外源病毒的检验方法包括鸡胚检查法和细胞检查法：

鸡胚检查法：孵化SPF蛋，取9日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况；

在微量反应板上，从第1孔至12孔，每孔加入PBS缓冲液0.025ml，每孔加入9日龄鸡胚的尿囊液0.025ml，从第1孔起，采用PBS缓冲液依次对尿囊液稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096，至最后1个孔，弃去0.025ml液体，每孔继续加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，以不加样品的红细胞对照孔，然后在微量反应板振摇器上摇匀，置室温40分钟，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

观察鸡胚的生长发育是否正常，有无病变或病痕。检查结果为鸡胚全部生长发育正常，大小无明显差异，无病变或病痕。

细胞检查法：

A、在36-38℃孵化箱中孵化SPF蛋，取9日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后备用； 

B、然后在无菌条件下收集10日龄鸡胚尿囊液，反复冻融3次，2-8℃以4000g的离心力离心15分钟，将尿囊液接种到步骤A得到的单层细胞中；

C、无菌条件下收集10日龄鸡胚的卵黄，反复冻融3次，用生理盐水按卵黄与生理盐水1：3的体积比进行稀释，2-8℃下以4000g的离心力离心15分钟，取上层清液接种到步骤A得到的单层细胞中，置37℃吸附60分钟，弃去接种液，用含3%的新生牛血清的MEM培养液继续培养5~7天；

D、盲传二代步骤B和步骤C接种并培养的单层细胞，观察细胞病变情况；

E、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞，用0.2%鸡红细胞悬液和0.2%豚鼠红细胞悬液等量混合后的混合液分别对尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；

F、步骤D接种的单层细胞最后一代培养5天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融3次，2-8℃下以4000g的离心力离心15分钟，取上层清液，用ELISA试剂盒分别测尿囊液组细胞和卵黄组细胞中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。

判定：鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格。

验证：孵化SPF蛋，取1日龄小鸡采血，分离血清，按国家标准检测SPF蛋的19种病原。

验证结果为阴性，与鸡胚检查法、细胞检查法结合检查的结果一致。

实施例2    取北京梅里亚维通实验动物技术有限公司生产的SPF蛋

以上SPF蛋外源病毒的检验方法包括鸡胚检查法和细胞检查法：

鸡胚检查法：孵化SPF蛋，取12日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况；

在微量反应板上，从第1孔至12孔，每孔加入PBS缓冲液0.025ml，每孔加入12日龄鸡胚的尿囊液0.025ml，从第1孔起，采用PBS缓冲液依次对尿囊液稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096，至最后1个孔，弃去0.025ml液体，每孔继续加入1%鸡红细胞悬液0.025ml（稀释倍数依次为2、4、8、16、32…、4096），以不加样品的红细胞对照孔，然后在微量反应板振摇器上摇匀，置2～8℃下60分钟，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

观察鸡胚的生长发育是否正常，有无病变或病痕。检查结果为鸡胚全部生长发育正常，大小无明显差异，无病变或病痕。

细胞检查法：

A、在36-38℃孵化箱中孵化SPF蛋，取12日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后备用； 

B、然后在无菌条件下收集15日龄鸡胚尿囊液，反复冻融4次， 2-8℃下以6000g的离心力离心10分钟，将尿囊液接种到步骤A得到的单层细胞中；

C、无菌条件下收集15日龄鸡胚的卵黄，反复冻融4次，用生理盐水按卵黄与生理盐水1：3的体积比进行稀释， 2-8℃下以6000g的离心力离心10分钟，取上层清液接种到步骤A得到的单层细胞中，置37℃吸附60分钟，弃去接种液，用含3%的新生牛血清的MEM培养液继续培养5~7天；

D、盲传二代步骤B和步骤C接种并培养的单层细胞，观察细胞病变情况；

E、步骤D接种的单层细胞最后一代培养7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞，用0.2%鸡红细胞悬液和0.2%豚鼠红细胞悬液等量混合后的混合液分别对尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；

F、步骤D接种的单层细胞最后一代培养7天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融3次， 2-8℃下6000g的离心力离心10分钟，取上层清液，用ELISA试剂盒分别测尿囊液组细胞和卵黄组细胞中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。

判定：鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格。

验证：孵化SPF蛋，取1日龄小鸡采血，分离血清，按国家标准检测SPF蛋的19种病原。

验证结果为阴性，与鸡胚检查法、细胞检查法结合检查的结果一致。

实施例3    取新兴大华农禽蛋有限公司生产的SPF蛋

以上SPF蛋外源病毒的检验方法包括鸡胚检查法和细胞检查法：

鸡胚检查法：孵化SPF蛋，取10日龄鸡胚，并收集尿囊液，用1%鸡红细胞悬液测尿囊液的血凝情况；

在微量反应板上，从第1孔至12孔，每孔加入PBS缓冲液0.025ml，每孔加入10日龄鸡胚的尿囊液0.025ml，从第1孔起，采用PBS缓冲液依次对尿囊液稀释，稀释倍数依次为2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096，至最后1个孔，弃去0.025ml液体，每孔继续加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，以不加样品的红细胞对照孔，然后在微量反应板振摇器上摇匀，置室温下40分钟，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

观察鸡胚的生长发育是否正常，有无病变或病痕。检查结果为鸡胚全部生长发育正常，大小无明显差异，无病变或病痕。

细胞检查法：

A、在36-38℃孵化箱中孵化SPF蛋，取10日龄鸡胚细胞进行细胞培养，当细胞培养成单层后备用； 

B、然后在无菌条件下收集12日龄鸡胚尿囊液，反复冻融5次，2-8℃下以5000g的离心力离心13分钟，将尿囊液接种到步骤A得到的单层细胞中；

C、无菌条件下收集12日龄鸡胚的卵黄，反复冻融4次，用生理盐水按卵黄与生理盐水1：3的体积比进行稀释，2-8℃下以5000g的离心力离心13分钟，取上层清液接种到步骤A得到的单层细胞中，置37℃吸附60分钟，弃去接种液，用含3%的新生牛血清的MEM培养液继续培养5~7天；

D、盲传二代步骤B和步骤C接种并培养的单层细胞，观察细胞病变情况；

E、步骤D接种的单层细胞最后一代培养6天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞，用0.2%鸡红细胞悬液和0.2%豚鼠红细胞悬液等量混合的混合液分别对尿囊液组细胞和卵黄组细胞做红细胞吸附检验；

F、步骤D接种的单层细胞最后一代培养6天，分别取细胞培养所得的尿囊液组细胞和卵黄组细胞反复冻融3次，2-8℃下以5000g的离心力离心13分钟，取上层清液用ELISA试剂盒分别测尿囊液组细胞和卵黄组细胞中的淋巴白血病、网状内皮增生症病、鸡传染性贫血病、禽呼肠孤病、禽脑脊髓炎病五种病的抗原。

判定：鸡胚检查法检测鸡胚发育正常，鸡胚大小无明显差异，无病变或病痕，红细胞全部无血凝现象；细胞检查法检测尿囊液组细胞和卵黄组细胞无细胞病变，无红细胞吸附现象，同时ELISA试剂盒检测结果均为阴性，表明被检测的SPF蛋无外源病毒，质量合格。

验证：孵化SPF蛋，取1日龄小鸡采血，分离血清，按国家标准检测SPF蛋的19种病原。

验证结果为阴性，与鸡胚检查法、细胞检查法结合检查的结果一致。