可逆终止引物延伸试剂

摘要

本发明涉及到核酸化学，更具体到一个领域，其中包括被修饰的2′-脱氧核苷酸的三聚磷酸被添加到一个寡核苷酸的3′-端，被添加的核苷酸的3′-羟基含有NH2保护基团，核苷酸的碱基上连有荧光标记基团，连接的链子可以被切断。这种组成成分及其相关的过程可以提高循环可逆终止策略进行寡核苷酸的测序，如美国专利6664079中所述。更具体的说，本发明涉及携带可检测的荧光标记的核糖和2′-脱氧核糖核苷的三聚磷酸，和由其衍生出来的寡核苷酸。本发明还涉及，通过一个DNA聚合酶，RNA聚合酶，逆转录酶，将上述的三聚磷酸加到一个引物进而合成上述的寡核苷酸的过程。

说明书

技术领域

本发明涉及到核酸化学，更具体到用于确定核酸序列的组份和过程的领域。更进一步 地说，本发明涉及相关的成分及其过程，该过程将一个荧光标记的核苷酸加到引物的3′- 端，得到的产物寡核苷酸的3′-羟基被一个临时的基团保护，该基团在后续的过程中可以 被去保护。

背景技术

“合成测序法”作为“使用周期可逆终止的测序”(SuCRT)是一种以模板导向的引物 延伸策略，在延伸过程中，以核苷三磷酸或硫代三磷酸为基本原件，一次加入一个核苷 酸。聚合反应在每个核苷酸加入后被终止。在这个时间，对引物延伸进行检查，以确定哪 类核苷酸被加入，进而推断出模板中相应序列的核苷酸种类。

使聚合反应停止的一种机制是将引物3′-端羟基由一个保护基团临时的保护(或阻 止)。这个保护基团可以防止聚合酶添加额外的核苷酸，直到该保护基团被去除。实践 中，这个策略提供了一个任意长的时间来确定所添加核苷酸的性质。

一种确定所添加核苷酸种类的策略是让每个核苷酸携带一个荧光标记，每一种标记的 荧光颜色均不同于其他的核苷酸类型。在引物延伸后，去除临时保护基团之前，被添加的 核苷酸的种类可以通过读取荧光标记得以确认。完成此操作后，荧光标记和3′-端保护基 团被去除，接下来下一个周期的测序被启动。在此架构中，模板导向的聚合酶反应是通过 使用一种DNA聚合酶，或反向转录酶。

当输出信号为荧光时，这一战略的实施要求如下：

(一)四种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的类似物各携带一种不同颜色的荧光染 料，同时他们的3′-端被临时保护，使引物不能进一步延伸。

(二)四种类似物必须被有效的嵌入到引物，得到完全充分的引物延伸，同时可以避 免其他副反应的发。

(三)四种核苷酸类似物的潜入必须忠实的根据配对规则。如果核苷酸的错配没有被 校对纠正，加之如果聚合酶不能有效延长终端的不匹配，这样的引物延伸将被中断。这将 逐渐减弱信号强度，并可能产生“出相”信号，扰乱了下游的输出结果。

(四)荧光染料和3′-OH的临时保护基团必须能够被高校的去除，以便在下一个核 苷酸可以被高效的嵌入。不完全去保护基团会削弱信号的强度，或产生“出相”信号进而混 淆下游的信号输出。对于单分子测序，未去除的3′-OH保护基团可能会失去一个序列数 据的收集。

(五)增长的DNA链应该经得起清洗，检测和去保护等过程。虽然退火过程是可能 的，然而，能够使DNA引物和模板保持退火状态的条件是更可取的。

在他们最雄心勃勃的形式中，合成测序的架构中将使用相同的核苷修饰方法来保护 DNA的3′-端同时引进荧光标记基团[Wel99]。例如，如果一个荧光标记被附加到3′-位置 是通过酯键，取代了三磷酸核苷3′-OH的氢原子，在引物延伸后要继续加人另一个核苷 酸将不可能(因为没有自由的3′-OH基团)。这样便提供了时间来读取荧光标签的颜 色，以便确定所添加核苷酸的性质。然后，3′-O酰基组可以在温和的条件下(pH＜10)， 被温和的亲核试剂(如羟胺)去除，再生一个自由的3′-羟基基团，为下一个周期的DNA 测序做准备。

实施这个优雅的测序方式的困难是找到合适的聚合酶。任何荧光标记，在电磁波谱有 用区域发出荧光必须大于1纳米。聚合酶的晶体结构表明，脱氧核糖三磷酸3′-端的位置 是接近聚合酶活性部位的氨基酸残基，该部位的空间大小不能容纳三磷酸3′-端的荧光基 团。因此，聚合酶不太可能接受在3′-位置有这么大的标记基团。事实上，聚合酶不能很 好地接受任何有3′-OH基团修饰的三磷酸。例如，接受甚至2′，3′-二脱氧核苷酸类似 物(其中3′-基团比天然核苷小)，往往需要突变的聚合酶。

瞿等人，在美国专利6664079中指出这些问题，他们以多种3′-OH保护基团为基础 勾画了SuCRT的建议。他们建议一个荧光或质量标签可以通过一个可裂解的连接器连到 核苷三磷酸的非3′-OH单元上(图1)。这种连接器可以连接(但不限于)到嘧啶的5位 (T和C)和嘌呤的7位(G和A)。根据专利US6664079，在这个位置上的标签原则上 应该允许，3′-OH被一个足够小的基团临时保护，并且可以被DNA聚合酶接受。在此架 构中，需要多个去保护步骤来去除荧光标签(使系统清洁以便加人下一个荧光标签)和去 除3′-的保护基团，允许进行下一个循环的引物延伸[Mit03][Seo04]。

专利US6664079致力于寻找一个小的化学基团，该基团可能被聚合酶接受，并且可 以在温和的条件下，且不破坏DNA序列的情况下被去除。专利US6664079引用文献报 告3′-O-甲氧基脱氧核苷酸是好几个聚合酶的底物[Axe78]。它指出，去除3′-O甲氧基的 条件过于强烈，以至于被测序的DNA和被使用的引物，在这样的条件下很难完好无损。

一个酯基基团同样被考虑作为一种核苷酸3′-OH的保护基团。专利US6664079丢 弃这个保护基团，因为文献报道，酯基基团在DNA聚合酶的活性部位会被切割[Can95]。 应该指出，这份报告值得怀疑，并且考虑的只有一种聚合酶。然而，酯键很容易受到自发 的水解，尤其是，如果他们是小的酯基基团(如甲酰基团)。

具有亲电性的化学基团如酮基，能否被作为核苷酸3′-OH的临时保护基，也曾经被 专利US6664079考虑过并且被丢弃了。聚合酶具有亲电中心已经被提出可以与蛋白质的 氨基(如氨基基团)反应。其实，这是不可能的(例如，环戊酮没有与蛋白质侧链形成可 检查量的亚胺)。然而，3′-酮2′-脱氧核糖核苷不是稳定的，通过贝塔消除反应被分解， 文献中广泛的报道了核苷酸还原酶的机制。

专利US6664079然后引用了文献报道，没有外切酶活性的Vent DNA聚合酶能够将 3′-O-烯丙基-dATP嵌入到增长的DNA链中[Met94]。美国专利6664079指出，甲氧甲基 MOM保护基和烯丙基有相似的大小，因此，也可能被用于合成测序中保护3′-OH基的 保护基团。这项专利指出，这些保护基团可以使用过渡金属试剂来去除[Ire86][Kam99]， 或通过酸性试剂来去除(适用于MOM基团)。

因此，这些建议定义了US6664079中提出的发明。简单地说，这一发明的实质是在 合成测序方法中的四种核苷酸类似物的三磷酸，每一种三磷酸核苷碱基上均连有一个可以 被去除的特定的荧光标记，并且每个3′-OH基团的氢原子被烯丙基或甲氧甲基MOM基 团取代，合成测序所得的寡核苷酸是通过聚合酶嵌入被的修饰过的核苷酸三磷酸。

不幸的是，US6664079并没有预期到其他各方面在使用循环可逆终止测序法中的 实用工具，并且在前面的技术中不可行。特别是，裂解反应消除了荧光标记可能无法恢复 核苷碱基到其天然的结构，在文献中被称为“伤痕”。这样就引出一个实验方面的问题，3′ -端带有疤痕核苷酸的引物，能否被聚合酶延伸，同时将含有3′-O保护基和荧光标记的 三磷酸类似物嵌入模板导向的聚合反应中。虽然从架构上很容易设想，使用荧光标记和未 标记的三磷酸的混合物，来实施循环可逆终止测序策略，但是，通过筛选和确定聚合酶， 能够将3′-端保护的和荧光标记的核苷酸三磷酸，更有效地嵌入到带有疤痕的引物中，将 更可取。

附图说明

图1、使用3′-ONH2基团作为一个小型，可被去除的3′-端保护基团进行合成测序 的示意图。圆圈和三角形代表不同颜色的荧光组。DNA聚合酶嵌入3′-端保护的荧光标 记的核苷酸。因为3′-端的保护基团，引物延伸被终止。检测荧光颜色(确定何种核苷酸 被添加)，荧光基团被去除，3′-OH的保护基团被去除。重复下一个的循环。

图2、例1.合成TTP-ONH₂

图3、例2.合成dCTP-ONH₂

图4、例3.合成dATP，ONH₂

图5、例4.合成dGTP-ONH₂

图6、例5.连接器组件的合成

图7、例6.胸腺嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3标记的合成(部分1)

图8、例6.胸腺嘧啶类核苷似物与乙炔连接和一个Cy3标记的合成(部分2)

图9、例7.胞嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3.5标记的合成(部分1)

图10、例7.胞嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3.5标记的合成(部分2)

图11、例8.腺嘌呤核苷类似物与乙炔连接和一个Cy5标记的合成(部分1)

图12、例8.腺嘌呤核苷类似物与乙炔连接和一个Cy5标记的合成(部分1)

图13、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分1)

图14、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分2)

图15、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分3)

图16、例10.亚硝酸去除3′-ONH₂基团。

图17、例11.标记的三磷酸的酶法延伸。

图18、例12.使用循环可逆终止循环法测序

图19、例13.标记的3′-ONH₂三磷酸和“伤疤”的酶法延伸

图20、例14.标记的3′-ONH₂三磷酸和“伤疤”的酶法延伸

图21、例13中使用的结构。

图22、例14中使用的结构。

图23、含二硫键连接器的前体的合成路线，如例15中所述。

图24、尿苷衍生物携带含有二硫键连接器的合成路线(16例)。

图25、腺苷衍生物携带含二硫键连接器的合成路线，如例17中所述。

图26、一个含二硫键连接器尿苷衍生物的合成(例18)。

发明内容

这里所引用的美国专利编号为11/373415，建议3′-O-NH₂基团可能是一个有用的可 逆终止基团，可以被用于一个循环的可逆终止(SuCRT)架构测序方法(图示1)。这个 基团被包含在本发明的化合物中。这些核苷三磷酸不但携带3′-O-NH₂基团，同时在其核 苷碱基上附加一个标签，这个标签可以是荧光基团，且通过一个连接器与碱基相连，连接 器中包含一个功能基团，可以被一些试剂裂解。在这种情况下，可以被裂解的功能基团是 1，2-戊二醇，它可以被高碘酸盐裂解，最合适的条件是在近中性pH值的水溶液中。

本专利组成成份的另一个新颖性在于3′-O-NH₂被保护成为肟的衍生物。这种以肟 的形式能够保护3′-O-NH₂氨基基团，以便进行分子的其他部分的转换，包括连接器的 修饰，从而引入荧光标记。在引物-模板、三磷酸与聚合酶共存的体系中，这种肟在引物 延伸前可以被去掉。

在本发明的化合物中，这些荧光基团被连接在嘧啶碱基的5位或7位去氮嘌呤碱基的 7位。此外，为了便于荧光基团从碱基上去除，在本发明的化合物连接器中包含一个邻近 的1，2-戊二醇。这个二醇可以被高碘酸迅速的裂解。

在发展本发明组份的过程中，我们注意到，3′-ONH₂基团可以通过用丙酮或乙醛被 保护为肟(虽然其他的醛类和酮类用于此目的应该有等同的功能)。此外，我们发现，储 存含有3′-肟官能团的某些成分非常方便，使这些官能团有其使用的价值。

一系列的实验表明，THERMINATOR聚合酶(新英格兰生物实验室的注册商标) 可以将本专利中的四种核苷三磷酸的衍生物嵌入到引物的3′-端，这些三磷酸的衍生物分 别携带一个3′-ONH₂基团和一个含有二醇的连接到碱基上的连接器，连接器上并携带一 个荧光基团。此外，实验进一步地表明，THERMINATOR聚合酶也可以将四种三磷酸 的衍生物添加到3′-端含有疤痕核苷酸的引物，这个3′-端含有疤痕核苷酸的引物是前一 步引物延伸后，经过高碘酸裂解含有二醇的连接器(也可以选择用sodium  cyanoborohydride还原)，同时去除3′-ONH₂基团所得的引物。

本发明同时进一步的阐述了一个过程，这个过程涉及将一个引物和模板的复合物与核 苷三磷酸混合在一起，其中一些三磷酸带有一个荧光标记，另外的一些核苷三磷酸没有荧 光标记。这个过程在聚合酶不能有效地延伸带有“伤痕”的引物时，具有一定的优势，也 就是一个引物的3′-核苷酸的碱基含有侧链片段，即一个带有侧链和荧光标记的三磷酸在 被嵌入引物后，荧光基团被去除后所得的新引物。在这个过程中，未标记的3′-可逆保护 的核苷三磷酸被添加到含有伤痕的引物，然而标记的3′-可逆保护的核苷三磷酸被添加到 没有伤痕的引物。这样一来，这个过程可以适用于一些没有优化过的聚合酶，以标记的核 苷三磷酸进行SuCRT测序。

参考文献

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具体实施方式

例1.TTP-ONH₂的合成(图2)

3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-胸苷(1a)的制备依据以下的文献：[De Clercq，E.，Inoue，I.， Kondo，K.(1990)Preparation of 3-O-amino-2′-deoxyribonucleoside derivatives as antiviral  agents for human retrovirus，particularly human immunodeficiency virus.Eur.Pat.Appl.14 pp]，[Kondo，K.，Ogiku，T.，Inoue，I.(1985)Synthesis of 5′(3′)-O-amino nucleosides.Symp. Nucleic Acids Chem.16，93-96]，[Burgess，K.，Gibbs，R.A.，Metzker，M.L.，Raghavachari，R. (1994)Synthesis of an oxyamide linked nucleotide dimer and incorporation into antisense  oligonucleotide sequences.J.Chem.Soc.Chem.Commun.8，915-916]，[Cook，P.D.，Sanghvi， Y.S.(1994)Preparation of antisense heteroatomic oligonucleotide analogs.PCT Int.Appl.90 pp].。从这些文献中引用的程序被特别的纳入本说明中。这种材料(1.15克，3.0毫摩尔) 被溶解于甲胺的水溶液中(4％，22毫升，约24毫摩尔)。在室温(RT)20分钟后，大 部分的甲胺有抽真空被去除，剩余的溶液用丙酮(3毫升)来处理。在室温后3h，挥发 物在真空中被去除。残留物被溶解于水(25毫升)和乙腈(7毫升)的混合物中。不溶解 的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件 (Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔 TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度从25％到50％的洗脱液B历时 7分钟，在接下来的8分钟然洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的 条件下，保留时间(RT)＝14分钟时，得到了3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c，640 毫克，72％)，冷冻干燥后为无色泡沫状。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝1.79(d，J＝0.9Hz，3H)；1.83(s，3H)；1.84(s， 3H)；2.15-2.35(m，2H)；3.55-3.70(m，2H)；3.98-4.05(m，1H)；4.68-4.72(m，1H)；5.15(br.s， 1H)；6.17(dd，J＝5.7，8.7Hz，1H)；7.76(d，J＝0.9Hz，1H)；11.3(br.s，1H).¹³C-NMR(d₆- DMSO，75MHz)：(ppm)＝12.3；15.5；21.5；36.4；61.8；82.1；83.9；84.1；109.6；136.0；150.5； 155.8；163.7.

3′-O-(N-丙酮肟)-胸苷-5′-三磷酸腺苷(1d)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c，300毫克，1.0毫摩尔)的吡啶(4毫升)和 二恶烷(3.4毫升)的溶液中，在室温条件下，加入2-氯-4H-1，3，2- benzodioxaphosphorin-4-one(260毫克，1.4毫摩尔)的二恶烷(2.6毫升)溶液。10分 钟后，加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，10毫升，2毫摩 尔)和三丁基胺(1.2毫升，4.8毫摩尔)的混合物。再过10分钟后，碘(360毫克，1.4 毫摩尔)和水(0.56毫升)的吡啶溶液(28毫升)被加入。20分钟后，该反应亚硫酸钠 的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。溶剂通过真空被去除。残留物被溶 于水(50毫升)中，所得的混合物被过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱法纯化所 得的产物，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相 A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0到25％的B历时16分钟，流速＝ 10毫升/分钟，保留时间(RT)＝13分)，其次是反相高效液相色谱法进一步的纯化 (Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米色谱柱，流动相A＝25毫米 TEAA pH值7，洗脱液B＝50％乙腈和水，梯度为乙腈从0到70％历时20分钟，流量＝5 毫升/分钟，保留时间(RT)＝19分钟，3′-O-(N-丙酮肟)-5-胸苷三磷酸经过冻干后为 无色泡沫状。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝8800Lmol^-1cm^-1)确定为450微摩 尔(45％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.75-1.79(m，9H)；2.18-2.40(m， 2H)；4.00-4.15(m，2H)；4.22-4.27(m，1H)；4.46(s，2H)；4.78-4.85(m，1H)；6.21(dd，J＝5.7， 9.1Hz，1H)；7.67(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.5 (d，J＝20.0Hz，1P)；-11.7(d，J＝20.0Hz，1P)；-23.3(t，J＝20.0Hz，1P).

3′-O-氨基-胸苷5′-三磷酸腺苷(1e)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-5-胸苷三磷酸(1d，100微摩尔)的水溶液中(10毫升)加 入醋酸钠缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(50WT％， 100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2小时后，反应体系被水(20毫升)稀释后过 滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac  PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯 度从0到30％的B历时20分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝15分)，3′-O- 氨基-胸苷5′-三磷酸腺苷在冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光 系数＝8800Lmol^-1cm^-1)确定为82微摩尔(82％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(d，J＝0.9Hz，3H)；2.18- 2.29(m，¹H)；2.37-2.46(m，1H)；4.01-4.16(m，2H)；4.25-4.29(m，1H)；4.61-4.63(m，1H)；6.17 (dd，J＝5.8，9.0Hz，1H)；7.62(d，J＝1.2Hz，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to  external H₃PO₄＝0)＝-10.8(d，J＝20Hz，1P)；-11.7(d，J＝20Hz，1P)；-23.1(t，J＝20Hz，1P).

例2.dCTP-ONH2的合成(图3)

5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2b)。

在N⁴-苯甲酰-5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2a，8.9克，14毫摩尔)，苯甲 酸(2.5克，20毫摩尔)和三苯基膦(5.2克，20毫摩尔)的四氢呋喃(150毫升)溶液 中，在0℃下加入DIAD(3.7毫升，20毫摩尔)。反应体系的温度过夜后升到室温，然 后，用水(0.5毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化 硅，淋洗液为乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1，最后为100％的乙酸乙酯)分离纯化，得到了N⁴-苯甲酰-3′-O-苯甲酰-5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(13.7克)为无色的泡沫，根 据核磁共振，含有大量的三苯基膦氧化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间 体被重新溶解在甲醇(450毫升)中，同时用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，4毫升，21 毫摩尔)来处理。室温2小时后，反应被冰醋酸(1.25毫升)淬灭。反应溶剂用真空油泵 被去除，并用二氯甲烷(300毫升)和氯化钠的水溶液(50％的盐浓度，150毫升)来萃 取所得的残留物。有机相被分离同时被真空油泵浓缩。反应产物经过快速柱层析(二氧化 硅，淋洗液为甲醇∶二氯甲烷＝5∶95到10∶90)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl- xylo-2′-脱氧胞苷(4.6克；62％的总产率)为无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝1.78-1.87(m，1H)；2.46-2.55(m，1H)；3.19- 3.24(m，1H)；3.37-3.43(m，1H)；3.76(s，6H)；4.07-4.12(m，1H)；4.16-4.19(m，1H)；5.10-5.20 (m，1H)；5.66(d，J＝7.4Hz，1H)；6.07(dd，J＝1.7，7.9Hz，1H)；6.86-6.92(m，4H)；7.16(br s， 2H)；7.18-7.48(m，9H)；7.68(d，J＝7.4Hz，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)：(ppm)＝ 41.4；55.0；62.8；69.2；83.4；85.4；85.5；93.0；113.1；126.6；127.8；129.8；135.6；135.7；141.6； 145.0；155.2；158.0；165.6.

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(2c)。

在5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2b，3.4克，6.4毫摩尔)，N-羟基邻苯 二甲酰亚胺(1.6克，10毫摩尔)和三苯基膦(2.6克，10毫摩尔)的四氢呋喃(180毫 升)溶液中在0℃下加入DIAD(1.9毫升，10毫摩尔)。反应体系的温度过夜后升到室 温，然后，用水(0.5毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二 氧化硅，淋洗液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为90∶10)分离纯化，得到了5′-O- dimethoxytrityl-3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(3.7克)为无色的泡沫。根据核磁共 振，含有大量的三苯基膦氧化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被重新 溶解在甲醇(150毫升)中，同时用浓盐酸的水溶液(7.5毫升)来处理。在室温下几分 钟内，该产品开始沉淀。10分钟后，所得的固体被过滤，并在高真空下干燥，最后得到 3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(1.5克，63％的总产率)为白色粉末。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝2.28-2.38(m，1H)；2.65-2.74(m，1H)；3.62- 3.68(m，2H)；4.35-4.40(m，1H)；4.95-5.00(m，1H)；6.20(d，J＝7.9Hz，1H)；6.25(dd，J＝6.9， 7.0Hz，1H)；7.89(s，4H)；8.22(d，J＝7.9Hz，1H)；8.71(s，1H)；9.83(s，1H).¹³C-NMR(d₆- DMSO，75MHz)：(ppm)＝36.6；61.0；84.1；85.8；87.7；94.0；123.3；128.6；134.8；144.2；146.9； 159.5；163.6.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2e)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺2′-脱氧胞苷(2c，375毫克，1.0毫摩尔)被溶解于甲胺的水 溶液中(4％，11毫升，约12毫摩尔)。10分钟后，大部分的甲胺被真空条件下去除， 其余的溶液用丙酮(2毫升)来处理。室温后3h，溶剂在真空条件下被除去，所得的残 留物被溶解于水(30毫升)中。不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2 微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19× 300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱 液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从0％到50％历时10分钟，在接下来的8分钟洗 脱液B升到85％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝17 分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2c，200毫克，71％，)为 无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝1.83(s，3H)；1.84(s，3H)；1.99-2.09(m，1H)； 2.30-2.39(m，1H)；3.55-3.66(m，2H)；4.02-4.06(m，1H)；4.65-4.70(m，1H)；5.30(br.s，1H)； 5.77(d，J＝7.4Hz，1H)；6.17(dd，J＝5.6，8.7Hz，1H)；7.23(br.s，2H)；7.84(d，J＝7.4Hz，1H). ¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)：(ppm)＝15.5；21.5；37.3；61.9；82.4；84.2；85.2；94.3；141.0； 155.1；155.7；165.6.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2e)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2e，170毫克，0.6毫摩尔)的吡啶(2毫升) 和二恶烷(1.5毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2- benzodioxaphosphorin-4-one(150毫克，0.8毫摩尔)的二恶烷(1.5毫升)溶液。15分钟 后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，6毫升，1.2毫摩 尔)和三丁基胺(0.7毫升，2.8毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(210毫克， 0.8毫摩尔)，吡啶(16毫升)和水(0.32毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水 溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物 溶解在30毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱 条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗 脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/ 分钟，保留时间(RT)＝14分)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep  Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH 值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱 液B从0％到70％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时 间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸，冻干后 为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝7300Lmol^-1cm^-1)确定为 225微摩尔(38％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.77(s，3H)；1.79(s，3H)；2.12- 2.22(m，1H)；2.40-2.50(m，1H)；4.00-4.16(m，2H)；4.28-4.33(m，1H)；4.76-4.80(m，1H)；6.09 (d，J＝7.7Hz，1H)；6.18(dd，J＝5.7，8.4Hz，1H)；7.23(br.s，2H)；7.96(d，J＝7.7Hz，1H).³¹P- NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H3PO4＝0)＝-10.9(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d， J＝19.5Hz，1P)；-23.3(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧胞苷5′-三磷酸(2f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2e，100微摩尔)的水溶液中(10 毫升)加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液 (重量体积比为50％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系 被水稀释(20毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件： (DionexBioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B ＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20 分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝16分钟)。冷冻干燥后产物2f为无色泡 沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝7300Lmol^-1cm^-1)确定为74％。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.09-2.16(m，1H)；2.40-2.50(m， 1H)；4.00-4.10(m，2H)；4.25-4.30(m，1H)；4.40-4.45(m，1H)；6.02(d，J＝6.5Hz，1H)；6.14(dd， J＝6.0，7.9Hz，1H)；7.85(d，J＝6.5Hz，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external  H₃PO₄＝0)＝-10.2(br，1P)；-11.3(br，1P)；-22.9(br，1P).

例3.dATP-ONH₂的合成(图4)

5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3b)。

在5′-O-dimethoxytrity-2′-脱氧腺苷(3a，8.3克，15毫摩尔)，苯甲酸(3.0克，24 毫摩尔)和三苯基膦(6.5克，24毫摩尔)的四氢呋喃(250毫升)溶液中，室温条件下 加入DIAD(4.5毫升，24毫摩尔)。1小时后，加入甲醇(5毫升)来淬火反应。反应 溶剂通过抽真空被去除。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有3％至 5％的甲醇)得到3′-O-苯甲酰-5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(12克)为一种无 色的泡沫。核磁共振显示，产品中包含一些三苯基膦氧化物以及一些消除产物(2′，3′-烯 烃)。这些中间体被溶解在甲醇(300毫升)中，并用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，4毫 升，21毫摩尔)处理。16小时后，在室温下，反应体系中加入醋酸(1.5毫升)。抽真空 来去除溶液体系中的溶剂。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有3％ 到10％的甲醇)得到5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3.7克；45％的总产率)为 无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝2.26-2.34(m，1H)；2.74-2.84(m，1H)；3.18- 3.25(m，1H)；3.34-3.42(m，1H)；3.70-3.74(2s，6H)；4.17-4.22(m，1H)；4.31-4.36(m，1H)；5.95 (d，J＝5.7Hz，1H)；6.35(dd，J＝1.0，7.8Hz，1H)；6.77-6.86(m，4H)；7.16-7.44(m，11H)；8.16 (s，1H)；8.27(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)：(ppm)＝40.6；55.0；55.0；63.1；69.6； 82.9；83.6；85.5；113.1；119.0；126.6；127.7；127.7；129.7；135.6；135.8；139.8；145.0；148.6； 152.3；156.1；158.0；158.0.

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧腺苷(3c)。

在5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3b，3.4克，6毫摩尔)，N-羟基邻苯二 甲酰亚胺(1.6克，10毫摩尔)和三苯基膦(2.6克，10毫摩尔)的四氢呋喃(120毫 升)溶液中，在室温下加入DIAD(1.9毫升，10毫摩尔)。反应1小时后，用甲醇(3 毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为二氯 甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为95∶5)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl-3′-O-邻苯二 甲酰亚胺-2′-脱氧腺苷(6.2克)为无色的泡沫。根据核磁共振，含有大量的三苯基膦氧 化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被重新溶解在甲醇(30毫升) 中，同时用浓盐酸的甲醇溶液(1.25摩尔，55毫升，约70毫摩尔)来处理。在室温下几 分钟内，该产品开始沉淀。10分钟后，所得的固体被过滤，并在高真空下干燥，最后得 到3c(1.5克，63％的总产率)为白色粉末。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝2.62-3.02(m，2H)；3.60-3.66(m，2H)；4.37- 4.41(m，1H)；5.13-5.18(m，1H)；6.59(dd，J＝6.2，7.2Hz，1H)；7.91(s，4H)；8.58(s，1H)；8.78 (s，1H)；8.97(br s，1H)；9.60(br s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)：(ppm)＝36.1；61.2； 83.8；84.1；88.0；118.5；123.4；128.7；134.9；142.0；145.2；148.1；150.4；163.8.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(3e)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺2′-脱氧腺苷(3c，790毫克，2.0毫摩尔)被溶解于甲胺的水 溶液中(4％，22毫升，约24毫摩尔)。20分钟后，大部分的甲胺被抽真空去除，其余 的溶液用丙酮(3毫升)来处理。室温后3h，溶剂在抽真空条件下被除去，所得的残留 物被溶解于水(35毫升)和己腈(15毫升)中。不溶解的固体在反相高效液相色谱之前 被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18  column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱 液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从25％到50％历时7分钟，在 接下来的8分钟洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保 留时间(RT)＝14分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(465毫 克，76％，)为无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝1.86(s，3H)；1.87(s，3H)；2.47-2.55(m，1H)； 2.82-2.93(m，1H)；3.54-3.72(m，2H)；4.11-4.16(m，1H)；4.81-4.85(m，1H)；5.43(dd，J＝4.7， 7.0Hz，1H)；6.33(dd，J＝5.9，8.9Hz，1H)；7.34(br.s，2H)；8.13(s，1H)；8.35(s，1H).¹³C-NMR (d₆-DMSO，75MHz)：(ppm)＝15.5；21.5；36.4；62.2；82.5；84.4；84.9；119.3；139.6；148.8； 152.3；155.9；156.2.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(3e，180毫克，0.6毫摩尔)的吡啶(2毫升) 溶液，二恶烷(1.5毫升)和DMF(1毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1- 1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(150毫克，0.8毫摩尔)的二恶烷(1.5毫升)溶液。 15分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，6毫升，1.2 毫摩尔)和三丁基胺(0.7毫升，2.8毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(210毫 克，0.8毫摩尔)，吡啶(16毫升)和水(0.32毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠 的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残 留物溶解在40毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化， 色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝ 水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝ 10毫升/分钟，保留时间(RT)＝13分)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化 (Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔 TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A 中增加洗脱液B从0％到100％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件 下，保留时间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷 酸，冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝15400Lmol^-1cm^-1)确定为240微摩尔(40％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(s，3H)；1.83(s，3H)；2.55- 2.78(m，2H)；3.97-4.13(m，2H)；4.32-4.37(m，1H)；4.90-4.95(m，1H)；6.33(dd，J＝5.8，9.0Hz， 1H)；8.03(s，1H)；8.37(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝ -10.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-23.2(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧腺苷-5′三磷酸(3f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸(100微摩尔)的水溶液中(10毫 升)加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(重 量体积比为50％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系被水 稀释(20毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件： (Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B ＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20 分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝15分钟)。冷冻干燥后产物3f为无色泡 沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝15400Lmol^-1cm^-1)确定为65微摩尔(65 ％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.36-2.43(m，1H)；2.57-2.63(m， 1H)；3.93-4.10(m，2H)；4.29-4.34(m，1H)；4.50-4.54(m，1H)；6.28(dd，J＝7.0，8.0Hz，1H)； 8.04(s，1H)；8.33(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-8.8 (d，J＝19.5Hz，1P)；-11.2(d，J＝19.5Hz，1P)；-22.6(t，J＝19.5Hz，1P).

例4.dGTP-ONH2的合成(图5)

5′-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(4b)。

5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-2′-脱氧鸟苷(4a，9.4克，15毫摩 尔)，苯甲酸(3.0克，24毫摩尔)和三苯基膦(6.5克，24毫摩尔)的四氢呋喃(250 毫升)溶液中，室温条件下加入DIAD(4.5毫升，24毫摩尔)。0.5小时后，加入甲醇 (2毫升)来淬火反应。反应溶剂通过抽真空被去除。所得的中间体被溶解在甲醇(600 毫升)中，并用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，7.6毫升，40毫摩尔)处理。16小时后， 在室温下，反应体系中加入醋酸(2.3毫升，40毫摩尔)。抽真空来去除溶液体系中的溶 剂。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有0％到10％的甲醇)得到5′ -O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(5.6克；50％的总产 率)为无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝2.18-2.26(m，1H)；2.69-2.80(m，1H)；3.03(s， 3H)；3.11(s，3H)；3.19-3.25(m，1H)；3.34-3.40(m，1H)；3.70-3.74(2s，6H)；4.16-4.20(m，1H)； 4.32-4.37(m，1H)；5.57-5.61(m，1H)；6.29(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)；6.80-6.86(m，4H)；7.16- 7.44(m，9H)；8.00(s，1H)；8.54(s，1H)；11.38(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)：(ppm) ＝34.6；40.6；40.9；55.0；55.0；63.2；69.4；82.0；83.5；85.5；113.1；119.4；126.6；127.7；129.7； 129.8；135.6；135.7；137.3；145.0；149.4；157.3；157.7；157.9；158.0；158.0.

5′-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰-2′-脱氧鸟苷(4c)

在5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(4.7克，7.5毫 摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2.1克，13毫摩尔)和三苯基膦(3.4克，13毫摩尔) 的四氢呋喃(150毫升)溶液中，在室温下加入DIAD(2.5毫升，13毫摩尔)。反应1 小时后，用甲醇(3毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧 化硅，淋洗液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为90∶105)分离纯化，得到了5′-O- dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧鸟苷(5.3 克)为无色的泡沫。根据核磁共振，含有约0.25当量的消除产物(2′，3′-烯烃)。部分 的反应产物经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19 ×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱 液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从50％到90％历时18分钟，在接下来，洗脱 液B升到90％并保持6分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间 (RT)＝22分钟)。冻干后最终得到一种无色的泡沫。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：(ppm)＝2.64-2.74(m，1H)；2.84-2.94(m，1H)；3.09(s，3H)； 3.16(s，3H)；3.31-3.45(m，2H)；3.75(s，6H)；4.56-4.61(m，1H)；5.12-5.16(m，1H)；6.53(dd，J＝ 5.5，8.6Hz，1H)；6.72-6.78(m，4H)；7.12-7.36(m，10H)；7.72-7.85(m，5H)；8.67(s，1H)；10.11 (s，1H).¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)：(ppm)＝35.3；41.5；55.3；63.6；82.6；83.6；86.7；88.7； 113.3；120.4；123.9；127.0；128.0；128.1；128.7；130.0；130.1；135.0；135.5；135.9；144.4；150.4； 157.1；158.5；158.6；158.6；164.0.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(4e)。

在5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰-2′-脱氧 鸟苷(4C，900毫克，约1毫摩尔邻苯二甲酰化合物，包含约0.25当量的2′，3′--烯烃)的 甲醇(7毫升)溶液中加入浓盐酸(0.4mL，约5毫摩尔)和TFA(0.1毫升，约1.5毫摩 尔)。混合物在室温下搅拌5分钟后得到均相的溶液。反应体系中加入浓氨水(30％，5 毫升，约80毫摩尔)后所产生的悬浮液被搅拌1小时。接下来在加入甲胺的水溶液(10 ％，13毫升，约36毫摩尔)20分钟后，大部分的甲胺被抽真空去除，其余的溶液用盐酸 中和，同时加入丙酮(3毫升)和己腈(5毫升)来处理。室温后3h，反应混合物中加入 水(20毫升)和己腈(20毫升)，不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化 (0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈， 洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从25％到50％历时5分钟，在接下来的12 分钟洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间 (RT)＝13分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(120毫克，37 ％，)为无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝1.84(s，3H)；1.85(s，3H)；2.41-2.50(m，1H)； 2.62-2.72(m，1H)；3.52-3.64(m，2H)；4.02-4.08(m，1H)；4.74-4.78(m，1H)；5.05-5.12(m，1H)； 6.09(dd，J＝5.7，8.9Hz，1H)；6.51(br.s，2H)；7.95(s，1H)；10.60(br.s，1H).

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(100毫克，0.3毫摩尔)的吡啶(1毫升)溶 液，二恶烷(0.8毫升)和DMF(1毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2- benzodioxaphosphorin-4-one(75毫克，0.4毫摩尔)的二恶烷(0.75毫升)溶液。15分钟 后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，3毫升，0.6毫摩 尔)和三丁基胺(0.35毫升，1.4毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(100毫克， 0.4毫摩尔)，吡啶(8毫升)和水(0.16毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水溶 液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶 解在30毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条 件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱 液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/分 钟，保留时间(RT)＝16分钟)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep  Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH 值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱 液B从0％到100％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时 间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸，冻干后 为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝11700Lmol^-1cm^-1)确定为 135微摩尔(45％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(s，3H)；1.81(s，3H)；2.45- 2.55(m，1H)；2.65-2.80(m，1H)；4.00-4.13(m，2H)；4.27-4.32(m，1H)；4.87-4.92(m，1H)；6.14 (dd，J＝5.8，9.0Hz，1H)；7.98(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-9.7(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-23.1(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(4f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(50微摩尔)的水溶液中(5毫升) 加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，1毫升，1毫摩尔)和羟胺的水溶液(重量体 积比为50％，50微升，约0.8毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系被水稀释

(10毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex  BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的 NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20分钟，流 速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝18分钟)。冷冻干燥后产物4f为无色泡沫。产率经 由紫外线(260纳米，吸光系数＝11700Lmol^-1cm^-1)确定为36微摩尔(72％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.50-2.75(m，2H)；3.97-4.13(m， 2H)；4.29-4.34(m，1H)；4.55-4.60(m，1H)；6.08-6.16(m，1H)；8.00(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120 MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.6(br，1P)；-11.2(br，1P)；-23.0(br，1P).

例5.连接器组件的合成(图6)

(R，R)-Diacetyltartaric acid酸酐(5b)。在醋酸酐(12毫升)和细粉状酒石酸 (5a，5.48克，36.6毫摩尔)的混合物中，室温条件下，在搅拌时加入浓硫酸(0.2毫 升)。在释放出的热量停止后，该反应混合物被加热回流10分钟，然后逐渐冷却至0 ℃。所得的结晶产物被收集、过滤，并用甲苯洗涤。接下来，在0℃，这种粗产品在16 毫升的乙醚中搅拌10分钟，过滤，并用乙醚洗涤，干燥后得到5.82克(74％)的酸酐 (5b)。

(R，R))-N-Propragyl amine diacetyltartaric acid monoamide(5c).

在(R，R)diacetyltartaric acid酸酐(8.0克，34毫摩尔)的二氯甲烷(60毫升)溶液 中，在氩气保护和0℃条件下，加入propragyl amine(2.3毫升，37毫摩尔)。在此条件 下，反应混合物被搅拌过夜后，减压去除溶剂。所得固体被过滤，并用乙醚洗涤四次(每 次50毫升)。高真空干燥后得到固体5c(8.0克)。

(R，R)-N-(Propragyl amine)-N′-N′-叔丁氧羰基乙二胺diacetyltartramide(5d).

二-N-琥珀酰亚胺草酸(1.7克，6毫摩尔)，monoamide 5c(2.3克，6.11毫摩 尔)，乙腈(0.5毫升，6.11毫摩尔)和吡啶(100mL)的混合物，室温下在氩气的保护 下，搅拌12小时。最终得到几乎是清亮的溶液，在0℃加入N-叔丁氧羰基乙二胺(961毫 克，6.0毫摩尔)和三乙胺(0.8毫升，6.0mmol)的乙腈(15mL)的混合液。在0℃下 该混合被搅拌1.5小时，然后加入乙酸乙酯(350毫升)和水(50毫升)。分离萃取，有机 相用无水硫酸钠干燥。减压抽真空去除溶剂，所得的残留物经过制备硅胶柱(30克硅胶， 洗脱液为CH₂Cl₂-MeOH(100∶7 v/v))纯化，得到淡黄色固体5d(2.0克)。

¹H NMR(CdCl₃∶Me₂SO-d₆，20∶1)：7.6(1H，br s，NH)，7.4(1H，br s，NH)，5.6(1H，s，NH)， 5.544(1H，d，J＝3.8Hz，CH)，5.58(1H，d，J＝3.8Hz，CH)，3.79-4.1(2H，m，CH₂)，3.1-3.3(4H，m， CH₂)，2.1(1H，m，CH)，2.05(3H，s，CH₃)，2.07(3H，s，CH₃)，1.38(9H，s，CH₃)

例6.胸苷类似物与乙炔连接器和一个Cy3荧光标记(图7和8)

5′-Dimethoxytrityl-xylo-5-iodouridine(6c)

2′-deoxy-5-iodouridine(6a，5克；14.125毫摩尔)，三乙胺(2.35毫升；16.95毫摩尔) 和N，N-二甲氨基吡啶(517毫克，4.23毫摩尔)的吡啶溶液(40毫升)被冷却到0℃。 4，4′-dimethoxytrityl chloride(5.75克；16.95毫摩尔)的吡啶(40毫升)溶液被快速地加 入，由此产生的混合物，经过一夜缓慢的升高到室温。接下来，反应体系被再次冷却至 0℃，并加入三乙胺(6毫升；42毫摩尔)和甲基磺酰氯(2毫升；21毫摩尔)。得到的红色 混合溶液的温度被升至室温。2小时后，悬浮液被过滤，得到的固体，用乙酸乙酯(100 毫升)洗涤。滤液被合并，真空条件下浓缩后，得到6b为棕色泡沫。粗产品6b被重新 溶解于乙醇(140毫升)和氢氧化钠水溶液(1M，70毫升；70毫摩尔)中。混合物被加 热回流90分钟后，加入盐酸水溶液(1摩尔，40毫升，40毫摩尔)。乙醇在抽真空条件下 被去除后，所剩余的残留物在二氯甲烷(100毫升)和盐水(20毫升)之间萃取。有机相 用无水硫酸钠干燥。减压抽真空去除溶剂，所得的残留物经过制备硅胶柱(洗脱液为 CH₂Cl₂中含有MeOH 0-5％)纯化，得到无色粉末(9克，99％)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：(ppm)＝1.42(s，1H)；2.12-2.18(m，1H)；2.50-2.61(m，1H)； 3.45-3.66(m，2H)；3.79(s，6H)；4.02-4.07(m，1H)；4.43-4.47(m，1H)；6.15(dd，J＝8.0，1.8Hz， 1H)；6.84-6.88(m，4H)；7.20-7.46(m，9H)；8.25(s，1H).

3′-O-Phthalimidoyl-5-iodouridine(6e)

在化合物6c(9.5克；14.47毫摩尔)，三苯基膦(4.2克，16毫摩尔)和N-羟基邻苯二 甲酰亚胺(2.6克；16mmol)的四氢呋喃(100毫升)溶液中，在0℃下，加入N，N′-二异 丙基偶氮二(3.5毫升；18毫摩尔)。由此产生的橙色混合液经过一夜被为澄清同时温度升 到室温。该混合物被水(0.6毫升)处理，溶剂在真空条件下被去除。经过快速柱层析 (硅胶；洗脱液的梯度为50％乙酸乙酯和正己烷，最后为纯乙酸乙酯)，大部分的副产品 被拆除，得到混合物(10克)其中大部分是6d(乙酸乙酯∶HEX＝2∶1；Rf＝0.37)，其 余的是三苯基氧化膦。将上述的混合物悬浮在甲醇(750毫升)中，并用盐酸的水溶液 (37.5毫升；约450毫摩尔)处理。得到清亮的溶液被冷却至-20℃，过夜后，得到6e为 略带橙色的沉淀(1.83克；25％)。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)：(ppm)＝2.29-2.39(m，1H)；2.56-2.60(m，1H)；3.64- 3.67(m，2H)；4.28-4.32(m，1H)；4.90-5.00(m，1H)；5.29(t，J＝4.9Hz，1H)；6.30(dd，J＝8.3， 5.8Hz，1H)；7.88(s，4H)；8.39(s，1H)；11.72(s，1H).

1-(5′-O-tert-Butyldiphenylsilyl-3′-O-phthalimidoyl-2′-deoxy-5-iodouracil(6f)

化合物6e(1.8克，3.66毫摩尔)在100mL圆底烧瓶中，与25毫升的甲苯在旋转蒸 发仪上蒸发两次。然后加入无水DMF(25毫升)和咪唑(1.45克，21毫摩尔)。该混合 物被搅拌，直到所有的咪唑被溶解。在氮气的保护下，加入Tert-butyldiphenylsilyl chloride(2.2毫升，4.39毫摩尔)。然后将混合物在室温下搅拌过夜，用二氯甲烷稀释 (100毫升)，并用水萃取三次(每50毫升)，饱和氯化钠水溶液(50毫升)洗涤一 次。有机相用无水硫酸钠干燥，真空过滤，旋转蒸发浓缩。由此产生的残余物经硅胶柱层 析分离纯化，洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，得到6f为白色固体(2.1克，81％)。

3′-O-Amino-1-(5′-O-tert-butyldiphenylsilyl-2′-deoxy-5-iodouracil(6g)

在搅拌的状态下，-5℃至-10℃时，冷甲基肼(0.77毫升，14.9毫摩尔)被添加到 6f(5.5克，7.45毫摩尔)的无水二氯甲烷溶液中。10分钟后，形成了白色的1，2- dihydro-4-hydroxy-2-methyl-1-oxophthalizine沉淀。悬浮液在室温下搅拌1小时，沉淀被过 滤，并用二氯甲烷(2×50毫升)洗涤。合并的滤液经过旋转蒸发后被浓缩，经硅胶柱 层析分离纯化，洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，得到6g(4.4克，97％)。

3′-O-Aminodimethoxytrityl-1-(5′-O-tert-butyldiphenylsilyl-2′-deoxy-5-iodouracil(6h)

化合物6g(6.4克，7.57毫摩尔)和吡啶(10毫升)的混合物，在旋转蒸发器上共沸 除水两次。残留物溶解在无水二氯甲烷(25毫升)中。然后添加二异丙基乙基胺(3.1毫 升，18毫摩尔)和monomethoxytrityl氯(4.7克，15.14毫摩尔)。反应的进展由薄层色谱 法监测(正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)。反应完成后，将混合物用二氯甲烷(100毫升)稀 释，有机相用饱和碳酸氢钠(50毫升)和水(50毫升)洗涤，然后用硫酸钠干燥。在真空 状态下由旋转蒸仪除去溶剂，由此产生的残余物经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为正己 烷∶乙酸乙酯＝2∶1-1∶1，得到6h(7克，98％)。

3′-O-Aminodimethoxytrityl-2′-deoxy-5-iodouracil(6i)

在化合物6h(7克，7.5毫摩尔)的四氢呋喃(20毫升)溶液中，加入TBAF的四氢呋 喃(1摩尔，20毫升)溶液。反应混合物搅拌2小时后，薄层色谱显示反应已经完成。反应 混合物被浓缩后，在用二氯甲烷(100毫升)稀释，并用水(50毫升)和饱和盐水(50毫 升)萃取。水相再用二氯甲烷(100毫升)反提取，合并有机层，用硫酸钠干燥有机相， 浓缩后，残留物经柱层析分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1-1∶1)给出6i(5g，95％)。

¹H NMR(Me₂SO-d₆)：11.71(1H，br s)，8.4(1H，s)，8.1(1H，s)，7.1-7.4(10H，m)，6.7- 6.8(4H，m)，6.1(dd，8.5，5.8Hz，1H)，5.1(1H，br s)，4.0-4.2(1H，m)，3.8-4.0(1H，m)，3.5-3.7 (2H，m)，2.33-2.4(1H，m)，2.07-2.1(1H，m)

Monomethoxytrityl-protected uridine derivative with an acetylene diol linker(6j)

在化合物6i(1克，1.55mmol)的DMF(25毫升)溶液中，加入CuI(59毫克，0.31 毫摩尔)。所得的混合物经过氩气脱氧气后，先后加入三乙胺(0.43毫升，3.1毫摩尔)， Boc linker(1.3克，3.1毫摩尔)和Pd(PPh₃)₄(179.18毫克，0.155毫摩尔)。所得的黄色溶 液在室温下搅拌3.0小时。薄层色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)显示反应结束后，反应被 5％的EDTA(25毫升)淬灭，并用乙酸乙酯萃取。有机层用硫酸钠干燥，浓缩，干燥。 残留物由硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝100∶8)分离纯化得到6j(0.7g，50％).

¹H NMR(Me₂SO-d₆)：11.6(1H，s)，8.7(1H，m)，8.1-8.2(2H，m，s)，7.2-7.4(10H，m)， 7.1(2H，d，8Hz)，6.8(2H，d，6Hz)，6.1(dd，8.6，5.7Hz，1H)，5.4-5.5(2H，m)，5.0(1H，m)，4.0-4.2 (2H，m)，3.8-4.0(4H，m)，3.75(3H，s)，2.8-3.2(4H，m)，2.2-2.3(1H，m)，2.07(3H，s)，2.1(3H，s)， 1.3(9H，s).

dUTP-ONH2携带乙炔二醇连接器的三磷酸(6k)

在5′-OH核苷衍生6j(3′-O-NH-MMTr，linker-di-OAc/NH-Boc)(930毫克，1.0 mmol)的吡啶(4毫升)和二恶烷(3.4毫升)溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1- 1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(260毫克，1.4毫摩尔)的二恶烷(2.6毫升)溶液。 20分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，14毫升，2.8 毫摩尔)和三丁基胺(1.6毫升，6.4毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(360毫 克，1.4毫摩尔)，吡啶(28毫升)和水(0.56毫升)。30分钟后，该反应被亚硫酸钠 的水溶液(5％，0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在50毫升 的水和己氰(40毫升)中，并用0.2微米的滤纸过滤。反应产物经过反相高效液相色谱 法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column，19×300毫米制备柱，洗脱液A＝ 水，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从18％到50％历时 25分钟，在接下来的5分钟内洗脱液B升到60％，然后在2分钟内洗脱液B升到90％， 并保持8分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝25到 35分钟)。冻干后最终得到完全保护的三磷酸腺苷6k为一种无色的泡沫(由于部分化合 物失去了二醇醋酸乙烯酯而成为混合物)。

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸携带乙炔二醇和伯胺的连接器(6l)。

中间体6k用浓氨水(50毫升)在室温下处理4h后，冷冻干燥以上的混合物。所得 的残留物被溶解在甲醇(0.5毫升)和TFA(9毫升)中，2分钟后成为清亮的溶液。上述 溶液中加入乙醚(75毫升)，得到悬浮液在-20℃保存1小时。通过离心分离沉淀，上 清液被倒掉。所得的沉淀被仔细地溶解在碳酸氢铵缓冲液(200毫摩尔，45毫升)和丙酮 (2毫升)中。溶液的pH值用稀盐酸调整到6，然后在室温下放置2小时。在抽真空的 条件下溶剂被去除。所得的残留物溶解于水(45毫升)，混合物被过滤(0.2微米)。离 子交换高效液相色谱分离纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米，流动相 洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵水溶液，洗脱条件：洗脱液A保持2分钟，然 后洗脱液B在13分钟从0增加到18％，流速＝10毫升/分钟，保留时间为R_t＝12-15 分)，其次是反相高效液相色谱纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C₁₈ column，19× 300毫米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA pH值等于7，洗脱液B＝50％乙腈和50％的洗 脱液A，梯度从0到100％B历时30分钟，流速＝5毫升/分钟，保留时间为R_t＝20分 钟)，冷冻干燥后得到6l为无色泡沫。反应的产率经由紫外线(291纳米，吸光系数＝ 11000Lmol^-1cm^-1)确定为270微摩尔(总产率为27％)。部分的产品(大约200微摩 尔)经过DOWEX-50WX-8(Na⁺)树脂(10克)和水(30毫升)处理3小时后，被转换 为钠离子的形式，再次经过上述的反相高效液相色谱纯化。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.77(s，3H)；1.79(s，3H)；2.13- 2.24(m，1H)；2.41-2.49(m，1H)；2.85-3.00(m，2H)；3.38-3.55(m，2H)；4.05-4.20(m，4H)；4.26- 4.32(m，1H)；4.46(s，2H)；4.78-4.83(m，1H)；6.16(dd，J＝5.4，8.8Hz，1H)；8.09(s，1H).³¹P- NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-8.7(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.3(d，J ＝19.5Hz，1P)；-22.3(t，J＝19.5Hz，1P).

dUTP-ONH2携带一个Cy3标记的乙炔二醇连接器(化合物6n)。

化合物6l(纳盐，20微摩尔)的磷酸氢二钾(0.5摩尔，0.6毫升)水溶液与Cy3- OSu(10毫克，约12微摩尔)的DMSO(0.8毫升)和丙酮(0.4毫升)溶液混合。室温 下，该混合物在黑暗中被搅拌2小时。反应混合物被水(25毫升)稀释，接下来用离子 交换高效液相色谱纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米，流动相洗脱液 A＝水，洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵水溶液，洗脱条件：洗脱液A保持2分钟，然后洗脱 液B在28分钟从0增加到55％，流速＝10毫升/分钟，保留时间为R_t＝25分钟)，

冻干后得到红色泡沫状化合物6m。在6m肟的水溶液(10毫升)中加入NaOAc的 缓冲溶液(1M，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(50WT％，100微升， 约1.6毫摩尔)。室温下，该混合物在黑暗中被搅拌3小时。反应混合物被水(10毫升) 稀释，过滤(0.2微米)。接下来用离子交换高效液相色谱纯化(Dionex BioLC DNAPac  PA-100，22×250毫米，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵水溶液，洗脱 条件：洗脱液B在20分钟从0增加到60％，流速＝10毫升/分钟，保留时间为R_t＝18分 钟)，冻干后得到红色泡沫状化合物6n。产率是由紫外线(290纳米，吸光系数＝21000 Lmol^-1cm^-1)确定为7.4微摩尔(基于染料的总产率约为60％)。

例7.含有乙炔侧链和Cy3.5荧光基团的胞苷类似物(图9和10)

1-(2′-脱氧-5’-O-dimethoxytrityl-β-threopentofuranosyl)-5-iodouracil(7b)

在5-碘-2′-脱氧尿苷(7a，10克，28.2毫摩尔)的吡啶(150毫升)溶液中，在搅 拌下，加入Et₃N(4.4毫升，31.6毫摩尔)和DMAP(350毫克，2.86毫摩尔)，接下 来，在室温下再加入DMTrCl(10.5克，30.9毫摩尔)。反应混合物在室温下搅拌过夜。 然后加入Et3N(4.8毫升，34.5毫摩尔)和MsCl(2.54毫升，32.8毫摩尔)的混合物。 室温搅拌2小时后，.反应混合物被过滤，所得的固体用乙酸乙酯洗涤。滤液经浓缩后，被 溶解于乙醇(150毫升)中，并加入NaOH(1摩尔，70毫升)。回流1.5小时后，混合 物冷却到室温，并用盐酸(1摩尔，40毫升)处理。旋转蒸发去除乙醇，所得的残留物用 二氯甲烷提取。有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤和浓缩。残余物经硅胶柱层析 (正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1至1∶2)分离纯化最终得到7b(9.5克，14.5毫摩尔，51％)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ9.52(s，1H)，8.21(s，1H)，7.21-7.44(m，9H)，6.82(m，4H)，6.15(dd， 1H)，4.42(m，1H)，4.06(m，1H)，3.80(s，6H)，3.62(m，2H)，3.42(m，2H)，3.12(m，1H)，2.72(m， 1H)，2.19(m，1H).

1-(5’-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2’-deoxy-β-threopentofuranosyl)-5-iodouracil(7d)

在7b(6.7克，10.2毫摩尔)的二氯甲烷(60毫升)溶液中，在室温下加入三氯乙酸 (3.34克，20.4毫摩尔)。反应混合物在室温下搅拌2小时，然后倒入正己烷(200毫 升)中。所得的沉淀经过过滤，用乙醚洗涤，干燥得到7c。这种固体被溶解于DMF(45 毫升)，所得的溶液与咪唑(2.08克，30.6毫摩尔)和TBDPSCl(2.88毫升，11.2毫摩 尔)在0℃混合。混合物加热到室温，搅拌3h，倒入水(200毫升)中，用乙醚提取。 用硫酸钠干燥有机层，过滤和浓缩。所得的残留物由硅胶柱层析(正己烷∶乙酸乙酯＝ 2∶1至1∶2)分离纯化最终得到7d(5.02克，8.5毫摩尔，83％)。

化合物7c：¹H NMR(DMSO-d₆)：δ11.63(s，1H)，8.35(s，1H)，5.99(dd，1H，J＝1.8 and  8.1)，5.31(d，1H，J＝3.3)，4.72(t，1H，J＝5.4)，4.19(m，1H)，3.79(m，1H)，3.57-3.74(m，2H)， 2.49(m，1H)，1.87(m，1H).

化合物7d：¹H NMR(CDCl₃)：δ9.31(s，1H)，8.32(s，1H)，7.66-7.72(m，4H)，7.39-7.50(m， 6H)，6.16(dd，1H，J＝1.8and 8.1)，4.53(m，1H)，4.09(m，2H)，3.89(m，1H)，3.50(br s，1H)， 2.53(m，1H)，2.14(dd，1H，J＝1.8 and 15.0)，1.09(s，9H)；¹³C NMR(CDCl₃)：δ160.51，150.60， 146.53，135.77，135.75，132.59，132.44，130.45，128.28，128.25，85.43，85.58，71.17，68.00， 62.56，41.27，27.14.

5′-O-tert-Butyldiphenylsilyl-3’-O-phthalimido-5-iodo-2’-deoxyuridine(7e)

在7d(1.92克，3.24毫摩尔)，苯基膦(1.27克，4.84毫摩尔)和N-羟基邻苯二甲 酰亚胺(793毫克，4.86毫摩尔)和甲苯(35毫升)的化合物中，在0℃时，搅拌条件 下加入DIAD(0.96毫升，4.88毫摩尔)。反应混合物加热到室温，并搅拌1小时，旋转 蒸发浓缩。所得的残留物由硅胶柱层析(正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1至1∶2)分离纯化最终得 到7e(1.9克，2.58毫摩尔，79％)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.49(s，1H)，8.09(s，1H)，7.84-8.09(m，2H)，7.78-7.82(m，2H)，7.60- 7.65(m，4H)，7.34-7.44(m，6H)，6.44(dd，1H，J＝5.1and 9.0)，4.94(m，1H)，4.49(m，1H)，3.96 (dd，1H，J＝3.0and 11.7)，3.83(dd，1H，J＝3.0and 11.7)，2.84(dd，1H，J＝5.4and 14.4)，2.13 (m，1H()，1.06(s，9H).

5′-O-tert-Butyldiphenylsilyl-3’-O-(NHMMTr)-5-iodo-2’-deoxyuridine(7g)

在7e(4.9克，6.64毫摩尔)和乙醇(50毫升)的混合物中，室温下加入水合肼 (0.41毫升，13.2毫摩尔)。混合搅拌(30分钟)，过滤，并用二氯甲烷洗涤。滤液浓 缩后，所得的残留物经由硅胶柱层析(正己烷/乙酸乙酯＝1/1)分离纯化，得到化合物7f (3.45克，5.68毫摩尔，85％)。化合物7f(3.45克，5.68毫摩尔)的二氯甲烷(60毫 升)溶液，与N，N-二异丙基(1.48毫升，8.5毫摩尔)和MMTCl(1.93克，6.25 mmol)的混合。混合液在室温下被搅拌1h后，浓缩。所得的残留物由硅胶柱层析(正 己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)分离纯化，最终得到7g(4.09克，4.65毫摩尔，82％).

¹H NMR(CDCl₃)：δ8.64(s，1H)，8.04(s，1H)，7.25-7.73(m，20H)，7.13(m，2H)，6.79(m， 2H)，6.59(s，1H)，6.11(dd，1H，J＝5.1and 9.3)，4.23(m，1H)，3.99(m，1H)，3.81(m，1H)，3.78 (s，3H)，3.58(dd，1H，J＝3.0 and 11.7)，2.48(m，1H)，1.87(m，1H)，1.04(s，9H).

5’-O-tert-Butyldiphenylsilyl-3’-O-(NH-MMTr)-5-iodo-2’-deoxycytidine(7h)

在1，2，4-三唑(4.33克，62.7毫摩尔)的乙腈(50毫升)溶液中，在0℃加入 POCl3(1.28毫升，13.98毫摩尔)。该混合物在0℃下搅拌10分钟后，加入Et3N (8.74毫升，62.7mmol)。在0℃下反应30分钟后，加入7g(4.09克，4.65毫摩尔) 的乙腈(50毫升)溶液。得到的混合物在室温下搅拌2h后，加入水(15毫升)后，浓 缩反应混合物。所得的残留物用二氯甲烷稀释，并用NaHCO3水溶液洗涤。干燥有机层 (硫酸钠)，过滤和浓缩。所得的残留物被溶解在pyridine/NH4OH(1/1，70毫升) 中，室温下搅拌3小时后，浓缩反应混合物。所得残留物经由硅胶柱层析纯化(二氯甲 烷∶甲醇＝100∶0到15∶1)得到化合物7h(3.6克，4.1毫摩尔，88％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.17(s，1H)，7.86(brs，2H)，7.09-7.64(m，22H)，6.79(m，2H)，6.63 (brs，1H)，3.96(dd，1H，J＝5.4 and 9.0)，4.04(m，1H)，3.96(m，1H)，3.69(s，3H)，3.65(m，1H)， 3.51(m，1H)，2.29(m，1H)，1.72(m，2H)，0.94(s，9H).

3’-O-(NH-MMTr)-5-iodo-2’-deoxycytidine(7i)

在化合物7h(1.89克，2.15毫摩尔)的THF(30毫升)溶液中，加入1M TBAF的 四氢呋喃(3毫升)溶液。反应混合物在室温下搅拌1小时后，浓缩。所得残留物经由硅 胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1到12∶1)得到化合物7i(1.11克，1.73毫摩尔，80 ％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.20(s，1H)，8.07(s，1H)，7.78(brs，1H)，7.19-7.30(m，10H)，7.10 (d，2H，J＝9.3)，6.82(d，2H，J＝9.0)，6.59(brs，1H)，5.97(dd，1H，J＝5.7 and 7.8)，5.01(t，1H， J＝4.7)，3.97(m，1H)，3.91(m，1H)，3.71(s，3H)，3.46(m，1H)，3.37(m，1H)，3.21(m，1H)，1.74 (m，1H).

3’-O-(NH-MMTr)-5-acetylene diol linker-2’-deoxycytidine(7j)

在7i(920毫克，1.44毫摩尔)，CuI(55毫克，0.29毫摩尔)和DMF(15毫升)的 混合物中，分别加入Pd(PPh₃)₄(166毫克，0.14毫摩尔)和Et3N(0.4毫升，2.87毫摩 尔)。在加入上述的侧链化合物(1.18克，2.85mmol)的DMF(10毫升)溶液后，反应 混合物在室温下搅拌过夜后，浓缩。所得残留物经由硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝ 15∶1到10∶1)。得到的粗产品进一步经过反向高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova- Pak HR C₁₈柱，19×300毫米，流动相A＝50％乙腈和水，流动相B＝100％乙腈， 洗脱梯度为，流动相B在20分钟内从0增加到70％，流速为5毫升/分钟)。在21分钟 时，出现高峰，并收集样品，冻干白色得到固体7j(600毫克，0.65毫摩尔，45％)。¹H  NMR(DMSO-d₆)：δ8.61(t，1H，J＝5.4)，8.13(t，1H，J＝5.4)，8.07(s，1H)，8.04(s，1H)，7.78 (brs，1H)，7.19-7.30(m，10H)，7.09(d，2H，J＝9.0)，6.82(d，2H，J＝9.0)，6.72(m，2H)，5.98(dd， 1H，J＝6.0 and 8.7)，5.45(s，2H)，4.95(t，1H，J＝4.8)，3.99-4.17(m，4H)，3.71(s，3H)，2.86-3.47 (m，6H)，2.24(m，1H)，2.07，2.21(2s，6H)，1.71(m，1H)，1.35(s，9H)；ESI-MS：m/e＝925

3’-O-(N-acetone-oxime)-5-acetylene diol linker-2’-deoxycytidine-5’-triphophsphate(7k)

在化合物7j(240毫克，0.26mmol)的吡啶(1.3毫升)和二恶烷(1毫升)溶液 中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(100毫克/1毫升， 0.9毫升)的二恶烷溶液。20分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶 液(0.2摩尔，4.55毫升)和三丁基胺(0.52毫升)的混合物。30分钟后，再加入碘 (117毫克)，吡啶(9.1毫升)和水(0.18毫升)。30分钟后，该反应被亚硫酸钠的水 溶液(5％，0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在20毫升的水 和己氰中(1/1)，并用0.2微米的滤纸过滤。反应产物经过离子交换高效液相色谱法 纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米制备柱，洗脱液A＝水，洗脱液B＝1 摩尔碳酸氢铵水溶液，洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从0％到50％历时 30分钟，洗脱液的流速＝10毫升/分钟)。收集含有三磷酸的组份，冻干后最终得中间产 物，将该产物溶解于10毫升水中。加入氨水(10毫升)后，室温搅拌3小时。在真空条 件下除去溶剂，残留物被溶解于水(25毫升)中，并通过离子交换高效液相色谱法纯化 (Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米制备柱，流动相A＝水，洗脱液B＝1M碳 酸氢铵，洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从0％到50％历时30分钟，洗 脱液的流速＝10毫升/分钟)。收集含有三磷酸腺苷的组份，冻干后得到3′-ONHMMTr 的三磷酸腺苷(约40毫克)，该样品被分装在4个Eppendorf试管中。在每一个 Eppendorf管中分别加入甲醇(10微升)和TFA(200微升)。涡旋后，混合物在室温 下放置2分钟，加入乙醚(1.5毫升)。混合被涡旋后，在-20℃放置30分钟。经过离 心(10,000rpm，10分钟)，将上清液倒掉。残留物溶解于碳酸氢铵(200毫摩尔，0.5毫 升)的水溶液中和丙酮(30微升)中。1小时后，混合被冻干，溶解于水(20毫升) 中，反向高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C₁₈ column，19×300毫 米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAApH值7，洗脱液B＝乙腈，增加洗脱液B的梯度从20％ 到40％经历20分钟，流速5毫升/分钟，保留时间＝12分钟)，冻干后得到7k(～30毫 克)。

¹H NMR(D₂O)：δ8.09(s，1H)，6.16(m，1H)，4.08-4.82(m，8H)，3.48(m，2H)，3.03(m， 2H)，2.48(m，1H)，2.14(m，1H)，1.82，1.79(2s，6H)；³¹P NMR(D₂O)：δ-9.19(m)，-10.47(m)，- 21.75(m).

3’-O-amino-5-acetylene diol linker with Cy 3.5-2’-deoxycytidine-5’-triphosphate(7l)

化合物7k(5毫克)被溶解在磷酸氢二钾的水溶液中(500毫摩尔，400微升)。 接下来，加入Cy 3.5 NHS酯(5毫克)的DMSO(400微升)和丙酮(200微升)溶 液。反应混合物在室温下放置过夜后，加入水。离子交换高效液相色谱法纯化(Dionex  BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米制备柱，流动相A＝水，洗脱液B＝1M碳酸氢铵， 洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从70％到100％历时20分钟，洗脱液的流 速＝10毫升/分钟，保留时间＝16到19分钟)。冻干后，3’肟衍生物溶解于水(5毫 升)并加入1摩尔NaOAc(pH值＝4，1毫升)。这上述溶液中加入NH₂OH(60微 升)。后在黑暗中放置2小时，加入水(7毫升)，所得的混合物经过离子交换高效液 相色谱法纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米制备柱，流动相A＝水， 洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵，洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从70％到100 ％历时10分钟，然后100％的B持续30分钟，洗脱液的流速＝10毫升/分钟，保留时间 ＝21到25分钟)，得到化合物71(0.7微摩尔)。

例8.腺嘌呤类似物与乙炔连接器和Cy5-荧光基团(图11和12)

5′-O-(叔丁基二甲基)deoxydeazaadenosine(8b)。

2′-Deoxydeazaadenosine(8a，1.7克，7.11毫摩尔)与甲苯(25毫升)在100毫升的圆 底烧瓶中旋转共蒸发干两次，然后被溶解在无水DMF(25毫升)中，所得到的溶液中加 入咪唑(1.45克，21毫摩尔)，搅拌直到咪唑完全溶解。在上述溶液中，在氮气保护的情 况下，加入叔丁基二甲基氯(1.2克，8.5毫摩尔)。混合物在室温下搅拌过夜。二氯甲烷 (100毫升)稀释混合物，有机相被水(3×50毫升)和盐水(1×50毫升)萃取。干燥有 机相(硫酸钠)，过滤，并浓缩(旋转蒸发)。所得的残留物经过柱层析分离纯化(硅 胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝95∶5到90∶10)得到8b(2.5克，7.11毫摩尔)。

N⁶-Acetyl-5’-O-(tert-butyldimethylsilyl)-xylo-3’-O-(benzoyl)-2’，3 dideoxydezaadenosine(8d)

在5′-O-(叔丁基二甲基)deoxydeazaadenosine(8b)(2.5克，7.11毫摩尔)，苯 甲酸(1.4克，11.4毫摩尔)和三苯基膦(3克，11.4毫摩尔)的THF(100毫升)溶液 中，在室温下滴加diisopropylazodicarboxylate(DIAD，2.2毫升，11.4毫摩尔)。在室温 下，混合搅拌1小时。加入甲醇(10毫升)来淬反应，搅拌持续15分钟后，抽真空去除 溶剂，所得的残留物经由柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝98∶2到95∶ 5)得到8c(3.3克，7毫摩尔)。中间体(8c，3.3克，7毫摩尔)与无水吡啶(10毫 升)共蒸发干燥两次。然后溶于二氯甲烷(25毫升)，吡啶(1.4毫升)和三乙胺(4.7 毫升)的混合溶剂中，混合物在冰水浴中冷却到0℃，加入乙酰氯(8.5毫摩尔，0.6毫 升)后，反应混合物缓慢升到室温，并在室温下继续搅拌16小时。加入甲醇(30毫升) 淬灭反应，在室温下搅拌30分钟。该混合物再次在冰上冷却至0℃，用浓氨水(10毫 升)稀释。混合物在0℃搅拌15分钟。旋转蒸发去除溶剂，所得的残留物被溶于二氯甲 烷(125毫升)，有机相被饱和碳酸氢钠溶液萃取。干燥有机相(硫酸钠)，过滤，旋转 蒸发，然后在高真空下干燥，得到8d(1.5克，2.62毫摩尔)。

合成7’-iodo-5’-O-(tert-Dimethylsilyl)-xylo-2’，3’-dideoxydeazaadenosine(8f)

化合物8d(1.34克，2.62毫摩尔)溶解在二氯甲烷(100毫升)中，然后加入碳酸钠 (Na₂CO₃)(1.4克，10.48毫摩尔)和ICL(0.853克，5.25毫摩尔)。混合物在室温搅 拌21小时。反应混合物被水硫代硫酸钠(0.1摩尔，50毫升)和饱和碳酸氢钠(50毫 升)洗涤，Na2SO4干燥和蒸发。硅胶层析分离纯化(洗脱液正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1) 得到8e(1.2克，1.8毫摩尔)。得到的中间体被重新溶解在甲醇(100毫升)和NaOMe 的甲醇(30％，0.2毫升，2.7毫摩尔)溶液中。在室温下反应2小时，加入冰醋酸 (0.100毫升)以淬灭反应。旋转蒸发去除溶剂，所得的残留物被溶于二氯甲烷(100毫 升)，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(50％，50毫升)。干燥有机相(硫酸钠)，过 滤，旋转蒸发，所得的残留物经由柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝ 95∶5到90∶10)得到8f(0.847克；1.9毫摩尔)为无色的泡沫。

H-NMR(MeSO-d)：8.1(1H，s)，7.7(1H，s)，6.6(2H，br s)，6.4(1H，m)，5.6(1H，m)，4.3 (1H，m)，3.7-3.9(3H，m)，2.6-2.7(1H，m)，2.1-2.2(1H，m)，0.82(9H，s)，-0.02(6H，s).

3′-O-Phthalimido-7’-iodo-5’-O-(tert-Dimethylsilyl)-2’，3’dideoxydeazaadenosine(8g).

在8f(0.847克，1.9毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(0.489克，3毫摩尔)和三 苯基膦(0.786克，3mmol)的THF(50毫升)溶液中，在室温下加入DIAD(0.6毫 升，3毫摩尔)。在室温下，混合搅拌1小时，加入甲醇(10毫升)淬灭反应。除去溶剂 后，所得的残留物经由柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3到90∶ 10)得到8g(1.2克，1.9毫摩尔)为无色的泡沫

3′-O-氨基-7-碘5′-O-(叔丁基二甲基)-2′，3′-dideoxydeazaadenosine(8h)

冷的甲基肼(0.19毫升，3.8毫摩尔)被加入到-5℃到-10℃的8g(1.2克，1.9毫 摩尔)的无水二氯甲烷溶液中。10分钟后，得到了白色的1，2-二氢-4-羟基-2-甲基-1- oxophthalizine沉淀。悬浮液在室温下搅拌(1小时)。经过滤去除固体沉淀，沉淀物用二 氯甲烷(2×20毫升)洗涤。合并滤液，浓缩，所得的残渣经柱层析分离纯化(硅胶， 洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝100∶0到97∶3)在二氯甲烷给8h(0.959克，1.9毫摩尔)。

3′-O-Aminomonomethoxytrityl-7-碘5′-O-(叔丁基二甲基)-2′，3′-dideoxydeazaadenosine(8i)。

化合物8h与吡啶(10毫升)的混合物旋转蒸发干燥两次。所得的残留物溶解在无水 二氯甲烷(25毫升)。二异丙基乙胺(0.66毫升，3.8毫摩尔)和monomethoxytrityl氯化 物(0.645克，2.1毫摩尔)分别被加入反应体系，TLC跟踪反应的进展情况(二氧化硅， 正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。当反应完成后，混合物用二氯甲烷(100毫升)稀释。有机相 用饱和NaHCO3(50毫升)和水(50毫升)洗涤，硫酸钠干燥，过滤和浓缩。所得的残 渣经柱层析分离纯化(硅胶，230-400目，洗脱梯度为正己烷∶乙酸乙酯＝2∶1到1∶1)得 到8i(0.8克，1.1毫摩尔)。

3′-O-Aminomonomethoxytrityl-7-碘-2′，3′-dideoxydeazaadenosine(8j)。

在8i(0.8克，1.1mmol)的四氢呋喃(2毫升)溶液中加入TBAF的四氢呋喃溶液 (1摩尔，2毫升)。混合搅拌30分钟后，TLC显示反应进行完全。混合物经旋转蒸发浓 缩，用二氯甲烷稀释(100毫升)，并经水(50毫升)和盐水(50毫升)洗涤。水在经 二氯甲烷(100毫升)法相提取。合并有机相，干燥(硫酸钠)，旋转蒸发浓缩。所得的 残渣经柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝100∶0到95∶5)得到8j(0.6 克，1mmol)。

H-NMR(MeSO-d)：8.1(1H，s)，8.05(1H，s)，7.6(1H，s)，7.2-7.4(10H，m)，6.8(4H，m)，6.6(2H， br s)，6.3(1H，m)，5.0(1H，m)，4.0-4.1(1H，m)，3.9(1H，m)，3.8(3H，s)，3.3-3.5(2H，m)，2.2-2.3 (2H，m).

含有连接器的3′-O-Aminomonomethoxytrityl-7-碘-2′，3′-dideoxydeazaadenosine(8k)

在中间体8j(0.663克，1毫摩尔)的DMF(25毫升)溶液中，在氩气保护的条件 下，相继加入CUI(38毫克，0.2毫摩尔)，三乙胺(0.3毫升，2毫摩尔)，Boc保护的 连接器(5d，0.828克，2毫摩尔)和Pd(PPh₃)₄(115.6毫克，0.1毫摩尔)。黄色的溶液 在室温下搅拌1小时。TLC(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)显示反应完成后。用25毫升5％的 EDTA淬灭反应，并用乙酸乙酯提取。有机层被干燥(硫酸钠)和浓缩至干，所得的残渣 经柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝100∶8)得到8k(0.8克，0.9毫摩 尔)。

H-NMR(MeSO-d)：8.8(1H，br s)，8.7(1H，br s)，8.1(1H，br s)，8.05(1H，s)，7.7(1H，s)， 7.1-7.3(10H，m)，6.8-6.9(4H，m)，6.7(1H，br s)，6.3(1H，m)，5.4-5.5(2H，m)，5.1(1H，m)，4.0- 4.1(1H，m)，3.9(1H，m)，3.8(3H，s)，3.3-3.4(1H，m)，2.8-3.2(4H，m)，2.2-2.3(2H，m)，2.1(3H， s)，1.9(3H，s)，1.4(9H，s).

3′-O-(N-acetone-oxime)-2′-deoxy-7-deazaadenosine-5′-triphosphate carrying acetylene linker with diol and primary amine(8m).

在完全保护的5′-OH核苷8k(3′-O-NH-MMTr，linker-di-OAc/NH-Boc)(480毫 克，0.5mmol)的吡啶(2毫升)和二恶烷(1.7毫升)溶液中，在室温下，加入2-chloro- 4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(130毫克，0.7毫摩尔)的二恶烷(1.3毫升)溶 液。20分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，7毫 升，1.4毫摩尔)和三丁基胺(0.8毫升，3.2毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘 (180毫克，0.7毫摩尔)，吡啶(14毫升)和水(0.28毫升)。30分钟后，该反应被亚 硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在 25毫升的水和20毫升的己氰中，并用0.2微米的滤纸过滤。反向高效液相色谱法纯化 (Waters Prep Nova-Pak HR C₁₈ column，19×300毫米，洗脱液A＝水，洗脱液B＝ 乙腈，增加洗脱液B的梯度从18％到50％经历25分钟，在接下来的5分钟内增加B到 60％，然后继续增加B到90％历时2分钟，90％的B继续保持8分钟，流速5毫升/分 钟，保留时间＝25-33分钟)，冻干后得到保护的三磷酸8l(由于部分损失二醇醋酸乙烯 酯而得的混合物)为无色泡沫。该中间用浓氢氧化铵(50毫升)，在室温下处理4小 时，然后再次冻干。所得的残留物用甲醇(1.2毫升)和TFA(32毫升)在室温下处理3 分钟。加入乙醚(250毫升)后所得的悬浮液在-20℃保存1小时，通过离心分离沉淀， 并倒掉上清液。沉淀被溶解在含丙酮(2毫升)的碳酸氢钠缓冲液(80毫米，130毫升) 中。用稀盐酸调节pH值到6，在室温下，放置上述溶液3小时。抽真空除去剩余的丙酮 和乙醚。水溶液被过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱分离纯化(Dionex BioLC  DNAPac PA-100，22x 250毫米，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔TEAB pH值8，洗脱条 件为：保持流动相A 2分钟，然后从流动相B从0％增加到50％历时16分钟，流速10 毫升/分钟，保留时间＝16分钟)，其次是反相高效液相色谱纯化(Waters Prep Nova-Pak  HR C₁₈柱，19x 300毫米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA pH值7，洗脱液B＝A中含 有50％的乙腈，洗脱梯度为，在25分钟内增加B从20％到60％，流速＝5毫升/分钟， 保留时间＝18分钟)，冷冻干燥后得到8m为无色泡沫。紫外线(280纳米，吸光常数＝ 13000Lmol^-1cm^-1)确定产率约为130微摩尔(约25％的总产率)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.79(s，3H)；1.84(s，3H)；2.45- 2.52(m，2H)；3.00-3.08(m，2H)；3.42-3.48(m，2H)；3.95-4.10(m，3H)；4.18-4.28(m，2H)；4.48 (s，2H)；4.83-4.88(m，1H)；6.33(dd，J＝7.4，7.6Hz，1H)；7.48(s，1H)；7.86(s，1H).³¹P-NMR (D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-9.0(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.2(d，J＝ 19.5Hz，1P)；-22.5(t，J＝19.5Hz，1P).

7-deaza-dATP-ONH₂ carrying a Cy5-labelled acetylene diol linker.

化合物8m(约为10微摩尔)的磷酸氢二钾(0.5摩尔，0.5毫升)的水溶液与Cy5- OSu(8毫克，约8微摩尔)的DMSO(0.7毫升)和丙酮(0.35毫升)的溶液混合。混合 物在室温下，在黑暗中反应4小时。混合物被水(16毫升)稀释，离子交换高效液相色 谱纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22x 250毫米，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔 碳酸氢铵水溶液，洗脱条件为：保持流动相A 2分钟，然后从流动相B从0％增加到60 ％历时18分钟，流速10毫升/分钟，保留时间＝19分钟)，冻干后得到蓝色泡沫8n。在 此肟的水溶液中(10毫升)加入醋酸钠缓冲液(2毫升，1摩尔，pH值4.0，2毫摩尔) 和水羟胺溶液(50wt-％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下黑暗中反应3小时后，用 水稀释(10毫升)，过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱纯化(Dionex BioLC  DNAPac PA-100，22x 250毫米，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵缓冲液，洗脱 条件为：保持流动相A 2分钟，然后流动相B从0％增加到80％历时18分钟，流速10 毫升/分钟，保留时间＝17分钟)，冷冻干燥后得到8o为蓝色泡沫。紫外线(290纳米， 吸光常数＝19000Lmol^-1cm^-1)确定产率约为4.6微摩尔(约60％的产率)。

例9.携带荧光基团的鸟嘌呤类似物的合成(图13和14)

4-氯-2-trimethylacetamido-比咯并[2，3-d]嘧啶(9a)。

在2-氨基-4-氯吡咯并[2，3-D]嘧啶(7.3克，43.61毫摩尔)的无水吡啶(120毫升) 溶液中，加入特戊酰氯(18.7毫升，152.63毫摩尔)。反应在氮气保护下，室温搅拌16小 时。并用甲醇(50毫升)淬灭反应。然后在真空下去除溶剂，残留物与甲苯(100毫升) 工蒸发。由此产生的残留物溶于乙酸乙酯(150毫升)中，有机相用0.1摩尔的盐酸(3x75 毫升)洗涤。有机层被干燥(硫酸镁)和蒸发。所得的残渣经柱层析分离纯化(硅胶，洗 脱液为乙酸乙酯∶正己烷＝70∶30)得到9a(12.2克)为白色结晶状固体。

¹H-NMR(DMSO-d₆)：1.2(9H，s)，6.5(1H，d，J₁＝4Hz)，7.5(1H，d，J₁＝4Hz)，10.1(1H，s)， 12.3(1H，s).

4-氯-5-碘-2-trimethylacetamido-吡咯并[2，3-d]嘧啶(9b)。

在氮气保护下，4-氯-2-trimethylacetamido-吡咯并[2，3-d]嘧啶(9a，10.9克， 43.24毫摩尔)被溶解在无水四氢呋喃(120毫升)中。在加入N-碘代丁二酰亚胺 (10.7克，47.56毫摩尔)以后，混合物在室温下被搅拌1小时。然后在抽真空条件下去 除溶剂。所得的残留物被溶于乙酸乙酯(100毫升)，并用1摩尔的硫代硫酸钠(3x100 毫升)洗涤。柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝98∶2)得到化合物9b(12.9克)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)：1.2(9H，s)，7.8(1H，d，J₁＝4Hz)，10.1(1H，s)，12.7(1H，s).

4-chloro-7-(2-deoxy-3，5-di-O-(p-toluoyl)-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-N-[trimethylacetamido]-7-iodo-pyrrolo[2，3-d]pyrimidine(9c)的合成。

在粉状KOH(1克，85％，18.44毫摩尔)，TDA-1(0.2毫升，0.63毫摩尔)和乙 腈(60毫升)的悬浮液中，加入化合物9b(2克，5.3毫摩尔)。反应混合物被搅拌 5分钟后，加入2-脱氧-3，5-di-O-(p-toluoyl)-a-D-erythro-pentofuranosyl  chloride(2.7克，6.9毫摩尔)，持续搅拌1小时后，不溶物被过滤，沉淀物用乙腈 和热的丙酮洗涤，合并滤液并蒸发至干。所得的残留物经过柱层析纯化(硅胶，二氯甲 烷洗脱)。合并包含产品的洗脱液，蒸发得到9c(1.6克)为泡沫状。

Rf＝0.53.¹H NMR(CDCl)：d＝1.35-1.37(m，9H，3CH3)，2.42(s，3H，CH3)，2.45(s，3H， CH3)，2.78-2.82(m，1H，H-2)，2.91-2.97(m，1H，H-2)，4.55-4.58，4.63-4.66，4.73-4.76(3m， 3H，H-4，2H-5)，5.77-4.78(m，1H，H-3)，6.74(t，1H，J＝6.8Hz，H-1)，7.25，7.28，7.90，7.98 (4d，8H，J＝8.1Hz，)，8.16(s，1H，H-6)，10.29(s，1H，NH).

2-Amino-6-methoxy-7-iodo-9-[beta-D-ribo-5’-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-deoxyribofuranosyl]-7-deazapurine(9e).

化合物9c(3.8克，5.2毫摩尔)和0.5摩尔的MeONa/甲醇(71毫升)溶液被加热回 流3小时。反应混合物用冰醋酸(2.0毫升)中和，旋蒸去除溶剂，所得的粗品经过硅胶 柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝95∶5)。含有产品的组份被收集，蒸发至干，得到9d (1.8克)为无色固体。在9d(1.5克，3.69毫摩尔)和咪唑(652毫克，9.5毫摩尔)的 无水DMF(15毫升)溶液中加入叔丁基二甲基氯(0.720克，4.8毫摩尔)。反应混合物 在室温下搅拌20小时，大部分的溶剂在抽真空下被除去，残留物经过柱层析纯化(硅 胶，洗脱液EtAOc∶正己烷＝1∶2到2∶1)，得到9e(1.5克)为白色泡沫。

¹H NMR(CDCl)：7.23(s，1H)，6.49(dd，J＝6.1，7.7Hz，1H)，4.46(m，1H)，3.99(s，3H)， 3.94(m，1H)，3.79-3.87(m，2H)，2.36-2.44(ddd，J＝5.8，7.7，13.3Hz，1H)，2.24-2.31(ddd，J＝ 3.1，6.0，13.3Hz，1H)，0.96(s，9H)，0.14(s，3H)，0.13(s，3H)

2-Amino-6-methoxy-7-iodo-9-[beta-D-xylo-5’-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-deoxyribofuranosyl]-7-deazapurine(9g)

在9e(1.5克，2.88毫摩尔)，对硝基苯甲酸(770毫克，4.61毫摩尔)和Ph₃P(1.2 克，4.61毫摩尔)的四氢呋喃(20毫升)溶液中，在室温下加入DIAD(0.9毫升，4.61 毫摩尔)。反应1小时后，加入甲醇(2毫升)。反应溶剂在抽真空下被除去，残留物经 过柱层析纯化(硅胶，洗脱液EtAOc∶正己烷＝1∶2到1∶1)，得到9f(1.7克)为淡黄 色固体。化合物9f(1.7克)在甲醇氨水(40毫升)中，在室温下被搅拌1小时，然后在 真空状态下浓缩。残留物经过柱层析纯化(硅胶，洗脱液EtAOc∶正己烷＝1∶2到2∶ 1)，得到9g(1.4克)为白色泡沫。¹H NMR(DMSO-d)：7.4(s，1H)，6.3-6.4(s，2H)，6.25- 6.3(dd，J＝2.7，8.4Hz，1H)，5.4(d，J，3.9，1H)，4.3(m，1H)，3.99(s，3H)，3.94(m，1H)，3.7-3.8 (m，2H)，2.6-2.7(m，2H)，1.2(s，9H)，0.9(s，6H).

合成2-amino-7-iodo-9-[beta-D-ribo-3’-O-aminoxy-N-(4-monomethoxytritylamino)-2-deoxyribofuranosyl]-7-deazapurine(9k)

在9e(1.4克，2.7毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(704毫克，4.32毫摩尔)和三 苯基膦(1.1克，4.32毫摩尔)的四氢呋喃(20毫升)溶液中，在室温下加入DIAD (0.85毫升，4.32毫摩尔)。反应1小时后，加入甲醇(2毫升)。反应溶剂在抽真空下 被除去，残留物经过柱层析纯化(硅胶，洗脱液EtAOc∶正己烷＝1∶2到1∶1)，得到 9h(1.8克)为无色的泡沫。冷的甲基肼(0.3毫升，5.4毫摩尔)被添加到-5℃到-10℃ 的9h(1.8克，2.7毫摩尔)的无水二氯甲烷溶液中。10分钟后，1，2-二氢-4-羟基-2-甲 基-1-oxophthalizine以白色沉淀的形式产生。悬浮液在室温下搅拌1小时后，过滤除去 固体沉淀，并用二氯甲烷(2×20毫升)洗涤。合并滤液，浓缩，得到的残留物经过硅 胶柱层析纯化(乙酸乙酯∶甲醇＝90∶10)得到9i(600毫克)。化合物9i(600毫克， 1.12毫摩尔)与吡啶(5毫升)旋转蒸发干燥两次后，被溶解在无水二氯甲烷(10毫升) 中。在加入二异丙基乙胺(0.29毫升，1.6毫摩尔)和monomethoxytrityl酰氯(364毫 克，1.17毫摩尔)后，反应4小时，TLC显示反应完全了。二氯甲烷(50毫升)稀释反 应，有机相被饱和碳酸氢钠水溶液(25毫升)和水(25毫升)洗涤，然后通过Na₂SO₄干 燥。过滤，浓缩后，得到的残留物经过硅胶柱层析纯化(硅胶(230-400目，洗脱液正己 烷∶乙酸乙酯＝2∶1)得到9j(0.784克)。在中间体9j(784毫克，0.97毫摩尔)的无水 DMF(10毫升)溶液中加入thiocresolate钠(657毫克，4.5毫摩尔)，混合物加热到90 ℃反应1小时，在真空状态下除去溶剂，所得的残留物经柱层析纯化(硅胶，洗脱液为 甲醇∶二氯甲烷＝5∶95)得到9k(600毫克为淡黄色固体。在中间体9K(600毫克)的 四氢呋喃(0.5毫升)溶液中，加入TBAF/THF(1摩尔，0.5毫升)。混合物搅拌30分钟 后，TLC显示反应完成。浓缩反应液，二氯甲烷(25毫升)稀释混合物，并用水(15毫 升)和盐水(15毫升)洗涤。二氯甲烷(25毫升)方向提取水相，合并有机相，硫酸钠 干燥和浓缩有机相。所得的残留物经柱层析纯化(硅胶，洗脱液为甲醇∶二氯甲烷＝5∶ 95)得到9l(500毫克)。

¹H NMR(DMSO-d)：10.45(s，1H)，8.05(s，1H)，7.9(s，1H)，6.9-7.4(m，14H)，6.3(s，2H)， 6-6.1(m，1H)，4.85(t，J＝6.2，1H)，4.0(m，1H)，3.84(m，1H)，3.72(s，3H)，3.3-3.4(m，2H)，2.1- 2.2(m，2H).

合成含有侧链的鸟嘌呤衍生物(9m)

在中间体9k(500毫克，0.73毫摩尔)的DMF(10毫升)溶液中，在氩气保护的条 件下，相继加入CUI(28毫克，0.147毫摩尔)，三乙胺(0.2毫升，1.47毫摩尔)，Boc 保护的连接器(0.61克，1.47毫摩尔)和Pd(PPh₃)₄(84毫克，0.073mmol)。黄色的溶 液在室温下搅拌3小时。TLC(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)显示反应完成后。用25毫升5％ 的EDTA淬灭反应，并用乙酸乙酯提取。有机层被干燥(硫酸钠)和浓缩至干，所得的 残渣经柱层析分离纯化(硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得到9m(0.481 克)。

H NMR(DMSO-d)：10.43(s，1H)，8.7(m，1H)，8.2(m，1H)，8.1(s，1H)，6.85-7.35(m，14H)， 6.8(br，s，1H)，6.3(br，s，1H)，6-6.1(m，1H)，5.4-5.5(m，2H)，4.82(t，J＝5.8，1H)，3.8-4.2(m，4H)， 3.7(s，3H)，3.3-3.4(m，2H)，2.8-3.2(m，4H)，2.1-2.3(m，2H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.37(s， 9H).

3′-O-(N-acetaldehyde-oxime)-2′-deoxy-7-deazaguanosine-5′-triphosphate carrying acetylene linker with diol and primary amine(9o)

在化合物9m(480毫克，0.5毫摩尔)的吡啶(2毫升)和二恶烷(1.9毫升)的溶液 中，在室温下，加入2-chloro-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(110毫克，0.6毫摩 尔)的二恶烷(1.1毫升)溶液。20分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的 DMF溶液(0.2摩尔，6毫升，1.2毫摩尔)和三丁基胺(0.7毫升，2.8毫摩尔)的混合 物。20分钟后，再加入碘(155毫克，0.6毫摩尔)，吡啶(12毫升)和水(0.24毫 升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应 溶剂后，所得的残留物溶解在浓氨水(40毫升)，室温放置5小时。冷冻干燥除去溶 剂，残留物溶解在65毫升TEAA缓冲溶液(50毫摩尔)和30毫升的己氰中，并用0.2 微米的滤纸过滤。反向高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C₁₈ column，19×300毫米，洗脱液A＝25毫摩尔的TEAA(pH＝7)，洗脱液B＝在A中含有50％的 乙腈，增加洗脱液B的梯度从30％到60％经历22分钟，流速5毫升/分钟，保留时间＝ 16分钟)，冻干后得到二醇中间体为无色泡沫。该中间用甲醇(0.4毫升)和TFA(6毫 升)在室温下处理3分钟。加入乙醚(70毫升)后所得的悬浮液在-20℃保存1小时，通 过离心分离沉淀，并倒掉上清液。沉淀被溶解在含乙醛(1毫升)的碳酸氢钠缓冲液(80 毫米，90毫升)中。该溶液在室温下放置3小时。抽真空除去剩余的乙醛和乙醚。水溶 液被过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱分离纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100， 22x 250毫米，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔NH₄HCO₃，洗脱条件为：保持流动相A 2分钟，然后从流动相B从0％增加到50％历时20分钟，流速10毫升/分钟，保留时间＝ 15分钟)，其次是反相高效液相色谱纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C₁₈柱，19x 300毫米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA pH值7，洗脱液B＝A中含有50％的乙腈，洗脱 梯度为，在40分钟内增加B从0％到45％，流速＝5毫升/分钟，保留时间＝31到31.5分 钟)，冷冻干燥后得到9o为无色泡沫。紫外线(273纳米，吸光常数＝10000Lmol^-1cm^-1)确定产率约为60微摩尔(约12％的总产率)。¹H-NMR(D₂O，300MHz)：(ppm，rel to  HDO＝4.65)＝1.76(d，J＝5.9Hz，1.5H)；1.80(d，J＝5.7Hz，1.5H)；2.40-2.56(m，2H)；3.00- 3.08(m，2H)；3.42-3.48(m，2H)；3.95-4.32(m，5H)；4.47(s，2H)；4.85-4.95(m，1H)；6.24(dd，J ＝7.5，13.8Hz，1H)；6.93(q，J＝5.7Hz，0.5H)；7.26(s，1H)；7.51(q，J＝5.9Hz，0.5H).³¹P- NMR(D₂O，120MHz)：(ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-0.9(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.2(d，J ＝19.5Hz，1P)；-22.7(t，J＝19.5Hz，1P).

7-deaza-dGTP-ONH₂ carrying a BODIPY-FL-C₅-labelled acetylene diol linker(9q).

化合物9o(约为7微摩尔)的磷酸氢二钾(0.5摩尔，0.5毫升)的水溶液与 BODIPY-FL-C₅-OSu(5毫克，约12微摩尔)的DMSO(0.7毫升)和丙酮(0.3毫升)的 溶液混合。混合物在室温下，在黑暗中反应4小时。混合物被水(15毫升)稀释，离子 交换高效液相色谱纯化(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22x 250毫米，流动相A＝水， 洗脱液B＝1摩尔碳酸氢铵水溶液，洗脱条件为：保持流动相A 2分钟，然后从流动相B 从0％增加到65％历时18分钟，流速10毫升/分钟，保留时间＝17分钟)，冻干后得到 澄色泡沫9p。在此肟的水溶液中(5毫升)加入醋酸钠缓冲液(1毫升，1摩尔，pH值 4.0，1毫摩尔)和水羟胺溶液(50wt-％，50微升，约0.8毫摩尔)。在室温下黑暗中反 应4小时后，用水稀释(5毫升)，过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱纯化 (Dionex BioLC DNAPac PA-100，22x 250毫米，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔碳酸氢 铵缓冲液，洗脱条件为：保持流动相A 2分钟，然后流动相B从0％增加到100％历时14 分钟，流速10毫升/分钟，保留时间＝14分钟)，冷冻干燥后得到9q为澄色泡沫。紫外 线(273纳米，吸光常数＝12000Lmol^-1cm^-1)确定产率约为2微摩尔(基于核苷的产率约 为30％)。

例10.切除O-NH2基团的模型反应(图16)

(a)HONO在不同介质的水溶液中裂解O-(4-硝基苄基)羟胺。

在O-(4-硝基苄基)羟胺(1毫摩尔，300微升)的水溶液中，加入“互溶溶剂”(盐 水或水或乙醇或异丙醇或乙腈或1，4-二氧杂环己烷)(500微升)，醋酸钠的缓冲液(1 摩尔，100微升，pH值3.5至6.0)，和亚硝酸钠的水溶液(100毫摩尔，100微升)。混 合溶剂的pH值用微电极(精确度±0.02)测定。在室温下，反应1小时后，取出100微 升的溶液作为样品，经过磷酸钾的缓冲液(170毫摩尔，600微升，pH值7)中和，并用 反相高效液相色谱法分析(Waters NovaPak C-18 4μm，3.9x150毫米，洗脱液A＝25毫摩 尔TEAA缓冲液pH值7和3％乙腈，B＝100％的乙腈，洗脱梯度为在30分钟内增加B从 20％到50％，洗脱液流速＝0.5毫升/分钟，产品的保留时间＝8.5分钟；起始原料的保留时 间＝9.5分钟)。

(b1)用二恶烷作为助溶剂的亚硝酸的水溶液裂解3′-O-aminothymidine 1b。

在3′-O-aminothymidine(1b，20毫摩尔，50微升)的水溶液中，分别加入二恶烷 (300微升)和亚硝酸的水溶液(1摩尔，700微升，pH值5.0至6.0，由亚硝酸钠和1摩 尔的NaOAc缓冲制备)。用微电极(精度±0.02)测定该溶液的pH值。在室温下，反应 5分钟后，取出100微升的溶液作为样品，经过磷酸钾的缓冲液(1摩尔，600微升，pH 值7)中和，并用反相高效液相色谱法分析(Waters NovaPak C-18 4μm，3.9x150毫米，洗 脱液A＝25毫摩尔TEAA缓冲液pH值7，洗脱液B＝100％的乙腈，洗脱梯度为在20分 钟内增加B从3％到13％，洗脱液流速＝0.5毫升/分钟，产品的保留时间＝8分钟；起始原 料的保留时间＝11分钟)。裂解的产率是由起始原料1b和产品(胸腺嘧啶)在267纳米 下所得的的峰面积。产率如下：

(b)用亚硝酸的水溶液裂解3′-O-aminothymidine 1b(无助溶剂)。

在3′-O-aminothymidine(1b，20毫摩尔，2微升)的水溶液中，加入亚硝酸的水溶 液(350-700毫摩尔亚硝酸钠/1摩尔的NaOAc，50微升，pH值5.5-5.75)。用微电极 (精度±0.02)测定该溶液的pH值。在室温下，反应1到2分钟后，该反应被磷酸钾的 缓冲液(1摩尔，200微升，pH值7)淬灭，并用反相高效液相色谱法分析(Waters  NovaPak C-18 4μm，3.9x150毫米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA缓冲液pH值7，洗脱液B ＝100％的乙腈，洗脱梯度为在20分钟内增加B从3％到13％，洗脱液流速＝0.5毫升/分 钟，产品的保留时间＝8分钟；起始原料的保留时间＝11分钟)。裂解的产率是由起始原 料1b和产品(胸腺嘧啶)在267纳米下所得的的峰面积。产率如下：

作为对照实验，天然的核苷进行如下的实验：2′-脱氧鸟苷或2′-脱氧腺苷或2′-脱氧 胞苷(20毫摩尔，30微升)与亚硝酸的水溶液(700毫摩尔亚硝酸钠，1摩尔NaOAc， pH值5.5，500微摩尔)在室温下反应72小时(即4320分))。取出50微升的溶液作为 样品，经过磷酸钾的缓冲液(1摩尔，200微升，pH值7)中和，并用反相高效液相色谱 法分析(Waters NovaPak C-18 4μm，3.9x150毫米，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA缓冲液pH 值7，洗脱液B＝100％的乙腈，洗脱梯度为在10分钟内增加B从0％到3％，然后在20 分钟内继续增加B到30％，洗脱液流速＝0.5毫升/分钟，各各核苷的保留时间分别为：dG ＝14分钟；dA＝18分钟；dC＝8分钟)。裂解的产率是由起始原料和副产物在260纳米下 所得的峰面积决定。结果如下：

  核苷   72小时后在260纳米所测得的副产物   dG   20％   dA   13％   dC   15％

例11.延伸、终止和裂解的标准循环(图17)

溶液

TTP-ONH₂溶液：10毫摩尔在10毫摩尔的Tris缓冲溶液pH值8.5(不含HONH₂， 储存在-20℃)。

羟胺溶液：50wt％的去离子水溶液，储存在4℃。

裂解溶液(1毫升)：准备实验的当天新鲜配置：

混合溶剂包括700毫摩尔的亚硝酸(HONO的)30％的二恶烷，在这种情况下，所 得的混合溶剂的pH值为5.7(因为二恶烷提高了pH值)。亚硝酸钠(48毫克，0.7毫摩 尔)被溶解在水溶液的醋酸钠缓冲液(1摩尔，pH值5.0，300微升；)。添加二恶烷 (300微升)。

淬灭缓冲液：10毫摩尔的EDTA。所列出的缓冲液经过羟胺处理，并在室温下孵育 过夜。

主要的洗涤缓冲液。5毫摩尔的Tris-HCl pH值7.5，500微摩尔的EDTA；1摩尔的 氯化钠；2％HONH₂。

延伸后的洗涤缓冲液。10毫摩尔的Tris pH值8.5，2％HONH2。

去离子水。包含2％的HONH2。

裂解后的洗涤。Thermopol缓冲液(这是用来在清洗步骤去除主要的洗涤过程中残留 的盐)；将New England Biolabs公司提供的10X缓冲液用ddH2O稀释到1X。对于以下 所述的捕获和延伸反应，Tris和Thermopol缓冲液均不经过羟胺的预处理。只有上面列出 的洗涤缓冲也经过预处理。

利用捕获反应消除TTP-ONH₂中的TTP-OH

三磷酸的污染是在聚合酶反应和缓冲液中的常见现象。当遇到这些污染时，可以使用 以下的捕获反应来清除，该捕获反应能够清理在10毫摩尔的dNTP-ONH₂溶液中多达5％和 8％的3′-端未保护的三磷酸。在这里，这个反应过程以3′-dTTP为例。

SEQ ID 1 GCG TAA TAC GAC TCA CTA TGG ACG

SEQ ID 2 CGC ATT ATG CTG AGT GAT ACC TGC AAA AAA AAA AAA-5′

1.5微升10毫摩尔的TTP-ONH₂溶液

2.25微升的引物(P-1)和模板(T-3)的复合物(终浓度50pmol/50pmol)

1.5微升的10X Thermopol缓冲液(没有羟胺)

8.25微升ddH₂O(羟胺预处理)

1.5微升Taq475酶(0.5微克/微升的Taq酶溶液)。

在72℃孵育2分钟。在冰上保存，直到准备使用。

这样的体积可以提供15个引物扩展可逆终止反应。

引物扩展反应

混合以下各组份：模板(30pmol)，未经³²P标注的20pmol的引物

2.5pmol ³²P标注的引物

1X Thermopol缓冲液(没有羟胺)

100微摩尔被清理过的TTP-ONH2(使用1微升后诱捕反应)

0.25微克的Taq475酶(1微升)

加入预先被HONH2处理过的ddH2O得到反应的终体积为10微升

预温9微升的反应到72℃，并持续30秒(热启动)

加入1微升的1毫摩尔被清理的TTP-ONH2来启动反应

在72℃下，孵化反应2分钟后。

用5微升10毫摩尔的EDTA溶液淬火反应。

裂解反应

裂解反应的条件最初是基于“自由”的非磷酸化的核苷T-ONH2进行优化。在pH值 为5至7的范围内，反应体系内含有或不含有有机溶剂，均可以接受。在室温下，该反 应在不到5分钟内即可完成，反应产物用反相(RP)高效液相色谱法分析(非磷酸化的 核苷T-ONH2和T-OH很容易地被反相(RP)高效液相色谱法分离，然而磷酸化的 TTP-ONH2和TTP-OH则不能被反相高效液相色谱法分离)。通过链霉亲和素/生物素将 引物和模板连接到磁性微球上，使用相同的裂解反应条件进行去保护基，但在5分钟内 该反应没有完全。在没有进一步的优化反应条件，没有改变任何东西，只是单单地增加了 反应时间到20分钟，而导致反应完全。虽然我们不认为将引物和模板连接到磁性微球上 会延长该反应的时间(与溶液中的自由核苷的反应相比较)，我们还是决定优化这一特定 的反应。上述的模型反应条件，只能被看作是最终优化反应条件的一个起点(这也是为什 么我们没有花更多的精力来优化它)。因为试剂(亚硝酸)的体积较小，我们估计，有可 能将固相上的引物/模板的去保护基反应，从20分钟大大地缩短到几分钟，与单核苷的去 保护基反应所需的时间相近。在分析和优化去保护基反应的另外一个因素是，确保裂解溶 液在反应之前是新鲜制备地，以防止老化的裂解溶液中的二恶烷缓慢氧化后的产物与R- ONH2反应。在加入裂解缓冲液之后(每个10微升的反应中加入100微升的裂解缓冲 液)，反应混合物在室温下孵育20分钟(更短的时间也适用)。用主要的洗涤缓冲液 洗涤两次，以洗去磁珠上反应底物中残留的裂解缓冲液。用裂解后的洗涤缓冲液洗涤两 次，以洗去盐和螯合剂。该周期可以被重复无限次。

例12.使用循环可逆终止法测序(图18)

这个例子显示了在测序循环中使用7-deaza ATP-ONH2(携带Cy5荧光集团)和 CTP-ONH2(携带Cy3.5荧光集团)作为可逆的终止试剂。在这些实验中，反应模板是通 过生物素和磁珠上的链霉亲和素相结合，被固定在Dynabeads磁珠上。

引物，模板，三磷酸：

SEQ ID 1 ³²P 5′-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TGG ACG-3′

SEQ ID 3 5′Biotin-GTC TTC GTG TTT CGT CCA TAG TGA GTC GTA  TTA CGC-3′

SEQ ID 4 5′Biotin-GTC TTC GTG TGG CGT CCA TAG TGA GTC GTA  TTA CGC-3′

1)ATP-ONH₂ Cy5(内部参考)

2)ATP-ONH₂(内部参考)

3)CTP-ONH₂ Cy3.5(内部参考)

4)CTP-ONH₂(内部参考)

所有的缓冲液(裂解缓冲液除外)与0.5％的羟胺预先孵育过夜。引物和模板的复合 物是通过如下的方法制备，γ³²P-标记的引物P-1(SEQ ID 1，1pmol)，未经γ³²P-标记的引 物P-1(SEQ ID 1，20pmol)和模板GG(SEQ ID 4，30pmol)或模板TT(SEQ ID 3， 30pmol)，在96℃下加热5分钟，然后经过1小时冷却到室温(10微升的反应体 积)。四组测序反应被连续地进行，其结果如图18所示。

1)ATP-ONH₂ Cy5，HONO，NaIO₄，ATP-ONH₂

2)ATP-ONH₂，HONO，NaIO₄，ATP-ONH₂ Cy5

3)CTP-ONH₂ Cy3.5，HONO，NaIO₄，CTP-ONH₂

4)CTP-ONH₂，HONO，NaIO₄，CTP-ONH₂ Cy3.5

表.反应程序

第一个延伸反应：

两个不同的反应包含：

30pmol的模板

20pmol的未标记的引物

1pmol标记的引物

1X Thermopol缓冲液

100微摩尔适当的三磷酸腺苷

0.5单位Therminator聚合酶

预热反应(9微升)至72℃，并持续30秒，

用1微升1毫摩尔的三磷酸腺苷启动反应，

在72℃下孵育反应4分钟。

用5微升10毫摩尔的EDTA淬火反应。

在每个步骤结束后，用500微升的洗涤缓冲液洗两次，以清理磁珠上的模板和产物 的复合物的反应。

裂解试剂是由两种冰醋酸和醋酸钠的缓冲液混合而成，裂解试剂中醋酸根阴离子的总 浓度未1摩尔，其中第一种缓冲液的pH值为5.0，第二种缓冲液的pH值为5.5，二者的 比例为3∶4(通常为第一种缓冲液300微升，第二种缓冲液400微升，另外，在加入亚 硝酸钠(48毫克，0.7毫摩尔)。另外，上述裂解试剂中也可以加入二恶烷(300微 升)，所得的试剂的最终pH值约为5.7。在延伸反应之后，模板和产品的复合物被捕获 在磁珠上(Dynabeads)，该混合物在室温下，在裂解缓冲液中被孵育20分钟。然后用 500微升的缓冲液洗涤磁珠两次。在缓冲液被清除后，反应体系中加入反应缓冲液，以 进行下个循环的延伸反应。

第二轮的引物延伸：

30pmol的模板

20pmol的未标记的引物

1pmol标记的引物

1X Thermopol缓冲液

100微摩尔适当的三磷酸腺苷

0.5单位Therminator聚合酶

预热反应(9微升)至72℃，并持续30秒，

用1微升1毫摩尔的三磷酸腺苷启动反应，

在72℃下孵育反应4分钟。

用5微升10毫摩尔的EDTA淬火反应。

如图18所示，Therminator聚合酶能够成功地将荧光标记的可逆终止核苷嵌入到标 准的引物和去除-ONH2集团后所得的“伤痕”引物中。Therminator聚合酶也能够将ATP- ONH2和CTP-ONH2一嵌入到含有“伤痕”碱基的引物中。

例13.“伤痕”引物中嵌入含有标签的可逆终止三磷酸(图19)

“伤痕”代表的是aminoallyl标记的核苷酸(图21)。被研究的两个聚合酶分别是： Taq酶变种[E517G，K537I，L613A]和Therminator II。

引物与模板：

SEQ ID 1 ³²P 5′-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TGG ACG-3′

SEQ ID 5 5′-GTC TTC GTG AAG CGT CCA TAG TGA GTC GTA TTA CGC- 3′

三磷酸：

1)5-Aminoyallyl-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(含有“伤痕”的三磷酸腺苷”)

2)TTP-OH 6-FAM(435-572-ionex-A)-与TTP-ONH₂6-FAM相似，除了-ONH₂集团经 过HONO处理后被去除，然后主产物被分离。

3)TTP-OH

4)TTP-ONH₂ 6-FAM

延伸反应：

在10微升的反应中，γ³²P-标记的引物(SEQ ID 1)(1pmol)，未标记的引物 (20pmol)和模板(SEQ ID 5)(30pmol)在96℃下退火5分钟，然后冷却至室温。 上文提到的Taq酶变体(0.25微克/微升)或Therminator II(每个反应2各单位)被 添加到反应混合物中。反应缓冲液包含以下组分：20毫摩尔的Tris-HCl pH值8.8，氯 化钾10毫摩尔，10毫摩尔(NH₄)₂SO₄，硫酸镁2毫摩尔和0.1％的Triton X-100。加入 适当的三磷酸(100微摩尔的终浓度)来启动反应，反应混合物在72℃孵育30秒或2 分钟。反应混合物，用20微升10毫摩尔的淬灭缓冲液淬灭反应，或加入另一种适当的 三磷酸腺苷(100微摩尔)并持续2分钟。取出4微升的样品，用20％的变性聚丙烯酰 胺凝胶分离样品并用分子成像仪分析结果。如图19所示，Taq酶变种能够嵌入含有 aminoallyl基团的碱基，得到N+1和极少量的N+2的产品。N+2的产品可能是由于含有 疤痕碱基与A的错匹配，或者非模板导向嵌入一个含有疤痕的碱基(A组)。Taq酶变种 在嵌入含有疤痕的碱基后，又嵌入一个标准的TTP-OH得到N+3的产品(疤痕+2A)。 该变种也能在疤痕碱基后再嵌入6-FAM标记的TTP-OH，然后终止反应(N+2)。该反 应仍有极少量的没有被扩展的疤痕碱基(N+1)残留。因此6-FAM标记的TTP-OH和 Taq变体的组合，能够被用在测序反应中。

例14.Taq酶变种，各种疤痕和标记的可逆终止三磷酸(图20)

引物与模板：

SEQ ID 1 ³²P 5′-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TGG ACG-3′

SEQ ID 5 5′-GTC TTC GTG AAG CGT CCA TAG TGA GTC GTA TTA CGC- 3′

三磷酸(图22)

1)5-Propynyl-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(含有“疤痕的三磷酸腺苷”)

2)5-Aminoyallyl-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(含有“疤痕的三磷酸腺苷”)

3)TTP-ONH₂ 5-FAM

4)TTP-ONH₂ 6-FAM

5)TTP-OH

6)CTP-OH

7)TTP-ONH₂(1b)

在10微升的反应中，γ³²P-标记的引物(SEQ ID 1)(1pmol)，未标记的引物 (20pmol)和模板(SEQ ID 5)(30pmol)在96℃下退火5分钟，然后冷却至室温。 反应体系中包含以下组分：20毫摩尔的Tris-HCl pH值8.8，氯化钾10毫摩尔，10毫 摩尔(NH₄)₂SO₄，硫酸镁2毫摩尔和0.1％的Triton X-100，和Taq酶的几种变体 [A594T，L613A，F664Y，E742H](0.25微克/微升)。加入适当的三磷酸(100微摩尔 的终浓度)来启动反应，反应混合物在72℃孵育30秒或2分钟。反应混合物，用20 微升10毫摩尔的淬灭缓冲液淬灭反应，或加入另一种适当的三磷酸腺苷(100微摩尔) 并持续2分钟。取出4微升的样品，用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶分离样品并用分子成 像仪分析结果。如图20所示，Taq酶的变种能够嵌入含有propynyl和aminoallyl基团的 核甘碱基，得到N+1的产品和一些嵌入含有propynyl的碱基后的N+2产品(图20)。 Taq酶变种在嵌入两种含有疤痕的碱基后，又嵌入标准的TTP-OH得到N+4的产品(疤 痕+3个T)。该变种也能在含有aminoallyl疤痕碱基后再嵌入TTP-ONH₂。该Taq变种 不能在疤痕碱基后再嵌入含有萤光标记的可逆终止碱基。

例15.合成含有二硫键的连接器

含有二硫键的连接器在文献中是众所周知的，并且用于制备它的一些组份也可以买 得到。以下是用来制备该链接器的过程，在3-[(2-氨基乙基)硫代]丙酸盐酸盐(750 毫克，3.44毫摩尔)的溶液中，加入1摩尔的氢氧化钠(25毫升)。得到的悬浮液被搅 拌，直到形成一个清亮的溶液。用二氯甲烷(6×50毫升)萃取，合并有机层(硫酸 钠)，过滤和浓缩后，得到622毫克的自由碱基。在自由碱基的THF(3.44毫摩尔) 溶液中(50毫升)滴加di-t-butyldicarbonate(3.0克，14毫摩尔)的四氢呋喃(212毫 升)溶液。混合搅拌过夜，然后被浓缩成为油状物，用水(50毫升)稀释后，并用二氯 甲烷(2×100毫升)提取。合并有机层，干燥(硫酸钠)，过滤和浓缩后，得到所需的 单叔丁氧羰基保护的含有二硫键的连接器，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷中含有0-3％的甲 醇)后得到0.95克的无色油状物。

¹H NMR(Me₂SO-d₆)：1.3(9H，s)，2.52(2H，t，J＝6.4Hz)，2.78-2.80(4H，2t，J＝6.2Hz)，3.15 (2H，t，J＝6.4Hz)

例16.合成含有二硫键连接器的dU

MMT集团保护的3′-ONH2的5-碘基尿苷的衍生物(470毫克，0.73毫摩尔)的 DMF(5毫升)溶液中，加入CUI(38.64毫克，0.146毫摩尔)。在氩气的保护下，相 继加入三乙胺(0.2毫升，1.46毫摩尔)，三氟-N-prop-2-ynyl-乙酰胺(551毫克，3.65 毫摩尔)和Pd(PPh₃)₄(84.38毫克，0.073毫摩尔)。室温下，黄色的溶液被搅拌3.5 小时。薄层色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)跟踪检测反应。混合物被浓缩至干，残留物 经过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷中含有0-5％的甲醇)后得到携带一个链接器的尿苷衍 生物。

¹H NMR(Me₂SO-d₆)：11.71(1H，br s)，8.4(1H，s)，8.1(1H，s)，7.1-7.4(10H，m)，6.7- 6.8(4H，m)，6.1(dd，8.5，5.8Hz，1H)，5.1(1H，br s)，4.0-4.2(3H，m)，3.8-4.0(1H，m)，3.5-3.7 (2H，m)，2.33-2.4(1H，m)，2.07-2.1(1H，m).

上述的产物在甲醇氨(7摩尔)的溶液中搅拌过夜。去保护的产物含有自由的氨基， 经过旋转蒸发浓缩后为白色泡沫状。

上文所述的叔丁氧羰基保护的含有二硫键的酸(141.5毫克，0.479毫摩尔)， HOBT(65毫克，0.428毫摩尔)和5-[3-aminoprop-1-ynyl]dU(SNK-5)(243.3毫 克，0.428毫摩尔)的DMF(5毫升)溶液。混合物在冰浴冷却后加入DCC(0.079毫 升，0.479毫摩尔)。在冰浴冷却下，反应被继续搅拌2小时，然后在室温下搅拌过 夜。化合物用二氯甲烷(2×50毫升)稀释，用水(25毫升)和NaHCO3(两次，25 毫升)的水溶液萃取，去除溶剂后，得到粗产品。经过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷中含 有0-5％的甲醇)后得到纯净的产品。该产品用上文所说的方法被转化为相应的三磷酸和 含有个荧光基团的衍生物。

例17.合成含有二硫键连接器的dA

MMT集团保护的3′-ONH2的7-碘基7-deazaadenosine的衍生物(484毫克， 0.73毫摩尔)的DMF(5毫升)溶液中，加入CUI(38.64毫克，0.146毫摩尔)。在 氩气的保护下，相继加入三乙胺(0.2毫升，1.46毫摩尔)，三氟-N-prop-2-ynyl-乙酰胺 (551毫克，3.65毫摩尔)和Pd(PPh₃)₄(84.38毫克，0.073毫摩尔)。室温下，黄色 的溶液被搅拌3.5小时。薄层色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)跟踪检测反应，直到反应 完全结束。混合物被浓缩至干，残留物经过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷中含有0-5％的甲 醇)后得到终产物。

¹H-NMR(Me₂SO-d₆)：8.1(1H，s)，8.05(1H，s)，7.6(1H，s)，7.2-7.4(10H，m)，6.8(4H，m)，6.6 (2H，br s)，6.3(1H，m)，5.0(1H，m)，4.0-4.2(3H，m)，3.9(1H，m)，3.8(3H，s)，3.3-3.5(2H，m)， 2.2-2.3(2H，m).

上述的产物在甲醇氨(7摩尔)的溶液中搅拌过夜。去保护的产物含有自由的氨基， 经过旋转蒸发浓缩后为白色泡沫状。

上文所述的叔丁氧羰基保护的含有二硫键的酸(295.4毫克，1毫摩尔)，HOBT (136毫克，0.89毫摩尔)和5-[3-aminoprop-1-ynyl]dA(SNK-9)(527毫克，0.89 毫摩尔)的DMF(5毫升)溶液。混合物在冰浴冷却后加入DCC(0.165毫升，1毫摩 尔)。在冰浴冷却下，反应被继续搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。化合物用二氯 甲烷(2×50毫升)稀释，用水(25毫升)和NaHCO3(两次，25毫升)的水溶液萃 取，去除溶剂后，得到粗产品。经过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷中含有0-5％的甲醇) 后得到纯净的产品。该产品用上文所说的方法被转化为相应的三磷酸和含有一个荧光基 团的衍生物。

例18.二硫键连接器的替代品

一个尿苷的衍生物的3′-ONH2被MMT集团保护，该尿苷碱基的5位附加了一个- CC-CH₂-CH₂-SS-叔丁基集团，该集团是通过钯催化耦联碘代尿苷的衍生物制备的，制备 过程参见文献(Held，H.A.，Benner，S.A.(2002)Challenging artificial genetic systems： Thymidine analogs with 5-position sulfur functionality.Nucl.Acids Res.30，3857-3869)。使 用碱催化二硫键交换的方法引入一个新的标记集团。

连接器包含一个1，2-二羟基单位是通过氧化反应裂解，最好使用高碘酸。含有二硫 键单位的连接器是通过还原反应裂解。其他的可以被裂解的连接器被认为与以上的连接器 有同样地功能。

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