一种用于鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的引物

摘要

本发明提供一种用于鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的引物，包括正向引物5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3′和反向引物5′-CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3′。利用上述引物进行PCR扩增，以纯合外源基因KMD1基因组DNA为模板进行PCR扩增没有扩增片段，以杂合外源基因KMD1基因组DNA为模板进行PCR扩增可以扩增出一条片段(209bp)，从而可以快速准确地鉴定出纯合型转基因抗虫水稻KMD1，为后续的转基因作物遗传育种奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，具体地说，涉及一种用于鉴定 纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的引物。

背景技术

标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是开 展转基因生物安全监管的基准物。开发转基因成分检测标准物质对原 材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国 内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中 定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝 对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算 样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA 看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列， 即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中 外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而， 转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围， 主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标 准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行 确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。

目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基 因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体的特 征建立特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等 三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何 种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状 态。国内外目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)外源 基因纯合/杂合状态检测方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟 稻1(KMD1)的引物。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于鉴定纯合型转基因抗虫 水稻KMD1的引物，包括：正向引物5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCG CCGTG-3′和反向引物5′CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3′。该 引物对是根据转基因克螟稻1在转基因过程中导致水稻基因组缺失的 序列(Seq ID No.1)而设计的引物，利用该对引物进行PCR扩增， 以纯合外源基因KMD1基因组DNA为模板进行PCR扩增没有扩增片 段，以杂合外源基因KMD1基因组DNA为模板进行PCR扩增可以扩增 出一条片段(209bp)。

本发明提供一种鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的方法，包 括步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利用 上述特异性引物进行PCR检测。

PCR反应条件优选为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃ 1min，30个循环；72℃5min。

PCR反应体系优选为：

本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检 测纯合型转基因抗虫水稻KMD1中的应用。

本发明根据转基因克螟稻1在转基因过程中导致水稻基因组缺失 的序列(Seq ID No.1)设计引物，通过PCR扩增，可以快速区分KMD1 纯合体和杂合体。本发明提供的转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1) 的外源基因纯合的鉴定方法，可用于转基因检测用标准物质候选物的 筛选鉴定。此外，在转基因作物遗传育种过程中，需要将转基因材料 与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学 手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，有利于缩短育种进程。

附图说明

图1为本发明通过PCR反应在水稻中的扩增结果；其中，M：100bp  DNA ladder；1：空白对照；2：外源基因纯合的KMD1；3：外源基 因杂合的KMD1。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring  Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或试剂制 造厂商所建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品。转基因抗虫水 稻KMD1和非转基因水稻明恢63可市售获得。

实施例

利用引物，其中正向引物为kmd1PD-F：

5′-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3′，反向引物为kmd1PD-R：

5′-CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3′进行PCR扩增鉴定KMD1 的外源基因纯合状态。

1.实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫水稻KMD1，非转基因水稻明恢63。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，Promega Go Taq DNA Polymerase，5×Green  GoTaq缓冲液，dNTP Mixture(2.5mM)购自Promega公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京生工生物 技术有限公司合成。

1.3实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400(Retsch)；

PCR扩增仪：AB Applied Biosystems veriti 96well Thermal Cycler (AB)；

核酸电泳仪：DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)；

DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水 仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1水稻基因组DNA的提取

水稻单粒种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，依照TianGen  Plant Genomic DNA Kit(购自天根生化科技(北京)有限公司，目录 号：DP320；包括缓冲液LP1、LP2、LP3、洗脱缓冲液TE及吸附柱CB3) 的操作手册，进行水稻总DNA的提取。

a.称取水稻新鲜叶片100mg，单株分别标记，剪刀剪碎装入2ml 离心管中，放入液氮中预冷，用低温混合球磨仪充分破碎。加入400μl 缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，涡旋振荡1min，室温放置10min。

b.加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡1min。12,000rpm 离心5min，将上清移至新的离心管中。

c.加入1.5倍体积的缓冲液LP3，充分振荡混匀15s，此时可能会出 现絮状沉淀。将所得的溶液或者絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中， 12,000rpm离心30s，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。

d.向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12,000离心30s，弃废液， 吸附柱CB3放回收集管中。重复此步骤如下：向吸附柱CB3中加入 500μl漂洗液PW，12,000离心30s，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。 14,000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

e.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位 悬空滴加50μl去离子双蒸水(pH7.0-8.5)，室温放置2-5min，12,000 离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.2DNA浓度和纯度测定

使用NaNoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA 的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至100ng/μl。

2.3PCR扩增

根据获得的外源片段插入区缺失水稻序列和缺失区旁侧水稻序 列设计引物，其中正向引物kmd1PD-F为外源片段插入时导致的缺失 水稻序列，反向引物kmd1PD-R为缺失水稻序列邻近区的水稻序列， 引物序列见表1。

表1

  引物   序列   kmd1PD-F   5’-GGTTGTTTTTATGCCTCTCGCCGTG-3’   kmd1PD-R   5’-CTTCTCTAACTGTCAAGCTAACCTG-3’

PCR扩增体系为：总体系25μl，Promega Go Taq DNA Polymerase 1.25U，5×Green GoTaq缓冲液5μl，dNTP Mixture(2.5mM)2μl，引物 各0.5μl(10uM)，水稻DNA 1μl(100ng/μl)，剩余用ddH₂O补足。

PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min， 30个循环；72℃5min。

3.实验结果

根据KMD1中缺失的水稻序列及缺失区旁侧序列设计的引物，能 够快速鉴定纯合KMD1和杂合KMD1，纯合体中未能扩增出任何片段， 杂合体中扩增出一条209bp的片段。如图1中所示，琼脂糖凝胶浓度为 2％，EB中染色20min。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。