一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因

摘要

本发明涉一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，并提供所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因的制备方法和表达载体构建及表达。所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，是由连接肽连接抗体的VL和VH基因建立，所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因具体共由729个碱基组成。由于该人单链抗体与NS3/4A蛋白具有很高的亲和力，与蛋白穿膜域融合表达可进入HCV感染细胞抑制病毒的复制水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因及其重组载体和表达产物，属于医药技术领域。 

背景技术

自1989年Choo等（Choo,Q L,Kuo,G,Weiner,A J,Overby,L R,Bradley，M.Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A,non-B viral hepatitis genome.Science,1989,244:359.）确认丙型肝炎病毒（HCV）是非甲非型乙肝炎的主要病原因子以来，抗病毒一直是HCV研究的一个重要领域。迄今仅有的治疗方案是长效干扰素与利巴韦林联合使用，但它在各亚型中总的疗效低于50％。而且这种疗法副作用大，成本高。因此，寻找特异有效的治疗药物和改进现有的治疗方法是抗HCV研究的重要方向。NS3/4A蛋白酶是NS3N末端的180aa和共作用因子NS4A蛋白组成的异源二聚体。它具有胰靡蛋白样丝氨酸蛋白酶活性，在多聚蛋白前体加工成熟中起着重要作用（Bartenschlager R,Ahlborn-Laake L,Mous J,et al.Kinetic and structural analyses of hepatitis C virus polyprotein processing.Journal of virology,1994,68(8):5045-55）。多项研究表明NS3/4A丝氨酸蛋白酶通过调控干扰素调控因子-3（IRF-3）的表达水平，从而破坏细胞内免疫通路，这提示该酶抑制剂有双重作用，即阻断病毒加工成熟和恢复细胞内免疫防御反应（Gale M Jr,Foy EM.Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus.Nature,2005,436(7053):939-45）。以NS3/4A丝氨酸蛋白酶为靶点的抑制剂联合治疗方案在临床抗病毒治疗中亦取得较好的治疗效果，然而编码这些蛋白的病毒基因变异很快，长期用药后变异病毒株很容易对治疗药物产生耐药性，将会限制这些药物的广泛应用（Reesink H.W.,Zeuzem S.,Weegink C.J.,et al.,Rapid decline ofviral RNA in hepatitis C patients treated with VX-950:a phase Ib,placebo-controlled,randomized study.Gastroenterology,2006.131(4):p.997）。因此需要对新的抗HCV治疗策略进行更广泛的探索。鉴于抗原抗体之间的共价结合具有特异、稳定等特点，如用单链抗体（ScFv）拮抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性，可能会为抗HCV感染带来新的途径。 

ScFv是一种新型的基因工程抗体，由抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段短肽（Linker）连接而成，其相对分子质量小，结构简单，免疫原性低，但却较好地保持了亲和力。ScFv的基因通过载体携带进入靶细胞后表达抗体蛋白，或者 与蛋白穿膜结构域（PTD）重组并表达出融合抗体蛋白，进入细胞内与相应的目标分子结合，从而阻止这些分子生物学功能的发挥，达到使目标分子功能失活的目的。这种在细胞内的抗体通过抗原抗体特异结合，调节靶分子构型转换与细胞内定位影响其生物功能的发挥，即可将病毒复制及装配过程中的关键分子选择性的“敲除”，是目前一种新的抗感染治疗方法（Lobato MN,et al,Intracellular antibodies as specific reagents for functional ablation:future therapeutic molecules.Curr Mol Med.4(5):519-28（2004）.Hope-Stone,L.Sena,J.Martin,K.L.Adamson,A.Robbins,M.Stocks,Intrabodies as drug discovery tools and therapeutics,Curr Opin Chem Biol(2005)。譬如，Tewari等将HIV p17的ScFv编码基因转染HIV感染细胞中，结果发现产生具有感染能力的HIV病毒颗粒的数量显著降低（Tewari D,et al.cDNA encoding a single-chain antibody to HIV p17with cytoplasmic or nuclear retention signals inhibits HIV-1replication.J Immunol.161(5):2642-7（1998））。Herschhorn等利用噬菌体抗体库技术得到逆转录酶（RT）的ScFv基因，将其转染HIV感染细胞后，产生的单链抗体可以结合RT，并且能够抑制HIV RNA的复制（Herschhorn A,et al Recombinant human antibodies against the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type-1.Biochim Biophys Acta.1648(1-2):154-63（2003）。Jendreyko（2005）。由此可见，ScFv在细胞内可以阻断或调节靶分子的生物功能达到治疗的目的。 

人源性ScFv免疫源性小，被认为是最为安全的一种形式。核糖体展示抗体库技术在制备ScFv，尤其是人源抗体方面有着巨大的优势：整个过程均在细胞外进行，不需要转化细胞，因此可获得大容量库（10¹¹–10¹³）；避免了细胞内、外操作的频繁转换，大大缩短筛选周期，简化了操作；可以调整筛选压力，如添加竞争性抗原或筛选延时等从而改善抗体识别表位及稳定性、亲和力等特性；与体外突变方法的偶联，如结合定点突变技术、DNA shuffling等，可短时间内实现单链抗体的体外亲和力成熟。该技术制备ScFv的主要流程：首先构建ScFv（V_H-Linker-V_L）的cDNA文库；建立其核糖体展示模板；该模板在体外转录与翻译系统下进行转录和翻译，形成ScFv-核糖体-mRNA三聚体；将目标蛋白特异性的配基固相化，筛选含有ScFv的核糖体三聚体；对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使ScFv及其编码的基因序列得到富集和分离。核糖体展示技术具有上述明显优势，因此备受关注和重视，例如英国剑桥抗体技术工程中心已将该技术作为核心技术平台开发完全人源性的治 疗抗体（He M,Cooley N,Production of human single-chain antibodies by ribosome display.Methods Mol Biol.248:177-89（2004；Groves MA,et al，Applications of ribosome display to antibody drug discovery.Expert Opin Biol Ther.5(1):125-35（2005）。 

基于上述理论和技术的发展，我们以在HCV蛋白前体加工成熟起着关键作用的NS3/4A丝氨酸蛋白酶为靶标，从HCV阳性的患者PBLs中提取mRNA构建ScFv基因文库，利用完全体外筛选、高库容的核糖体展示库技术来制备针对NS3/4A丝氨酸蛋白酶的人源性ScFv，将筛选到的ScFv基因构建表达载体并进行表达和初步鉴定。这对于利用人ScFv作为治疗抗体进行抗HCV研究具有重要的理论和实践意义，同时为制备人源基因工程抗体开辟新的途径。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，并提供所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因的制备方法和表达载体构建及表达。 

本发明的技术方案是：一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，其特征是：所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因是由连接肽连接抗体的VL和VH基因组成。 

所述连接肽连接抗体的VL和VH基因共由729个碱基组成， 

No1：其核苷酸序列： 

ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACT 

No2：其氨基酸序列： 

MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT* 

*为终止码。 

所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因的制备方法包括如下步骤：步骤1）制备核糖展示单链抗体文库； 

步骤2）克隆抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因； 

步骤3）构建蛋白穿膜域PTD与抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因融合表达载体； 

步骤4）制备PTD-NS3/4A scFv的蛋白表达； 

步骤5）PTD-NS3/4A scFv蛋白阻断HCV复制的效应评价。 

所述制备核糖展示单链抗体文库是用分离的HCV阳性患者外周血淋巴细胞提取mRNA，合成cDNA并扩增重链和轻链可变区基因，构建核糖体展示单链抗体文库。 

所述克隆抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因是将步骤1）获得的核糖体展示单链抗体库制备ScFv-核糖体-mRNA复合物，以表达纯化的NS3/4A蛋白固相化于磁珠上进行筛选，经过3轮筛选和富集，最后一轮DNA转入到噬菌体pHEN1载体并转化HB2151，诱导表达后取上清进行ELISA试验，确定1个结合活性最强的单链抗体。 

所述构建蛋白穿膜域PTD与抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因融合表达载体是将步骤2）获得单链抗体基因克隆入pET-PTD载体，转化大肠杆菌BL21，获得重组表达载体pET-PTD-NS3/4A-scFv。 

所述制备PTD-NS3/4A scFv的蛋白表达是用LB培养液培养步骤3）重组表达载体pET-PTD-NS3/4A-scFv，经IPTG诱导8小时，SDS-PAGE显示表达率可达25%以上。 

所述PTD-NS3/4A scFv蛋白阻断HCV复制的效应评价是将步骤4）制备的PTD-NS3/4A scFv蛋白按照不同剂量加入HCV感染细胞Huh7.5JFH-1；48h后收集细胞，提取RNA后进行Real-time PCR定量检测HCV RNA；从而观察PTD-NS3/4A scFv蛋白在HCV感染细胞内的抑制效应 

本发明的有益效果是：本发明提供抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体是具有潜在抑制HCV病毒复制的单链抗体。抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因 是由一条连接肽将VL和VH基因连在一起所形成的单一肽链，通过正确折叠们两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的片段，抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体分子量小，而且与NS3/4A蛋白具有较强的亲和力，与蛋白穿膜域融合后进入HCV感染细胞内抑制NS3/4A蛋白酶活性，从而降低病毒的复制水平。 

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步说明，但不作为本发明的限定。 

附图说明

图1为抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因的表达载体示意图； 

图2为PTD-NS3/4A-scFv蛋白表达的SDS-PAGE表达图； 

其中，M:Marker;1:未诱导的BL21菌；2:IPTG诱导的BL21全菌；3:诱导菌经超声波处理过的上清；4:诱导菌经超声波处理过的沉淀。箭头所指的为NS3/4A蛋白的单链抗体表达条带； 

图3为PTD-NS3/4A scFv蛋白阻断HCV复制效应的结果； 

可以看出，随着PTD-NS3/4A scFv蛋白浓度的增加，与PBS相比，HCV感染细胞Huh7.5-JFH-1中病毒RNA拷贝数呈减少趋势，使HCV复制水平可降低10³数量级。 

具体实施方式

1.核糖展示单链抗体文库的构建 

抽取HCV阳性志愿者外周血50mL，每毫升血加入5个单位肝素。用等量PBS稀释外周血，并与淋巴细胞分离液以1：1的比例混合。2500rpm，离心20min，吸取淋巴细胞层。按每5×10⁶个淋巴细胞加入1ml TRIzol的比例裂解淋巴细胞，提取总RNA。利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计和甲醛变性电泳检测提取RNA的浓度和纯度。以Oligo(dT)₁₈为引物，利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit经逆转录得到cDNA第一链。 

以一段HuIgM基因做为重链与轻链之间的连接肽序列，设计并合成一组特异性引物。以cDNA第一条链为模板，分别扩增9种VH-linker基因、6种Vκ基因、11种Vλ基因以及作为核糖体展示模板间隔区的Cκ基因。反应条件为94℃变性5min，然后进人循环，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。切胶回收各种PCR产物，并用紫外分光光度计测定OD₂₈₀值。 

将9种VH-linker PCR纯化产物等量混合、6种VκPCR纯化产物等量混合、11种VλPCR纯化产物等量混合。利用引物上设计的互补序列，采用带有T7启动子和Kozak序列的T7Ab/back引物进行SOE-PCR，将单链抗体基因片段进行拼接，构建起完整的核 糖体展示模板。 

2.NS3/4A蛋白抗体可变区基因的克隆 

核糖体展示模板在T7RNA聚合酶催化下进行体外转录，转录产物经兔网织红细胞系统翻译，获得ScFv-核糖体-mRNA，即单链抗体文库，行SDS-PAGE进行鉴定。将NS3/4A蛋白固相化到磁珠上，对上述获得ScFv-核糖体-mRNA复合物经过3轮筛选和富集。取最后一次富集后的单链抗体文库DNA转入到噬菌体pHEN1载体并转化HB2151，诱导表达后取上清进行ELISA试验，其中有1个单链抗体结合活性较强。将其送到公司测序后，根据单链抗体的测序结果推算氨基酸序列，运用V-base软件分析框架区和CDR区，显示具有完整的抗体互补决定区CDR1，CDR2，CDR3以及抗体骨架区FR1，FR2，FR3和FR4。 

3.蛋白穿膜结构域PTD与抗NS3/4A蛋白的单链抗体基因融合表达载体的构建 

将上述单链抗体基因和表达载体pET-PTD经NdeI和BamHI双切后行琼脂糖电泳，纯化回收后按照摩尔浓度1:3比例混合表达scFv基因和表达载体，用T4连接酶进行连接，转化感受态大肠杆菌BL21，获得重组表达载体pET-PTD-NS3/4A-scFv。（见图1） 

4.PTD-NS3/4A-scFv蛋白表达 

将重组表达载体pET16b-NS3/4A-scFv转化大肠杆菌表达菌株BL21感受态细胞，铺平板后置于37℃孵箱中。次日挑取单个菌落于5mL LB培养基中，37℃振摇过夜。按1:50将过夜菌加入5mL LB培养基中37℃振摇3~4小时h后，测定OD值。约0.4~0.6时加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续振摇4~6小时后。收集1mL菌液沉淀，加入100裂解缓冲液在冰浴上超声破碎，离心后分别取上清和沉淀。经上样Buffer处理后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染液染1小时。脱色液脱色至背景清晰。经IPTG诱导8小时，SDS-PAGE显示表达率可达25%以上（见图2）。 

5.PTD-NS3/4A scFv蛋白阻断HCV复制的效应评价 

将PTD-NS3/4A scFv蛋白按照0.5、1、2、4、8μg/ml的剂量分别加入HCV感染细胞Huh7.5JFH-1。48h后收集细胞，提取RNA后进行Real-time PCR定量检测HCV RNA。结果显示，与PBS对照组相比，随着PTD-scFvPTD-NS3/4A scFv剂量的增加，JFH-1Huh7.5细胞中病毒RNA拷贝数呈减少趋势，使HCV复制水平可降低3个数量 级（见图3）。 

由以上可制得本发明这种一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因及其重组载体和表达产物。 

所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因是由连接肽连接抗体的VL和VH基因组成；所述连接肽连接抗体的VL和VH基因是由729个碱基组成； 

No1：其核苷酸序列： 

ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACT 

No2：其氨基酸序列： 

MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT* 

*为终止码。 

所述一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，并通过构建表达载体进行表达。 

本发明的特点是一种抗HCV NS3/4A蛋白的人源性单链抗体基因，是由连接肽连接抗体的VL和VH基因组成。由于该人单链抗体与NS3/4A蛋白具有很高的亲和力，与蛋白穿膜域PTD融合后可进入HCV感染细胞内抑制NS3/4A蛋白酶活性，从而降 低病毒的复制水平。 

本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。 

序列表： 

No1：其核苷酸序列： 

ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACT 

No2：其氨基酸序列： 

MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT* 

*为终止码。