高效降解高分子量多环芳烃的细菌分离方法及其应用

摘要

本发明涉及高分子量多环芳烃类污染土壤的生物修复。具体提供了一种多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的方法及其应用，该方法利用PCR-DGGE技术，迅速确定土壤样品中污染物降解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度的控制（40-60%），持久保持高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术和环境生物技术领域，具体涉及高分子量多环芳烃类 污染土壤的生物修复。

背景技术

多环芳烃（PAHs）是指两个或两个以上苯环以稠环和非稠环形式相连接的 有机化合物。PAHs在环境中普遍存在，其极低的水溶性、稳定的环状结构是造 成这类化合物持久性的主要原因。人类及动物癌症病变有70%-90%是环境中化学 物质引起的，而PAHs则是环境致癌化学物质中最大的一类。由于这类化合物具 有致癌、致畸和致突变的特性，对人类健康和生态环境均具有潜在的危险而引起 世界各国的普遍重视。

研究发现自然界中多种微生物能够降解多环芳烃，但因高分子量的多环芳烃 性质稳定，强疏水性物质，易被土壤颗粒吸附或被其它作用固定，隔断其与专性 微生物和酶的直接接触，从而影响其降解速率。天然的水体和土壤是微生物的大 本营，存在着数量巨大的各种各样微生物，在遭受有毒有害的有机物污染后，可 出现一个天然的驯化选择过程，使适合的微生物不断增长繁殖、数量不断增多。 因此，微生物降解被认为是污染物在自然界中降解的主要途径，应用现代生物技 术进行环境污染治理和监测是解决当今社会环境污染问题的重要途径。从受污染 的地区土壤筛选分离出PAHs的降解优势菌株，再将其投回到污染环境，或者寻 求适宜高效降解PAHs菌群生长的工艺条件，是进行修复多环芳烃污染土壤的关 键环节。

近年来对降解PAHs的微生物进行了广泛的研究，常见的微生物有红球菌属 (Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽胞杆菌 属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobac-terium)、气单胞菌属(Aeromonas)、拜叶林克氏 菌属(Beijernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、微球菌 属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、白腐真菌(White rot fungi)和弧菌属 (VIbrio)等。经国家知识产权局专利检索系统检索，在“一种多环芳烃降解菌剂的 制备方法（公开号CN 101423807A）”中，利用新型菌株Mycobacterium sp.SN12， 经过7天，对芘和菲的降解率分别为91.5%和95.2%。在“一种用于多环芳烃污 染土壤修复的固定化细菌制备方法（公开号CN 101177679A）”中，42天后微球 菌对芘和苯并芘的降解率分别为30.7%和25.7%，动胶杆菌对芘和苯并芘的降解 率分别为31.4%和21.9%。在“一种可高效降解苯并[a]芘的不动杆菌及其应用 （公开号CN 102174445A）”中，经过20天后在苯并[a]芘浓度40mg/L的无机盐 培养基中，37℃振荡，菌株对苯并[a]芘的降解率达28.66%，同样条件下，加入 适量蔗糖或葡萄糖，可提高该菌对苯并[a]芘的降解率达48.87%。在“一种多环 芳烃降解菌及其应用（公开号CN 1844361A）”中，鞘氨醇单胞菌属菌株GY2B 对菲的降解速率在36h后为91.7%-97.8%。“一种产生生物乳化剂和降解多环芳 烃的赤红球菌Em及用途（公开号CN 1519312）”中，该菌剂对蒽、菲、芘均有 降解效果。综上所述，在针对多环芳烃降解相关的已公开的专利信息中，大部分 都是围绕单一菌种对PAHs的降解效果，而且基本都是基于实验室条件下液体培 养基中的降解效果验证，其中有一部分菌剂经在污染土壤中的处理效果并不是很 理想。

事实上，环境中通常以多种组分的污染物同时存在，呈现为复合污染现象。 在实际场地修复中，单纯通过投加通过实验室优化条件分离驯化的单体微生物， 难以让其在恶劣的污染环境中定植，并成为该污染环境中的主要菌群而发挥其高 效降解效果。研究表明，混合菌群作为一种多菌体共存的生物群体，在其生长过 程中能分解有机物，同时依靠各种微生物之间相互共生增殖及协同代谢作用降解 环境中的有机物，并能激活其他具有净化功能的微生物，从而形成复杂而稳定的 微生态系统。在“一种多环芳烃高效降解菌系及其应用（公开号CN101196810）” 中，7天后GP3混合菌系对芘的降解率为75.7%-99.5%。在“去除多环芳烃和/ 或降解多环芳烃的菌剂及其应用”（公开号CN101851582Ａ）专利中，公布了红 球菌、微杆菌、苍白杆菌和博德特氏菌组成的菌剂，4周后，添加该菌剂的土壤 中16种多环芳烃的去除率比未添加该菌剂的土壤中的平均提高了30％，其中 6种低环（二／三环）多环芳烃的去除率提高了26％，10种中高环（四环及 以上）多环芳烃的去除率平均提高了32％，说明复合菌在混合污染场地中的应 用前景。

综上可以看出，在针对多环芳烃降解相关的已公开的现有技术中 ，大部分都是围绕单一菌种对PAHs的降解效果，而且基本都是基于实验室条件 下液体培养基中的降解效果验证，其中有一部分菌剂的降解效果是在低浓度多 环芳烃污染土壤中进行的。针对高浓度污染土壤，特别是四环及以上多环芳烃 高污染老化土壤的处理效果较好的菌剂相关技术，报道甚少。

本发明是通过PCR-DGGE技术，分析多环芳烃污染土壤中投加菌剂后，其 微生态环境中微生物多样性的变化与污染物降解相关性，跟踪添加菌剂在环境 中的定植来确定菌剂的功效。

发明内容

本发明提供了一种多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的 方法及其应用，该方法是利用PCR-DGGE技术，迅速确定土壤样品中污染物降 解相关优势菌群及其分离纯化，优化组合，扩大培养，重新投放到长期污染的含 有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素 及其湿度的控制（40-60%），持久保持高效降解菌群的优势。该方法降解效率高， 特别是针对高分子量多环芳烃污染的土壤。

本发明同时提供了一种跟踪高效降解菌在环境中的定植的技术。

本发明提供的一种多环芳烃降解细菌复合体的分离、筛选方法包括如下步 骤：

1）培养基中加入PAHs的方法：在灭菌三角瓶中加入不同浓度PAHs的丙酮 溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，加入下述细菌培养基I，使芘终浓度 为终浓度为200mg/L，苯并芘总浓度为10mg/L。

细菌培养基I：硫酸铵2.5g，硫酸亚铁0.28mg，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二 氢钾1.36g，硫酸镁0.25g，氯化钙10.7mg，氯化钠0.5g，氯化铁0.004g，1.0 mL微量金属液A、1mL维生素复合溶液，加水至1000mL并将pH控制在7.2-7.4， 摇匀后作为液体培养基备用，若为固体培养基，则加入1.5%琼脂粉。其中微量金 属液A的组成为：CoCl₂·6H₂035mg,CuCl₂ 0.20mg,H₃BO₃ 6.0mg,MnCl₂·4H₂O 25 mg,Na₂MoO₄·2H₂O 3.0mg,NiCl₂·2H₂O 2.0mg,ZnCl₂2.5mg，加水至1000mL；维 生素复合溶液的组成为：维生素B61.0mg，维生素C 1.5mg，加水至1000mL。

2）在150ml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，加入10g新鲜高浓度PAHs污 染土壤，25-30℃，90rpm条件下培养5天后，取10ml分别接种至上述含多环芳 烃的100ml无机盐培养基中，同样条件下培养10天，测定污染物降解效果。

3）确定高效降解功能的目标菌群：通过PCR-DGGE方法，分析上述两种污 染物富集的样品中优势菌群，以两种污染物为唯一碳源富集培养液中都存在的菌 株确定为目标菌株。取1.5ml细菌培养液提取总DNA，选取细菌16S rDNA V3 区进行PCR扩增。制备1mm厚10％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为 30％-70％(100％变性剂组成为7mol/L尿素和40％去离子甲酰胺)。加样后，置 于1×TAE缓冲液中45V电泳16h。电泳完毕，取下凝胶，EB上染色。DGGE 凝胶经EB染色后，在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下。将 目的条带置于30μl灭菌超纯水中，-20℃放置过夜。PCR前65℃水浴溶解10min， 取DNA浸出液作为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条 带的正确位置。然后PCR扩增纯化，完成测序。序列信息输入NCBI数据库进行 BLAST分析。

4）分离纯化目标菌株：

A、通过划线和稀释平铺两种接种的方式，分别接种于上述细菌培养基I和 II制成的固体培养基平板上，30℃恒温培养箱培养至菌落生长，16S rRNA鉴定。 细菌培养基II：氯化钠1g，酵母浸出粉0.5g，蛋白胨1g，蒸馏水1L，1.5%琼脂 粉。

B、细菌的鉴定：根据其形态特征及其16S rRNA基因序列鉴定。

2、降解效果验证及菌剂的优化

实验设置2个方案，目的是根据不同污染物降解效果，确定高效降解细菌的 最佳组合。设置不加菌悬液的作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。

方案一：苯并芘和芘作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加 入培养好的单一细菌，室温90rpm条件下，避光摇床培养2，4，6，8，10天（芘 为唯一碳源）或5，10，15，20，30，40，50，60天（苯并芘为唯一碳源），设 置不加菌悬液+污染物作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。

方案二：苯并芘和芘作为唯一的碳源，再加入上述细菌培养基I，使污染物 终浓度分别为10mg/L和200mg/L。依据上述3）通过PCR-DGGE分析结果，将 上述4）分离纯化的优势菌株进行组合，室温90rpm条件下，避光摇床培养2，4， 6，8，10天（芘为唯一碳源）或5，10，15，20，30，40，50，60天（苯并芘为 唯一碳源），设置不加菌悬液+污染物作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效 果。

3、菌液的制备

上述分离纯化的各菌株利用下述培养基接种，室温90rpm条件下，摇床培养 24-48小时得到，细菌的数量保持在5×10⁸～5×10¹⁰CFU/ml之间。所用培养基为 每20L上述细菌培养基I溶液中，混合10g-20g葡萄糖，乙酸钠3-15g。

4、高浓度多环芳烃污染土壤中投加高效降解菌的菌跟踪及降解效果验证

1）将上述3中获得的菌液等量比例混合后，按照10ml/100g污染土壤的 量，投放到长期污染的含有高分量多环芳烃污染土壤中。常温下，通过定期投加 适量的不同配比的上述微量元素A，保持环境中的40-60%的水分含量。间隔10 天，定期检测土壤中污染物浓度的变化。

2）高效降解菌的跟踪监测。

高浓度污染土壤中添加上述菌剂后，依照不同处理时间，分别称取0．2 5ｇ土壤样品，利用″ｐｏｗｅｒｓｏｉｌＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎＫｉ ｔ″（Ｍｏｂｉｏ公司），提取基因组。选取细菌16S rDNA V3区进行PCR扩增。 制备1mm厚10％(w／v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30％一70％(100％ 变性剂组成为7mol/L尿素和40％去离子甲酰胺)。加样后，置于1×TAE缓冲液 中45V电泳16h。电泳完毕，取下凝胶，EB上染色。DGGE凝胶经EB染色后， 在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下。将目的条带置于30μl 灭菌超纯水中，-20℃放置过夜。PCR前65℃水浴溶解10min，取DNA浸出液作 为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置。 然后PCR扩增纯化，完成测序。序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析。

5、本发明所提供的三种高效降解菌来源于上海某工业园区重度污染土壤， 经过人工富集培养、分离纯化获得。经16S rDNA鉴定分别为分枝杆菌属 （Mycobacterium sp.）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、微杆菌属（Microbacterium  sp.）。

本发明的高浓度高环芳烃降解细菌复合体的分离筛选方法，涉及一种细菌互 营复合体的分离筛选方法。它解决了现有多环芳烃类降解菌剂降解范围较单一， 单一菌种难以在复合污染环境中与土著菌间竞争的难题。本发明通过优势菌种组 合，提供了一种能高效广谱降解多环芳烃的复合细菌体。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明利用PCR-DGGE技术，确定污染物降解相关优势菌群及其分离纯 化，分别扩大培养24-48hr，菌数达到5×10⁸～5×10¹⁰CFU/ml。各菌按照相同的 比例混合后，以10ml/100g土壤的量，投放到长期污染的含有高浓度高分量多环 芳烃污染土壤中，通过定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度控制 （40-60%），持久保持所投加高效降解菌群的优势。该方法降解效率高，特别是 针对高分子量多环芳烃污染的土壤和水体。

2、本发明提供了一种跟踪高效降解菌在环境中的定植技术。

3、本发明还提供了一种营养元素的组合，能持久保持所投加高效降解菌群 的优势。

附图说明

图1：不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳图， 样品1：芘（200ppm）+细菌培养基I+菌悬液A；样品2：苯并芘（10ppm）+细菌 培养基I+菌悬液B。

图2：三种单菌分别对芘的降解效果（芘初始浓度为200mg/L）。

图3：三种单菌分别对苯并芘的降解效果（苯并芘初始浓度为10mg/L）。

图4：三种菌混合对芘的降解效果（芘初始浓度为200mg/L）。

图5：三种混合菌对苯并芘的降解效果（苯并芘初始浓度为10mg/L）。

图6：污染土壤投加菌后不同时间处理样品16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳 图，投加菌6天后开始采集样品，时间间隔分别为6天、26天、46天、66天， 1-8泳道分别表示：1：加入蒸馏水调整湿度；2：原始土壤，未加任何处理；3-5： 微量元素液调整湿度；6-8：细菌培养基I+1%葡萄糖调整湿度。A、B、C表示所 投加的菌，分别是：A：投加的Acinetobacter sp.；B：投加的Microbacterium  sp.；C：Mycobacterium sp.；D：土著菌Xanthomonas sp.。

具体实施方式

实施例1:

本实施例提供一种筛选高效多环芳烃降解细菌复合体的分离方法，该方法 具体如下：

1、在100ml三角瓶中加入50ml灭菌蒸馏水，10g新鲜高浓度PAHs污染 土壤，25-30℃，90rpm条件下培养。

2、在两个新的灭菌三角瓶中各自加入芘和苯并芘的丙酮溶液，超净工作 台内使丙酮溶液挥发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为 200mg/L，苯并芘终浓度为10mg/L。接入1%体积含量的上述1中培养的细 菌，25-30℃，90rpm条件下避光摇床培养10天，重复操作步骤2至步骤1 细菌富集培养液对芘和苯并芘降解速率达到稳定为止，得菌悬液A和B。

3、分别步骤2中获得的菌悬液A和B各取1ml培养液均匀涂布于10mg/L 苯并芘[a]和200mg/L芘的细菌培养基I和1%葡萄糖的细菌培养基I上。

4、30℃，培养2-4天，至菌落出现。从平板上挑取特征不同、生长旺盛 且稳定的菌落，在含1%葡萄糖和1%乙酸钠的细菌培养基I固体平板上反复 划线分离以获得纯菌种，16s rRNA鉴定。

5、取菌悬液A和B各1ml，5000rpm转速下，离心3分钟，倒掉上清液， 再加入500ul灭菌蒸馏水，混悬，5000rpm转速下离心3分钟，倒掉上清液， 加入200ul灭菌蒸馏水，100℃煮沸5分钟，冷却。10000rpm转速下离心5 分钟，取上清液作为下一步16s rRNAV3区扩增的模板。

6、分别以上述1和2步骤获取的菌悬液煮沸液为模板，进行V3区PCR 扩增，将获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶 成像图谱分析（图1）。

7、将步骤6中得到的含芘和苯并芘[a]不同样品的变性梯度凝胶的条带比 对，以两个样品中都含有的条带和各自优势的条带作为目的片断进行回收、 纯化及测序，将所得的序列片断在GenBank数据库进行同源性分析和检测。

8、综合上述步骤4和步骤7的结果，优化菌群，确定该污染土壤中主要 优势降解菌株。

9、通过上述过程，筛选得到的菌株为分枝杆菌（Mycobacterium sp.）不 动杆菌（Acinetobacter sp.）、微杆菌（Microbacterium sp.）。

表1通过上述步骤1和步骤2富集，不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNA V3区 PCR-DGGE电泳图谱

（图1）对应单个条带的序列比对分析

  DGGE条带   NCBI注册号   同源菌名   相似度%   4，9   FJ613367.1   Mycobacterium sp.E5   98   1，2，5   JQ897314.1   Microbacterium sp.H6.73   100

  3，6，7   HE979853.1   Acinetobacter sp.KK-9-2  99   8   GU398157.1   Xanthomonas sp.  100

从表1中可以看出，上述步骤1和步骤2富集液分别在以芘和苯并芘为唯 一碳源的培养过程中，主要有4个优势菌株，分别是Mycobacterium sp.， Microbacterium sp.，Acinetobacter sp.和Xanthomonas sp.，其中在两种污 染物中都存在的菌株分别为Mycobacterium sp.，Microbacterium sp.和 Acinetobacter sp.三种菌。

实施例2：高效降解菌对芘和苯并芘在细菌培养基I中的降解性能

1.取灭菌三角瓶中加入含芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完 全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为200mg/L。分别接入上述步 骤9中获得的三株菌，室温90rpm条件下，避光摇床培养2，4，6，8，10天， 设置3个重复实验和不接菌的细菌培养基I+200mg/L芘作为对照，采用GC-MS 测定单一菌株的降解芘的效果（图2）。

结果：由图2可以看出，分枝杆菌具有较强分解芘的能力，在第10天对终 浓度200mg/L的芘溶液降解率为77.1%，而单一微杆菌和不动杆菌对芘的分解 能力很弱，在第10天降解率分别为18.1%和13.2%。

2.取灭菌三角瓶中加入含苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶 10mg/L。分别接入上述步骤9中获得的三株菌，室温90rpm条件下，避光摇 床培养5，10，15，20，30，40，50，60天，设置3个重复实验和不接菌的细 菌培养基I+10mg/L苯并芘作为对照，采用GC-MS测定单一菌株的降解苯并 芘的效果。

由图3可以看出，经过60天实验，单一分枝杆菌对苯并芘的降解率为47.3%， 而单一微杆菌和不动杆菌对芘的分解能力很弱，或几乎没有影响。

3.取灭菌三角瓶中加入含芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥 发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度芘为200mg/L。同时接入上 述步骤9中获得的三株菌，室温90rpm条件下，避光摇床培养2，4，6，8， 10天，设置3个重复实验和不接菌的细菌培养基I+200mg/L芘作为对照，采用 GC-MS测定三种菌协同作用下降解芘的效果。

由图3可以看出，单一分枝杆菌具有较强分解芘的能力，在第10天对终浓度 200mg/L的芘溶液降解率为77.1%，而三种混菌（分枝杆菌：微杆菌：不动杆菌 =2；1：1）同时作用，则进一步强化了降解能力，在第10天检测到混菌对芘的 降解率为93.2%（图4），因此可以得出，微杆菌和不动杆菌具有协同强化作用， 混菌的应用效果要优于单一分枝杆菌。

4.取灭菌三角瓶中加入含苯并芘的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥

发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度苯并芘为10mg/L。同时 接入上述步骤9中获得的三株菌，室温90rpm条件下，避光摇床培养5，10，15， 20，30，40，50，60天，设置3个重复实验和不接菌的细菌培养基I+10mg/L苯 并芘作为对照，采用GC-MS测定三种菌协同作用下降解苯并芘的效果。

结果显示，经过60天实验，单一分枝杆菌对苯并芘的降解率为47.3%，而三 种混菌对苯并芘的降解率为67.5%，且持续呈现下降趋势。另外还可发现，单一 分枝杆菌在经过30天实验以后，降解趋势和降解速率明显减慢。在 Microbacterium sp.和Acinetobacter sp.两种菌虽然在很多专利中报道对多环芳 烃类化和物有降解效果，但在本次土壤样品中分离筛选到的两种菌，在单菌条 件下对芘和苯并芘降解效果不明显。

实施例3：长期污染的含有高浓度高分量多环芳烃污染土壤中的降解效果及 其投加菌的跟踪检测

1、实验设计：

实验分为4组，每组500g土壤样品。分别是样品1：加入蒸馏水；样品2：原始 土壤，未加任何处理；样品3：微量元素液+三种菌；样品4：细菌培养基I+1%葡 萄糖+三种菌。

2、细菌培养

将实例1第9步骤中的三种菌纯化的各菌株，分别为Acinetobacter sp.、 Microbacterium sp.和Mycobacterium sp.，利用下述培养基接种，室温90rpm 条件下，摇床培养24-48小时得到5×10⁸～5×10¹⁰CFU/ml浓度的菌液。培养基组 成：每20L上述细菌培养基I添加10g-20g葡萄糖，乙酸钠3-15g。

3、高效降解菌的投加

投加菌的量为10ml/100g土壤，每间隔10天，定期检测土壤中污染物浓度的变 化，实验周期为60天。

1、湿度和温度控制

分别配制上述细菌培养基I和微量元素A溶液作为备用。通过定期投加该两种 溶液和搅拌，保持土壤环境中的湿度在40-60%之间，常温放置60天。

2、实验用土壤中PAHs的浓度变化，见下表2和3。

表24组处理样品经过60天后，土壤中三环以上总PAHs和总PAHs的变化情况

注:样品2中三环以上总PAHs浓度在每次检测中都有上下浮动的现象，判定为没有效果。

表34组处理土壤中芘和苯并芘的变化情况

注:样品2中芘和苯并芘浓度在每次检测中都有上下浮动的现象，判定为没有效果。

3、投加高效菌的跟踪

由图6看出，通过PCR-DGGE的方法，很好的追踪到了所投加的微生物， 显示出所投加菌具有较强的定植能力。PCR-DGGE验证，该条件下所投加高效 降解菌能够持久的生长优势。

从表2中看出，利用蒸馏水来控制湿度的样品1处理，同样条件下处理，PAHs 浓度基本没有变化，表明单一蒸馏水对PAHs的降解没有促进作用。而未加任处 理的样品2，PAHs浓度却出现上下浮动的现象，这可能与在实验过程中搅拌与否 相关。实验过程中为了控制湿度，定期加入了营养剂或蒸馏水，同时进行适当 的搅拌。添加菌后利用微量元素溶液来控制湿度的样品3经过60天的处理，总 PAHs浓度由最初的5770.718mg/kg下降为1596.85mg/kg，降解率为72%，特别是3 环以上的高分子量PAHs降解率达到了73.2%，其中芘和苯并芘的降解率分别为 66.8%和75.8%（表3）。添加菌后利用细菌培养基I+1%葡萄糖溶液来控制湿度的 样品4经过60天处理，总PAHs浓度由最初的3033.362mg/kg下降为 1716.431mg/kg，降解率为45.2%，3环以上高分子量PAHs降解率为43.4%，其中 芘和苯并芘的降解率分别为36.5%和54.9%（表3）。由此可见，在投加相同的菌 剂的条件下，不同营养元素控制湿度，两者针对PAHs的降解效果差异性很大， 样品3和样品4相比，总PAHs降解率经过60天相差28.6%。同时，我们也发现，本 发明提供的多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复合体的方法及其应 用，定期投加适量的不同配比的营养元素及其湿度的控制（40-60%），能够持久 保持高效降解菌群的优势，并能激活其他具有净化功能的微生物，从而形成复 杂而稳定的微生态系统（图6）。

本发明在实例1中分离筛选高效降解菌复合体主要是针对芘和苯并芘的高 效降解，因此在实例3中我们可以看出，样品3处理和样品4处理中整体高分 子量PAHs降解效果非常显著。该方法降解效率高，特别是针对高分子量多环芳 烃污染的土壤。本发明提供的多环芳烃类污染场地中分离筛选高效降解细菌复 合体的方法及其应用，解决了现有多环芳烃类降解菌剂降解范围较单一，单一 菌种难以在复合污染环境中与土著菌间竞争的难题，能够在实际的多环芳烃污 染土壤修复中发挥重要的作用。

以上实施例，仅以说明为目的，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。