具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株及其应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，公开了一种具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株及其应用。该具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株的名称为波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis）GIGAN1，于2012年11月8日保藏于位于中国湖北省武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012451。该菌株降解环境中苯甲硫醚的能力可达96.2%，可将其应用于降解环境中的苯甲硫醚，达到环境修复的目的。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有降解苯甲硫醚能力的波茨 坦短芽孢杆菌株及其应用。

背景技术

苯甲硫醚（thioanisole，MPS），又称茴香硫醚，多作为化工原料，常用于合 成抗生素、抗溃疡等医用药物以及杀虫剂、杀菌剂等农用药物。由于其具有较 低的嗅阈值，因此属于恶臭化合物。该类物质的污染对周边环境居住及工作人 群的心理及感官产生影响，使人产生不愉快，烦躁和厌恶的情绪，降低工作效 率和生活的质量；同时也会对身体健康带来严重危害，如危害呼吸系统、消化 系统、血液循环系统以及神经系统等，影响机体的代谢活动。曾有文献报导纸 浆废水产生的臭气中检测到较高浓度的苯甲硫醚（0.5μg/l）。因此，苯甲硫醚由 于其特殊的理化性质，近年来常被选择作为臭气目标底物成为降解脱臭的研究 热点。常用的消除苯甲硫醚臭气的有效方法是微生物降解，因此筛选高效低成 本苯甲硫醚降解细菌是其污染消除的研究重点。虽然目前已经有很多关于高效 芽孢杆菌及其在环境毒害有机物降解中的报导，但是目前有关高效芽孢杆菌在 有机恶臭废气净化方面的研究还是比较少见。波茨坦短芽孢杆菌最早是在胜利 油田中发现并用于降解石油中烃类化合物以提高石油产率的细菌。菌体细胞一 般呈中等长度杆状，排列不整齐，革兰氏染色呈阴性。在固体培养基表面，菌 体形成半透明的浅黄色菌落，菌落光滑，边缘整齐。目前还没有发现有关波茨 坦短芽孢杆菌降解苯甲硫醚方面的报导及专利。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有降 解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株。

本发明的另一目的在于提供所述的具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢 杆菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有降解苯甲硫醚能力的波茨 坦短芽孢杆菌株，命名为波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis）GIGAN1， 于2012年11月8日保藏于位于中国湖北省武汉武汉大学的中国典型培养物 保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2012451；

所述的具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株具有如下的形态和生 理生化特性：

该波茨坦短芽孢杆菌菌体的形态特性如下：

a．采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的波茨坦短 芽孢杆菌株的细胞染色为革兰氏阳性，杆状。

b.菌落的形态特性为：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形， 乳白，不透明，菌落直径为1～2mm；

c.主要的生理生化特征如表1：

表1

所述的具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株的16S rDNA序列如 SEQ ID:No.1所示。

所述的具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株能够应用于修复环 境，其可降解环境中，如大气、水体和土壤中的苯甲硫醚。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

（1）本发明首次从广东省广州市某河涌底泥筛选得到具有降解苯甲硫醚能 力的波茨坦短芽孢杆菌。

（2）本发明的波茨坦短芽孢杆菌具有高效降解苯甲硫醚的能力，在底物浓 度为2mg/L条件下降解240h，降解率可达96.2%。

附图说明

图1是本发明的波茨坦短芽孢杆菌GIGAN1在电子显微镜下的形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

本发明所述的具有降解苯甲硫醚能力的波茨坦短芽孢杆菌株从广东省广州 市某河涌底泥中进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基 为无机盐培养基（每升无机盐培养基中含有如下成分：K₂HPO₄·3H₂O 1.2g，KH₂PO₄1.2g，NH₄Cl 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，CaCl₂·2H₂O 0.2g， MnSO₄·4H₂O 0.2g，CuSO₄·2H₂O 0.01g，ZnSO₄·7H₂O 0.2g，CoCl₂·6H₂O 0.09g， Na₂MoO₄·2H₂O 0.12g，H₃BO₃0.006g）。首先将3g污泥加入含苯甲硫醚10mg/L 的无机盐培养基，37℃驯化7天后，以体积百分比5%的接种量移入含苯甲硫醚20 mg/L的无机盐培养基接着驯化一周，以此类推逐步提高苯甲硫醚的浓度进行驯 化，苯甲硫醚的使用浓度分别为30mg/L、40mg/L、50mg/L。驯化结束后以体 积百分比5%的接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.4～7.6）培养12h，取0.1ml菌悬液（稀释10^-1～10^-7） 涂布在以苯甲硫醚为唯一碳源的固体琼脂平板（K₂HPO₄·3H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄1.2 g/L，NH₄Cl 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂·2H₂O 0.2 g/L，MnSO₄·4H₂O 0.2g/L，CuSO₄·2H₂O 0.01g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.2g/L，CoCl₂·6H₂O 0.09g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.12g/L，H₃BO₃0.006g/L，琼脂粉1.80g/L，苯甲硫醚 10mg/L）直到平板上出现单一的纯菌落为纯菌。挑选生长速度快、边缘规则的菌 落。

将挑选得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

（1）菌体的形态特性：

a．采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的波茨坦短 芽孢杆菌的细胞染色为革兰氏阳性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体 大小为0.5～0.8×6～8μm，周生鞭毛，如图1所示；

b.菌落的形态特性：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，乳白 色，不透明，菌落直径为1～2mm

c.主要的生理生化特征如表2（根据《常见细菌系统鉴定手册》东秀珠，蔡 妙英著）：

表2

上述结果表明本发明所筛选的细菌与波茨坦短芽孢杆菌属的生理生化特性 很相似。

（2）采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引 物扩增。

提取总DNA方法：

a）将细菌接种于5mL新鲜配制的灭菌LB培养基37℃，摇床培养至对数期。 取1.5mL菌液至1.5mL离心管中，8000rpm，室温离心2min，收集菌体（若菌量 太少，可重复上步骤）。

b）弃上清液，留菌体沉淀，控干。加入450μL抽提缓冲液（100mM Tris-HCL(pH8.0)，100mM Na₂-EDTA(pH8.0)，100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)， 1.5mM NaCl，质量百分比1%的CTAB）到离心管中，振荡充分，悬浮菌体。

c）加入12μL100mg/mL溶菌酶，充分混匀，水平振荡200rpm，37℃，30min。 加入8μL10mg/mL蛋白酶K，充分混匀，水平振荡200rpm，37℃，30min。

d）加入50μL 20%（w/w）SDS溶液，轻轻混匀，65℃溶解2h，每15～20min 上下轻轻倒置，水浴后置于4℃冰浴中5min沉淀蛋白，12000rpm，5min，4℃离 心，收集上清液于另一个空离心管中。

e）加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1V/V），抽提约1min，12000rpm，5min， 4℃离心，小心吸取上清液。加入300μL异丙醇，混匀，室温沉淀1h或过夜。

f）12000rpm，10min，4℃离心，收集粗DNA，用200uL 70%（v/v）冰乙醇 洗涤沉淀3min，12000rpm，10min，4℃。空气中晾干乙醇残留，加入50μL TE 缓冲液溶解DNA，保存在-20℃。

采用的引物序列对16S rDNA基因进行扩增：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR扩增体系和条件：

A）PCR扩增体系（50μL体系）

taq buffer：5μl

NTPs（浓度2.5μM）：4μl

引物（浓度：10μM）：上下引物各1μl

Taq酶（浓度5U/μl）：0.25μl

模板：1μl

加灭菌去离子水补足50μl体系。

B）PCR仪条件设定：预变性94℃4min；94℃1min、55℃1min、72℃2min， 循环30次；延伸72℃10min。

其16S rDNA基因，测序结果如下：

GGTGGGCACCTCTAGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCCCGTGGTGTGACGGGCG GTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGGCGAG TTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACTGGTTTTAAGAGATTGGCATACTCTCGCGAGCTAGCTTCCCGTTGTACCAGCCA TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGC AGTCTCTCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTC ACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGCTGCCCCGAAGGGAAGCCCTATCTCTAGGACGGTCAGCGG GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAT TCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAGGGTATTGAAA CCCCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCC TCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTG GAATACCGCTTTCCTCTTCTGCACTCAAGCTACACAGTTTCCGATGCGAACCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTTAACACCAG ACTTACATAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTG GCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTCAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTGTTCGAACGGTACTTGTTCGTCTCTGACA ACAGAACTTTACAATCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAAATTCCC TACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCG TCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCGTAAGTGGTAGCTTGCGCCACCTTTC CGTCTCCTCTCATGCGAGAGAAGACCCTATCCGGTATTAGCATGAGTTTCCCCATGTTATCCCGAGCTTACGGGCAGGTT GCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGCCCCCGAAGGGACTCGCTCGACTGCATTAAGTCTGCGTATTTCCA；

将长为1432bp的16S rDNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行 比对分析发现菌株与Brevibacillus borstelensis sp.R-16402有最高的同源性达 100%。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌 应归属波茨坦短芽孢杆菌属，且为该属的一个新种，命名为波茨坦短芽孢杆菌 （Brevibacillus borstelensis）GIGAN1，于2012年11月8日保藏于位于中国武 汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2012451。

实施例2

本发明筛选得到的波茨坦短芽孢杆菌GIGAN1对苯甲硫醚具有较好的降解 能力：

称取K₂HPO₄·3H₂O 1.2g，KH₂PO₄ 1.2g，NH₄Cl 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.2g， FeSO₄·7H₂O 0.01g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，CuSO₄·2H₂O 0.01g， ZnSO₄·7H₂O 0.2g，CoCl₂·6H₂O 0.09g，Na₂MoO₄·2H2O 0.12g，H₃BO₃0.0.06g，接 着用去离子水定容至1L，100ml/瓶分装在250ml的摇瓶中，121℃条件下灭菌 30min后取出，在无菌条件下加入苯甲硫醚，苯甲硫醚的浓度依次为2mg/L、4 mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L。将斜面（斜面培养基为牛肉膏蛋白胨培养基） 保存的GIGAN1菌种接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养中，在30℃，220r/min 的摇床中活化菌体15h，以体积百分比5%的接种量接入含苯甲硫醚的无机盐培 养基中，30℃下开始降解试验，采用HP6890加装氢焰离子化检测器（FID）气相 色谱测定顶空气相中苯甲硫醚的量再利用亨利定律来测定其在液相中的降解率。 气相色谱装备HP-5MS毛细管柱（0.25mm×0.25μm×30m,Agilent Technologies），检测条件为：检测器温度230℃，进样口温度200℃，柱温50℃ 保持0分钟，以15℃/min升高至150℃后保留2分钟，以25℃/min升高至230 度。采用Agilent 500μL气密针进样，进样量为300μL，不分流模式。结果如表 3所示：

表3不同初始浓度的苯甲硫醚的降解率

苯甲硫醚浓度 降解率 2mg/L 96.2% 4mg/L 74.9% 8mg/L 68.4% 16mg/L 63.1% 24mg/L 55.7%

从表3中可以看出，本发明筛选得到波茨坦短芽孢杆菌GIGAN1对苯甲硫醚 的降解能力最高可达96.2%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。