一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液

摘要

本发明涉及一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分：血浆来源的血清，青霉素-链霉素溶液，L-谷氨酰胺，硫骏庆大霉素，肝素，碱性纤维生子因子，内皮细胞生长补充因子，维生素C，血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子-1，内皮生子因子。本发明所述内皮细胞培养液采用PDS代替了传统培养液中的FBS、小牛血清或马血清，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30％；并且加入了维生素C和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长更快更纯。

说明书

技术领域

本发明涉及一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，属于生物技术领域。

背景技术

现有的大鼠脑血管内皮细胞原代培养，取材来源均为新生鼠(<10天，35～50g)，幼年鼠 (<3weeks，80～100g)或2-3月年轻成年鼠(200g～300g)，而且培养的脑血管内皮细胞只能 传代一次，不能冻存，利用大鼠脑血管内皮细胞作为实验材料导致时间长、实验成本高的缺 点。如：Bowman PD，Betz AL，Ar D，Wolinsky JS，Penney JB，Shivers RR，Goldstein GW. 1981.Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.INVITRO.17(4)，353- 362。

老年大鼠(19～22月，900g～1200g)脑血管内皮细胞培养成功的先例至今未见报道；现 有的取材对象和培养技术不能满足体外建立老年血脑屏障模型，研究老年血脑屏障的生理特 性，以及老年神经系统疾病与血脑屏障相关的退行性病变的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液。

本发明技术方案如下：

一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组 分：

20ml-30ml血浆来源的血清，100ul青霉素-链霉素溶液，1.0-1.5ml L-谷氨酰胺，50- 150μl硫骏庆大霉素，1.0-1.5ml肝素，150-300μl碱性纤维生子因子，1.0-1.5ml内皮细胞生 长补充因子，200-400μl维生素C，100-200μl血管内皮生长因子，100-200μl胰岛素样生长 因子-1，100-200μl内皮生子因子。

向DMEM培养基中加入上述组分即可。

根据本发明优选的，所述在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组分：

20ml血浆来源的血清，100ul青霉素-链霉素溶液，1.0ml L-谷氨酰胺，100μl硫骏庆大 霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子(ECGS)，300μl 维生素C，150μl血管内皮生长因子(VEGF)，150μl胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，150μl内 皮生子因子(EGF)。

上述试剂均为本领域常用市售产品。

有益效果

1、本发明所述内皮细胞培养液采用PDS（血浆来源的血清）代替了传统培养液中的 FBS(胎牛血清)、小牛血清(BCS)或马血清(HS)，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30％； 主要原因是由于FDS中不含PDGF（血小板源性生长因子），而PDGF有利于混入脑血管内 皮细胞中的平滑肌细胞，纤维细胞和胶质细胞的分裂和增殖；用PDS消除了这一影响。

2、本发明在内皮细胞培养液中加入了维生素C和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长更 快更纯。

3、本发明在内皮细胞培养液中还加入了血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子-1，内皮 生子因子，这些因子可使脑血管内皮细胞生长得更快更健康，尤其是对老年大鼠脑血管内皮细 胞的生长更为重要。

附图说明

图1、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经原代培养传3代与传统方法制备的老年大 鼠脑血管内皮细胞原代培养传3代的存活率的柱状比较图；

图2、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经冻存复苏后与传统方法制备的老年大鼠脑 血管内皮细胞经冻存复苏后的存活率的柱状比较图；

图3：本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞 细胞纯度的柱状比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

原料来源：

19-22月的老年大鼠购自北京维通利华实验动物技术中心；

配制老年大鼠脑血管内皮细胞培养基各种试剂的来源：

DMEM培养基，购自Gibico公司，商品号11995-065；

血浆来源的血清（PDS，Plasma-Derived Serum），购自Bioquote公司，商品号BT-214-10；

青霉素-链霉素溶液，购自sigma公司，商品号p0718；

L-谷氨酰胺，购自Sigma公司，商品号G7513；

硫骏庆大霉素，购自sigma公司，商品号G1397；

肝素，购自Sigma公司，商品号H3149；

碱性纤维生子因子（bFGF），购自Sigma公司，商品号F9786；

内皮细胞生长补充因子（ECGS），购自Sigma公司，商品号E2759；

维生素C，购自Sigma公司，商品号c1768；

血管内皮生长因子（VEGF），购自Lonza公司，商品号cc4176；

胰岛素样生长因子-1（IGF-1）购自Lonza公司，商品号cc4176；

内皮生子因子（EGF）购自Lonza公司，商品号cc4176；

嘌呤霉素（Puromycin），购自Sigma公司，商品号p8833。

各种酶及其他相关试剂的来源：

胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司，商品号10437-028；

胶原酶（Collagenase）购自Invitrogen公司，商品号17101；

DNA酶（DNase）购自Sigma-Aldrich公司，商品号D4263；

胰酶（Typsin）购自Sigma-Aldrich公司，商品号T3053；

牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich公司，商品号a3059；

胶原IV（Collagen IV）购自Sigma-Aldrich公司，商品号C5533：

纤连蛋白（Fibronectin）购自Sigma-Aldrich公司，商品号F1141；

Percoll购自Sigma-Aldrich公司，商品号4937；

腰椎穿刺针(Lumbar puncture needle)购自BD公司，商品号405182。

实施例1

一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组 分：

30ml血浆来源的血清，100μl青霉素-链霉素溶液，1.0ml L-谷氨酰胺，100μl硫骏庆大 霉素，1.5ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，400μl维生素 C，200μl血管内皮生长因子，200μl胰岛素样生长因子-1，200μl内皮生子因子；

向DMEM培养基中加入上述组分即可。

实施例2

一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液，在每百毫升DMEM培养基的基础上，加入如下组 分：

20ml血浆来源的血清，100μl青霉素-链霉素溶液，1.0ml L-谷氨酰胺，100μl硫骏庆大 霉素，1.0ml肝素，100μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，200μl维生素 C，100μl血管内皮生长因子，100μl胰岛素样生长因子-1，100μl内皮生子因子；

向DMEM培养基中加入上述组分即可。

对比例

传统脑血管内皮细胞培养液为在每100ml F12培养基（Ham’s-F12培养基）的基础上加 入如下成分：

10-20ml小牛血清(BCS)，100μl青霉素-链霉素溶。（该配方记载于Bowman PD，et al. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.INVITRO.1981.17(4)，353-362 中）。

或者是：

44ml DMEM培养基，44ml Ham’s-F12培养基，10ml胎牛血清（FBS），100μl青霉 素-链霉素溶，1.0ml肝素钠，1.0ml内皮细胞生长补充因子。（该配方记载于Tunkel AR et al. Blood-brain barrier alterations in bacterial meningitis：development of an in vitro model and observations on the effects of lipopolysaccharide.In Vitro Cell Dev Biol.199127A(2)：113- 20）。

试验例

将上述培养液按如下步骤实验培养：

（1）将20月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含 2％（体积百分数）胎牛血清（FBS）分离液中5分钟，取出，切开两个大脑半球，分别把两 个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分，制得样品 组织；

分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：1ml青霉素-链霉素溶液； 100μl硫骏庆大霉素；

（2）把样品组织置于5ml冰冷的含2％（体积百分数）FBS分离液的培养皿中剪成1～ 2mm³的样品组织小块，补加2％（体积百分数）FBS分离液至25ml，经吹打分散，然后将吹 打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中 100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟，制得分散细胞；

（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml2％（体积百分数）FBS的分离液，混匀后 在4℃，600g离心8分钟；移去上清，加20ml含20％（体积百分数）BSA的DMEM培养 基，吹打混匀后，4℃，1000g离心20分钟；取最下层的沉淀，制得毛细血管细胞；

（4）将步骤（3）制得的毛细血管细胞重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离 液，1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃水浴摇床中（100rpm/min）消化 90分钟，制得毛细血管悬液；

（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液在4℃，600g离心5分钟；移去上清，沉淀重悬 于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；4℃，1000g离 心10分钟，分为六层（第一层：透明的分离液；第二层：透明的Percoll但在靠分离液处有 些浮渣；第三层：消化好的脑血管内皮细胞层；第四层：透明的Percoll；第五层：红细胞 层；第六层：Percoll晶体），用长的腰椎穿刺针取第三层液体，第三层液体即为脑血管内皮 细胞；

（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，然后转移到 10cm的培养板或6孔板中，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗两次除去死亡的 细胞，用含3μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培 养液培养7天，用0.01％胰酶(Typsin)消化传代或冻存即可；

所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用 1×Fibronectin铺板30分钟。

结果分析

1、本发明在脑血管内皮细胞培养液中除了加入内皮细胞生长补充因子(ECGS)外，还加 入了碱性纤维生子因子(bFGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，内 皮生子因子(EGF)及维生素C。这些因子可保证脑血管内皮保持健康的细胞形态、生物特性及 生理功能和较快的生长速度；尤其是对老年大鼠脑血管内皮细胞的生长更为重要。如果不加这 些因子，老年大鼠脑血管内皮细胞生长速度缓慢，细胞比较脆弱，容易死亡，只能传一代，不 能冻存和复苏。

2、本发明所述内皮细胞培养液采用PDS（血浆来源的血清）代替了传统培养液中的 FBS(胎牛血清)、小牛血清(BCS)或马血清(HS)，使培养的脑血管内皮细胞纯度增加30％； 主要原因是由于FDS中不含PDGF（血小板源性生长因子），而PDGF有利于混入脑血管内 皮细胞中的平滑肌细胞，纤维细胞和胶质细胞的分裂和增殖；用PDS消除了这一影响。

3、本发明在内皮细胞培养液中加入了维生素C，肝素和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞 生长得更快更纯；主要原因是维生素C和肝素刺激内皮细胞的生长，抑制平滑肌细胞的生 长；嘌呤霉素可抑制成纤维细胞的生长，这些因子保证了培养的内皮细胞的纯度。

实施例1所述更新培养液与传统培养液培养的老年大鼠脑血管内皮细胞传3代存活率的比 较（见图1）

实施例2所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统方法冻存/复苏后存活率的比 较（见图2）

                      实施例2                       对比例

原始代的存活率        100％

冻存/复苏存活率     (78.53±7.76)％                 (12.45±5.9)％

实施例1所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统培养液及方法细胞纯度比较 （见图3）

                    实施例1                       对比例

细胞纯度            (98.26±1.8)％                (68.32±3.2)％

由上述结果可知，本发明所述的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法无论在传3代存活 率、冻存/复苏后存活率和细胞纯度均较现有技术有大幅提高。