一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒及制备方法和应用，参照FMDVO型流行株基因序列，人工合成VP0、VP1和VP3基因的序列，以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒为骨架载体，将VP0、VP1和VP3基因连入该质粒中，得到一种杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013。取杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013与DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，筛选阳性菌落，得到重组穿梭载体Bacmid，将该穿梭载体Bacmid转染sf9细胞，收集细胞上清即获得重组杆状病毒QP-Ac-FVLP。重组杆状病毒高效地表达FMDVVP0、VP1和VP3蛋白并形成病毒样颗粒。以该病毒样颗粒制备亚单位疫苗，免疫小鼠后可诱导机体产生特异性免疫反应。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和病毒学领域。更具体地，本发明涉及一种猪O型口蹄疫病毒的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，还涉及一种猪O型口蹄疫病毒的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的制备方法，还涉及一种猪O型口蹄疫病毒的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP在制备预防猪O型口蹄疫病毒感染亚单位疫苗中的应用。利用本发明的重组病毒表达人工修饰的猪口蹄疫病毒O型VP0、VP1和VP3基因并组装成猪口蹄疫病毒样病毒颗粒VLP，可以用于制备O型口蹄疫病毒安全疫苗。

背景技术

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是一种由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起偶蹄动物的急性、热性、高度接触性人畜共患的传染病。该病流行历史较久，宿主范围广，传染性极强，传播途径多、速度快（陈溥言，2006），一旦爆发极易造成大流行从而严重降低发病动物生产机能和畜产品质量，给畜牧业造成巨大经济损失，所以世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类烈性动物传染病(Pereira HG,1981;Mark et al.,1999)，我国农业部将其列为一级动物传染病，一旦发生疫情必须上报。其宿主主要为偶蹄类动物如家畜牛、猪、羊及骆驼、鹿等其他野生动物（Doel,2005;Dus Santos et al.，2005）。而相关研究表明猫、狗、鸟类、啮齿类、蝙蝠、昆虫等都可传播本病。O型口蹄疫在我国根深蒂固、由来已久。2009年以前分离的FMDV毒株多为中国拓扑型，而2010年后我国口蹄疫的流行趋势发生了新的变化，主要以O型FMDV耿马毒株即东南亚拓扑型的缅甸98（MYA98）为主。FMDV属于小RNA病毒科（Picornaviridae），口蹄疫病毒属（Aphthovirus），该病毒为单股正链小RNA病毒，基因组长约8500个核苷酸，主要由结构基因（P1区）和非结构基因（P2、P3区）等构成。P1区编码FMDV的4种结构蛋白分别为VP4,VP0,VP3和VP1，其中仅有VP0,VP3和VP1蛋白可以形成病毒样颗粒。这四种结构蛋白形成五聚体的亚单位构成病毒衣壳，避免病毒RNA被核酸酶降解，决定病毒的宿主范围和抗原性并且能识别特异性细胞受体。

口蹄疫疫苗接种是作为特异性预防口蹄疫的可靠工具和有效手段（Casas et al.,1988）。目前抗FMDV疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗这两种常规疫苗，虽然这两种疫苗在口蹄疫防制中发挥一定作用，但是存在一些缺点。弱毒苗因为容易导致免疫动物产生病毒血症和长期带毒，还潜在毒力返强的风险，所以世界只有少数国家和地区研究使用，而灭活疫苗具有安全可靠和免疫效果良好的特点，大部分国家使用灭活疫苗来预防口蹄疫。然而，灭活疫苗因其自身的原因，也存在不少缺陷：1.免疫动物无交叉保护，因此一种灭活疫苗无法提供全面的保护；2.制备过程中存在病毒逃逸的风险；3.因含有组织或细胞成分免疫存在副反应。

除了上述常规疫苗之外，人们正在寻求口蹄疫基因工程疫苗如亚单位疫苗，多肽疫苗，痘病毒、腺病毒等活载体疫苗。但是这些疫苗仍存在某些不足，不被人们所接受，如亚单位疫苗和多肽疫苗造价昂贵，免疫效果不佳；痘病毒、腺病毒等活载体的疫苗虽然具有一定的免疫效果，但由于载体病毒的限制性，人们宁可选择常规疫苗也不选择该基因工程疫苗来预防口蹄疫。因此，本领域迫切需要开发出具有高效、安全、廉价的针对口蹄疫的基因工程疫苗。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa califonica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。近年来发展起来的病毒样颗粒疫苗（Virus like particles,VLP），含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导机体产生良好的免疫保护。鉴于杆状病毒表达载体的优势和病毒样颗粒疫苗的特性，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达O型FMDV当前流行毒株耿马谱系VP0、VP3和VP1基因，并成功组装成病毒样颗粒VLP，并以此制备疫苗，为O型FMDV感染的免疫防制提供候选疫苗株。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种人工修饰合成的猪O型FMDV（Foot-and-mouth disease,FMDV,口蹄疫病毒）耿马谱系的免疫原性基因VP0、VP1和VP3的cDNA序列，其序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明的另一个目的是提供一种杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013，该载体含有猪O型FMDV耿马谱系免疫原性基因VP0、VP1、VP3和标记基因eGFP。

本发明还有一个目的是提供一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒，该毒株被命名为重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，属于杆状病毒（Baculovirus），该病毒含有人工修饰合成的猪O型FMDV耿马谱系主要免疫原性基因VP0、VP1和VP3，可表达人工修饰合成的猪O型FMDV耿马谱系VP0、VP1、VP3蛋白，于2012年8月16送交中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC NO：V201237，分类命名：重组杆状病毒QP-Ac-FVLP Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus QP-Ac-FVLP，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是提供了一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒在制备预防猪O型口蹄疫病毒感染亚单位疫苗中的应用，将该病毒免疫小鼠后可诱导机体产生特异性免疫反应。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒，其制备步骤如下：

1、FMDV VP013基因的人工修饰合成和杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013的构建

参照FMDV O型流行株O/HLJOC12/03基因序列(DQ119643.2)，根据密码子的偏爱性人工合成VP0、VP1和VP3基因的序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示。

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒（钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN101624580A,专利号ZL200910063217.6）为骨架，通过NcoI和KpnI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过XhoI和HindIII分别酶切VP0基因和pFBDPHmHNM1，回收VP0基因和骨架载体pFBDPHmHN，然后通过连接酶Ligase于16℃进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组质粒并酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNVP0。通过SpeI和NotI酶切VP1基因和pFBDPHmHNVP0,回收VP1基因和pFBDPHmHVP0，然后通过连接酶Ligase连接，提取重组质粒并酶切鉴定，获得转移载体pFBDPHmHVP01。再通过BamHI和EcoRI分别酶切VP3基因和pFBDPHmHVP01，回收VP3基因和pFBDPHmVP01，然后通过连接酶Ligase连接，提取重组质粒，酶切鉴定结果显示最终获得杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013（图1）。

2、重组病毒杆状病毒QP-Ac-FVLP的构建与鉴定

(1)重组病毒杆状病毒QP-Ac-FVLP的构建

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013 2.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌（Invitrogen^TM）感受态细胞混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基（氯化钠浓度为10%），37℃振摇培养4h，按10^-1、10^-2、10^-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板（卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书），37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、经两次划线纯化后获得纯的稳定的白斑，纯化阳性菌落，提取重组穿梭载体(Bacmid)并通过PCR进一步鉴定。用VP0（F）（5’-TTTTGGATCCACCATGGGCGCCGGGCAATCC-3’)和M13（R）（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）进行PCR鉴定。结果表明能够扩增出一条4200bp的特异目的带，表明在大肠杆菌中外源基因VP013已重组入杆状病毒基因组中（图2）。

利用脂质体介导转染法（按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书操作），将筛选并纯化后的重组穿梭载体(Bacmid)经Reagent转染sf9细胞（购自武汉大学中国典型物保藏中心）中，分别在转染后24h、48h、72h利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，在转染72h后收集细胞上清即获得重组杆状病毒命名为QP-Ac-FVLP，该病毒于2012年8月16送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC V201237，分类命名Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus QP-Ac-FVLP。该病毒可于4℃保存或-80℃长期保存。该重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2具有与载体杆状病毒苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa califonica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）相同的形态学特性，培养特性等功能特性，病毒基因组为DNA，呈杆状，有囊膜包裹；其宿主范围主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。体外培养多使用来源于草地贪夜峨(Spodoptera frugiperda)卵巢的sf9和sf21，以及来源于粉纹夜峨(Trichoplusia ni)的BTI-Tn-5B1-4即Hi5细胞系，培养最适温度是26-28℃，可减少与哺乳动物细胞之间的交叉污染。

提取F2代重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的基因组分别用VP1引物（VP1(F)：5’-TTTTGTCGACCCACCATGACCACCTCTGCGGGTG-3’，VP 1(R)：5’-CTGTAAGCTTTTACTGTTTTGCGGGTGCCAC-3’）、VP0（F）（5’-TTTTGGATCCACCATGGGCGCCGGGCAATCC-3’)和M13（R）（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）两对引物进行PCR鉴定，分别扩出650bp和4200bp的片段（图3），说明获得的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP含有外源目的基因。

(2)重组杆状病毒QP-Ac-FVLP外源蛋白表达的鉴定

(A)间接免疫荧光和Western-blot检测外源蛋白的表达

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，36小时后固定细胞或72h后收集病变细胞并超声波裂解。一方面固定细胞进行间接免疫荧光，以本室吴斌教授制备的鼠抗FMDV O型VP1单抗为一抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌），以Cy3标记羊抗鼠IgG抗体（Sigma）为二抗，以DAPI对细胞核进行染色，在共聚焦显微镜下观察，结果显示用重组杆状病毒感染的细胞有较强的红色荧光信号而正常的sf9细胞无红色荧光信号（图4），表明重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的外源基因在sf9细胞中得到表达。一方面将收集的昆虫细胞，经SDS-PAGE转膜后,一组以鼠抗FMDV O型VP1单抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌）为一抗，羊抗鼠IgG-HRP（Sigma）为二抗，另一组以兔抗FMDV高免血清IgG为一抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌），羊抗兔IgG-HRP（Sigma）为二抗，同时进行Western blot分析，结果显示第一组有一条约28KD的特异性条带(图5（A）)，第二组有两条特异性条带，一条约28KD另一条约36KD（5（B）），实验结果进一步表明重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的外源基因在sf9细胞中均得到有效表达（如图5）。

（B）病毒粒子的电镜观察

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，72小时后收集病变细胞并超声波裂解。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察。在电子显微镜下观察到杆状病毒（◇）和形成典型的FMDV样病毒颗粒（如图6所示）。

一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒在制备预防猪O型口蹄疫病毒感染亚单位疫苗中的应用，步骤如下：

1、重组病毒QP-Ac-FVLP亚单位疫苗的制备及免疫小鼠

为了评价重组杆状病毒QP-Ac-FVLP亚单位疫苗在预防O型口蹄疫病毒感染中的免疫效果，将获得的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP以3-5pfu/cell的感染复数接种悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM（购自Invitrogen公司），72h后收集病毒液，2000rpm离心10min收集细胞并用细胞计数板进行计数，用PBS调整细胞个数为2×10⁷个/ml和2×10⁶个/ml两个梯度，反复冻融3次后与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma）乳化，置4℃暂存。

将制备好的亚单位疫苗采取腿部肌肉注射的方式免疫小鼠，每只免疫100μL，免疫两次，间隔3周，以未经过病毒感染且采取亚单位疫苗相同处理方式的HighFive细胞组作为阴性对照组，以商品化O型口蹄疫灭活苗组作为阳性对照组。

2、免疫学指标的检测

2.1 动物试验血清ELISA抗体检测

将小鼠血清用PBST按1:40比例稀释后加入抗原包被板中，每孔100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤包被板3次，每次5min，用PBST将羊抗鼠IgG-HRP（Sigma）按1:5000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤板子3次，每次5min，每孔分别先后加入50μL显色液A和B，室温避光作用10min，最后每孔加入50μL终止液，用酶标仪测定OD₆₃₀，结果如图7所示。

2.2.实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-Y相对表达水平

2.2.1 免疫小鼠脾细胞的制备

采用颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，加入5ml改良型1640用匀浆器轻轻研磨至脾脏分散成单个细胞，并补加5ml 1640培养基室温静置5min，吸上清转移到另一离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，加入5ml无菌的8.3g/L NH4Cl重悬，1000rpm离心10min，沉淀用含有10%FBS的RPMI-1640调整细胞浓度至1×10⁶个/ml，于12孔细胞培养板加入细胞重悬液每孔1ml，同时每孔加入20μL紫外线照射灭活的FMDV作为刺激原，37℃CO₂培养箱培养20h，收集刺激后的小鼠脾细胞至1.5mlEP管中，-80℃保存。

2.2.2 免疫小鼠脾细胞总RNA的提取

向收集的小鼠脾细胞每管加入1ml SuPerfecTRI Total RNA Isolation Reagent，颠倒混匀后室温静置5min，每管加入200μL氯仿剧烈震荡15s，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，转移上清于另一EP管中；加入500μL异丙醇混匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min；弃上清加入1ml现配的75%乙醇（DEPC水配制），7000rpm离心5min，弃上清，沉淀在超净工作台内风干，最终RNA用20μL DEPC水溶解，测定RNA浓度及纯度，-80℃保存。

2.2.3 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN mRNA表达

采用TRIzol法提取细胞的总RNA，利用SYBRGreen I实时定量PCR的方法检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-α、IFN-β、IFN-Y mRNA表达情况。结果可以看出重组杆状病毒免疫组可以刺激小鼠诱导产生较高水平的IFN-α，而IFN-β、IFN-Y无明显增高(图8)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了猪O型FMDV耿马谱系的免疫原性基因VP0、VP1和VP3，提高了这些基因在杆状病毒中表达水平。

2．本发明是将合成的猪O型FMDV耿马谱系的免疫原性基因VP0、VP1和VP3分别置于杆状病毒PH启动子后表达，大大提高了外源基因的表达量。

3．本发明的重组杆状病毒所表达的衣壳蛋白在昆虫细胞中能成功装配成病毒样颗粒(VLP)，具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，因而更加安全。

4．本发明的重组杆状病毒所表达包装形成的病毒样颗粒(VLP)制备亚单位疫苗，免疫小鼠后可诱导机体产生特异性免疫反应。

附图说明

图1：为一种杆状病毒载体pFBDPHmVP013的酶切鉴定图谱。

M1：15000bp DNA Marker；1、pFBDPHmVP013/EcoRI酶切鉴定；2、pFBDPHmVP013/KpnI酶切鉴定；3、pFBDPHmVP013/SacII酶切鉴定；M2:5000Marker。

图2：为一种重组穿梭载体Bacmid PCR鉴定。

鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取重组穿梭载体Bacmid进行PCR鉴定的电泳图片。

1：为VP0（F）/M13（R）引物扩增重组穿梭载体Bacmid的PCR结果，片段大小约为4200bp；

M：15000Marker;

2：为VP0（F）/M13（R）引物扩增转移载体pFBDPHmVP013的PCR结果；

3：为VP0（F）/M13（R）引物扩增水对照的PCR结果。

图3：为一种重组杆状病毒QP-Ac-FVLP基因组的PCR鉴定示意图。

A图：利用VP1上下游引物扩增重组病毒基因组的PCR结果;

B图：利用VP0(F)和M13(R)上下游引物扩增重组病毒基因组的PCR结果;

M1：2000bp DNA Marker;1:重组病毒QP-Ac-FVLP基因组；2：水对照；M2:15000bp DNA Marker。

图4：为一种间接免疫荧光鉴定重组杆状病毒QP-Ac-FVLP外源基因的表达示意图。

A图：重组杆状病毒QP-Ac-FVLP感染sf9细胞的间接免疫荧光结果；

B图：无病毒感染sf9细胞对照的间接免疫荧光结果；

a：红荧光CY3信号；b：绿荧光eGFP信号；c：DAPI染色细胞核蓝色荧光信号；d：三种颜色重叠。

图5：为一种Western blot鉴定杆状病毒QP-Ac-FVLP外源基因的表达示意图。

A：FMDV VP1单克隆抗体为一抗的结果；B：兔抗FMDV高免血清IgG为一抗的结果；

M：蛋白质marker；1：杆状病毒QP-Ac-FVLP感染sf9细胞；2：无病毒感染sf9细胞对照。

图6：为一种杆状病毒QP-Ac-FVLP感染sf9细胞上清形成病毒样颗粒的电镜图片。

重组杆状病毒QP-Ac-FVLP以3~5pfu/cell的感染剂量接种sf9细胞，72小时后收集病变细胞并超声波裂解和超速离心进行电镜观察，除了可见典型的杆状病毒粒子（◇所示）外，也见大量大小约为20nm的无囊膜病毒，形态与典型的FMDV相同，表明组装成病毒样颗粒VLP（所示）。

图7：为一种不同时间小鼠血清针对FMDV的ELISA抗体水平示意图。

细胞对照组、商品疫苗组、重组杆状病毒低剂量（2×10⁶个细胞/ml）和高剂量组（2×10⁷个细胞/ml）免疫小鼠免疫小鼠，首免前和首免后第21天、35天和42天采血，分离血清用原核表达FMDV O型VP1蛋白包被的酶联板检测血清中的抗FMDV的ELISA抗体。结果表明在首免后21天，重组杆状病毒免疫组抗FMDV抗体水平逐渐上升，并且高剂量组抗体水平高于低剂量组。

图8：为一种实时荧光定量PCR分析小鼠脾细胞中IFN表达示意图。

细胞对照组、商品疫苗组、重组杆状病毒低剂量（2×10⁶个细胞/ml）和高剂量组（2×10⁷个细胞/ml）免疫小鼠，于首免42天后脱臼处死，无菌操作取出脾脏，分离细胞加入灭活的FMDV作为刺激因子培养20h，采用TRIzol法提取细胞的总RNA，利用SYBRGreenI实时定量PCR的方法检测免疫小鼠脾细胞中的α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素mRNA表达情况，结果表明免疫后α-干扰素mRNA水平明显上升。

具体实施方式

实施例1：一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒，其制备步骤如下：

（一）、重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的构建

1、猪O型FMDV的免疫原性基因VP0、VP1、VP3的人工修饰合成

参照FMDV O型流行株O/HLJOC12/03基因序列(DQ119643.2)，根据密码子的偏爱性人工合成VP0（SEQ ID NO.1）、VP1（SEQ ID NO.2）和VP3（SEQ ID NO.3）基因的序列。

2、杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013的构建

以pFBDPHmHNM1P10eGFP质粒（钱平等，一种表达人工修饰合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒，专利公开号CN200910063217.6）为骨架，通过NcoI和KpnI酶切pFBDPHmHNM1P10eGFP，回收大片段获得pFBDPHmHNM1。通过XhoI和HindIII分别酶切VP0基因和pFBDPHmHNM1，回收VP0基因片段和pFBDPHmHN载体，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHNVP0。进而通过SpeI和NotI酶切VP1基因和pFBDPHmHNVP0,回收VP1基因和pFBDPHmHVP0，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pFBDPHmHVP01。再通过BamHI和EcoRI分别酶切VP3基因和pFBDPHmHVP01，回收VP3基因和pFBDPHmVP01，然后连接，提取重组质粒，酶切鉴定表明最终获得杆状病毒转移载体pFBDPHmVP013（如图1）。

3、重组病毒杆状病毒QP-Ac-FVLP的构建

（1）重组穿梭载体(Bacmid)的获得与鉴定

取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pFBDPHmVP0132.0μL与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基（氯化钠浓度为10%），37℃振摇培养4h，按10-1、10-2、10-3稀释后，各取100μL涂布于三抗高盐LB平板（卡那霉素、庆大霉素和四环素，使用浓度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书），37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落。提取阳性菌落基因组并通过特异引物VP0（F）（5’-TTTTGGATCCACCATGGGCGCCGGGCAATCC-3’)和M13（R）（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）进行PCR鉴定。

PCR扩增条件如下：

反应条件

94℃                    3min

72℃                    3.0min

72℃                    10min

4℃                     10min

扩增的PCR产物经0.8%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明能够扩增扩增出大小为4200bp的条带，大小与预期一致，结果表明外源目的基因插入到杆状病毒的基因组中（图2）。

（2）重组穿梭载体(Bacmid)的提取

无菌挑取含重组Bacmid的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长期时，收集菌体用0.3mL溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)）重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH,1%SDS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III（3mol/L的乙酸钾，pH5.0）混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL TE中，可立即使用或-20℃保存，避免反复冻融。

（4）重组杆状病毒QP-Ac-FVLP获得及PCR鉴定

利用脂质体介导转染法（按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System（试剂盒）操作说明书操作），将筛选、纯化后的重组穿梭载体(Bacmid)经Reagent转染sf9细胞（购自武汉大学中国典型物保藏中心）中，于28℃培养，分别在转染后24h、48h、72h利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，在转染72h后收集细胞上清即获得重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，于-80℃保存。

将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90%单层时，用1个MOI重组杆状病毒QP-Ac-FVLP接种sf9细胞，同时设对照杆状病毒，逐日观察，感染72小时后90％以上的sf9细胞发生病变。

取400μl培养上清和细胞悬液，用胰蛋白酶在56℃下处理4个小时，用等体积的酚/氯仿抽提二次，取上清加入1/10体积的3M醋酸纳和2倍体积的无水乙醇沉淀，离心弃上清，用500μl70％乙醇洗沉淀一次，自然干燥后加入50μl灭菌的去离子水重悬作为PCR模板。分别用VP1引物（VP1(F)：5’-TTTTGTCGACCCACCATGACCACCTCTGCGGGTG-3’，VP 1(R)：5’-CTGTAAGCTTTTACTGTTTTGCGGGTGCCAC-3’）、VP0（F）（5’-TTTTGGATCCACCATGGGCGCCGGGCAATCC-3)和M 13（R）（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）两对引物进行PCR鉴定，反应条件同重组穿梭载体(Bacmid)PCR鉴定。PCR扩增产物经0.8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明分别扩出650bp和4200bp的片段（图3），与试验预期结果一致，说明获得的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP含有外源目的基因。

（二）、重组杆状病毒QP-Ac-FVLP外源基因的表达以及空衣壳粒子VLP的形成

1、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，36h后固定细胞，以我室制备的鼠抗FMDV O型VP1单抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌）为一抗，以Cy3标记羊抗鼠IgG抗体（Sigma）为二抗，以DAPI对细胞核进行染色，在共聚焦显微镜下观察，结果显示用重组杆状病毒QP-Ac-FVLP感染的细胞有较强的红色荧光信号而正常的sf9细胞无红色荧光信号（图4），表明重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的外源基因在sf9细胞中得到表达。

2、重组杆状病毒QP-Ac-FVLP表达外源蛋白的Western blot分析

收集QP-Ac-FVLP感染72h后病变的细胞，裂解后进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜后，一组以鼠抗FMDV O型VP1单抗为一抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌），羊抗鼠IgG-HRP（Sigma）为二抗，另一组以兔抗FMDV高免血清IgG为一抗（硕士论文：李任峰；检测口蹄疫病毒单抗ELISA方法的建立及口蹄疫病毒多抗原基因的融合表达。导师：吴斌），羊抗兔IgG-HRP（Sigma）为二抗，同时进行Western blot分析，结果显示第一组有一条约28KD的特异性条带(图5A)，第二组有两条特异性条带，一条约28KD另一条约36KD（图5B），结果进一步表明重组杆状病毒QP-Ac-FVLP的外源基因在sf9细胞中得到有效表达并具有免疫原性。

3、重组杆状病毒QP-Ac-FVLP在昆虫细胞中的形成病毒样颗粒的检测

在刚长成单层的sf9细胞上，以3-5pfu/cell的感染复数接种重组杆状病毒QP-Ac-FVLP，72小时后收集病变细胞并超声波裂解。在4℃条件下8000g离心30min，然后用蔗糖浓缩到原体积的1/10，上清中即含有表达的VLP颗粒。将上清27,000rpm/min，超速离心3小时，沉淀重悬于2ml的PBS中，并用1ml的注射器反复吹打，然后病毒悬液用20-60％蔗糖密度梯度进行27,00rpm/min超速离心16小时，收集最上层的蛋白带进行电镜观察，结果显示在电子显微镜下观察典型的杆状病毒粒子和FMDV样病毒颗粒（Virus-like particles，VLPs），直径约为20nm，其形态和大小都与FMDV全病毒粒子相似（图6）。

实施例2：重组杆状病毒QP-Ac-FVLP亚单位疫苗的制备及应用

1、重组杆状病毒QP-Ac-FVLP亚单位疫苗的制备

为了评价重组杆状病毒QP-Ac-FVLP亚单位疫苗在预防O型口蹄疫病毒感染中的免疫效果，将获得的重组杆状病毒QP-Ac-FVLP以3-5pfu/cell的感染复数接种悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM（购自Invitrogen公司），72h后收集病毒液，2000rpm离心10min收集细胞并用细胞计数板进行计数，用PBS调整细胞个数为2×10⁷个/ml和2×10⁶个/ml两个梯度，反复冻融3次后与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma）乳化，置4℃暂存。

2、小白鼠的免疫效力试验

将制备好的亚单位疫苗采取腿部肌肉注射的方式免疫小鼠，每只免疫100μL，免疫两次，间隔3周，以未经过病毒感染且采取亚单位疫苗相同处理方式的HighFive细胞组作为阴性对照组，以商品化O型口蹄疫灭活苗组作为阳性对照组。

2.1重组杆状病毒QP-Ac-FVLP诱导的ELISA抗体水平

在首免前和首免后第21天、35天和42天采血，分离血清用原核表达FMDV O型VP1蛋白（卢顺，董晓辉，张春娟，但汉并，张克山，吴斌，陈焕春。一种检测猪口蹄疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒的研制。2009，第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会）包被的板子检测血清中的ELISA抗体，结果如图8。从图中可以看出：免疫组在加强免疫后血清中抗体呈上升趋势，其中免疫10⁶个细胞组的抗体水平比免疫10⁵个细胞组上升趋势明显且水平高，但二者差异不显著（P>0.05），在免疫后35天时基本达到高峰，随后上升较缓。整个试验过程中，细胞阴性对照组未检测到特异性的ELISA抗体（图7）。

2.2实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN mRNA表达

小鼠首免42天后脱臼处死，无菌操作取出脾脏，分离细胞加入灭活的FMDV病毒作为刺激因子培养20h，采用TRIzol法提取细胞的总RNA，利用SYBRGreen I实时定量PCR的方法检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-α、IFN-β、IFN-Y mRNA表达情况。结果可以看出重组杆状病毒免疫组可以刺激小鼠诱导产生较高水平的IFN-α，而IFN-β、IFN-Y无明显增高(图8)。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒及制备方法和应用

 

<130>  一种猪O型口蹄疫病毒重组杆状病毒及制备方法和应用

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  915

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

atgggcgccg ggcaatccag cccgacgact gggtcacaaa accagtctgg caacactggc     60

 

agcattatta acaattacta catgcagcag taccagaact caatggacac ccaacttggc    120

 

gacaacgcca tttgtggagg gtctaatgag ggctccacgg atactacctc cacccacacc    180

 

aacaacactc agaacaacga ctggttttca aaactggcta acaccgcttt tagcggcctc    240

 

ttcggtgccc ttcttgcaga caagaagacg gaagaaacca ccctcctcga agaccgcatc    300

 

ctcaccaccc gcaacgggca cacgacctcg acaacccagt ctagcgtcgg ggtgacgtac    360

 

gggtacgcaa cggctgaaga cttcgtgagt gggcctaaca cctccggtct tgagaccaga    420

 

gtcgttcagg ccgaacggtt cttcaaaacc cacctgttcg actgggtcac cagtgacccg    480

 

tttggacggt gtcacttgtt ggagctaccg accgaccaca aaggtgtcta cggtagcctg    540

 

accgactctt acgcgtacat gaggaatggt tgggacgttg aagtcaccgc agtggggaac    600

 

cagttcaacg gaggctgttt gctggtagcg atggtaccgg agctctgttc tatcaacaag    660

 

agagagttgt accaactcac gcttttcccc caccagttca tcaacccacg gacgaacatg    720

 

acggcacaca tcaccgtgcc ctaccccggt gttaacaggt acgaccagta caaggtacac    780

 

aaaccctgga ccctcgtggt catggttgtg gctcccctga cggttaacaa cgagggcgct    840

 

ccgcaaatca aggtgtatgc caacatcgcc cccaccaacg ttcacgtcgc aggcgagctc    900

 

ccttccaaag agtaa                                                     915

 

 

<210>  2

<211>  639

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

atgaccacct ctgcgggtga gtccgcggac cccgtgactg ccaccgttga gaactacggt     60

 

ggcgagacac aagcccagag acgccaacac acggacattt cgttcatact agacaggttc    120

 

gtgaaagtca agccaaagga acaagtcaac gtgttggacc tgatgcagat ccctgcccac    180

 

accttggtgg gggcgctcct gcgaacggcc acctactact tctctgacct ggaactggct    240

 

gtcaagcacg agggcgatct cacctgggtc ccaaacggtg cccctgagac agcactggac    300

 

aacactacca acccaacagc ttaccacaag gaaccgctca cacggctggc actgccttac    360

 

acggctccac accgtgtctt ggcgaccgtc tacaacggga gcagtaagta cggtgacacc    420

 

agcactaaca acgtgagagg tgaccttcaa gtgttggctc agaagacgga aagaactctg    480

 

cctacttcct tcaacttcgg tgccattaag gctactcgtg tgactgaact actctacaga    540

 

atgaagagag ccgagacgta ctgtcccagg ccccttctcg ctattcagcc gagtgacgcc    600

 

agacacaagc agaagattgt ggcacccgca aaacagtaa                           639

 

 

<210>  3

<211>  666

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

atggggatct tccccgtggc atgcagcgat ggttacggtg gcttggtgac cacggatccg     60

 

aagacggcag accccgtcta cgggaaagtg ttcaacccac cccgtaacct gttgccaggg    120

 

cggttcacga acctcctcga cgtggccgag gcgtgcccta cgttcctaca cttcgacggc    180

 

gacgttccgt acgtgaccac aaagacggac tcagacaggg tgttggccca gttcgacttg    240

 

tccctcgcgg cgaaacacat gtcgaacacc tttctcgcgg gtcttgccca gtactacaca    300

 

cagtacagtg gcaccattaa cctacacttc atgttcacgg ggcccaccga cgcgaaggca    360

 

cgctacatgg ttgcgtatgc ccctcctggc atggaaccgc cgaaaacgcc tgaggcggct    420

 

gcacactgta tccacgctga gtgggacaca gggttgaatt cgaagttcac gttttcaatc    480

 

ccataccttt cggcagccga ctacgcgtac accgcgtccg atgtcgccga gaccactaac    540

 

gttcagggat gggtctgtct gttccagata acacacggga aagcagacgg tgatgctctg    600

 

gtcgtgctgg ctagtgccgg caaagacttt gacttgcgcc tgccggttga cgcccggacc    660

 

caataa                                                               666