一种基于亲和素-生物素系统细胞图形化芯片及其制备和应用

摘要

本发明公开了属于生物微系统技术领域的一种基于亲和素-生物素系统细胞图形化芯片及其制备和应用。此方法利用光刻和化学沉积的方法制备亲生物性的六甲基二硅胺点阵列以及生物钝化的聚乙二醇图形化区域；然后在六甲基二硅胺点阵列上形成牛血清白蛋白-生物素、亲和素和生物素化细胞的三明治结构，从而定向排布细胞，实现细胞的分离与定位。本发明的方法所用材料简单，方法简便；通过对HMDS阵列的大小以及排布方式的控制来实现对细胞阵列的排布进行控制；可用于各种细胞的图形化；在芯片的后续检测应用中，单细胞阵列不易被破坏；所用材料以及生化物质对细胞活性影响不大，能够使其用于活体细胞的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物微系统技术领域，具体涉及一种基于亲和素-生物素系 统细胞图形化芯片及其制备和应用。

背景技术

传统药物筛选方法通过追踪动物组织病理的生化途径确定引起病变的 关键生物物质，再利用该种物质的靶分子进行药物筛选，具有技术复 杂、低通量、动物实验多、药物用量大、成本高等缺点。微图形技术 不仅为药物筛选研究提供了一种替代昂贵、费时的动物实验的研究手 段，更将研究层级提高到了细胞甚至基因水平，高通量的特征使药物 筛选与新药开发的周期大大缩短。在细胞水平上，微图形化技术可以 按照检测需要构筑细胞图形、固定细胞位置，从而通过实时、快速、 精确地检测细胞对药物的反应，进行药物筛选。

利用生化材料刺激组织再生、修复已成为组织工程的重要发展方向， 研究界面的生化特征对优化植入位点生化材料的性能起着至关重要的 作用。与细胞接触的界面的形态、刚性及分子结构决定了细胞的贴附 、生长、繁殖等过程。微图形化技术为研究界面上的生化过程提供了 一个高效、全新的研究平台。

重大疾病诊断与疾病分型要求检测设备具有快速、灵敏、高通量的特 点，由于生物系统的复杂性，目前常需要几十个生物传感器才能确诊 疾病细分类型。微图形化技术具备将多种生物受体集成在一片可寻址 传感器上的潜在能力，通过对样本的并行检测，简化疾病诊断流程， 为疾病治疗赢得宝贵的时间。

发明内容

本发明的目的在于利用亲和素和生物素之间的强结合作用，提供一种 利用亲和素-生物素系统细胞分离与定位方法。

一种基于亲和素-生物素系统细胞图形化芯片，在基底上覆有一层同时 具有生物亲和性区域和生物钝化区域的薄膜，所述生物亲和性区域为 细胞尺度的六甲基二硅胺（Hexamethyldisilazane，HMDS）点阵列， 所述生物钝化区域为聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）图形化 区域。

上述基于亲和素-生物素系统细胞图形化芯片的制备方法，包含以下步 骤：

（1）生物亲和性区域制备：在基底上旋涂光刻胶，将光刻胶进行光刻 曝光， 显影，然后利用化学气相沉积（Chemical Vapor Deposition，CVD ），用六甲基二硅胺填充光刻胶显影后凹陷区域，去除光刻胶，形成 六甲基二硅胺点阵列；

（2）生物钝化区域制备：将上述基底浸入聚乙二醇硅烷溶液中静置， 使基底裸露部分覆盖生物钝化材料聚乙二醇，得到生物钝化区域。

利用上述基于亲和素-生物素系统细胞图形化芯片进行细胞分离与定位 的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）细胞阵列的制备：将细胞表面用生物素标记，在芯片上滴加牛血 清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）-生物素（biotin -BSA）溶液，利用BSA的粘附性，使BSA连接在HMDS点阵列上，形成bi otin-BSA点阵列；

（2）在biotin-BSA点阵列上均匀滴加亲和素，使亲和素与生物素相连 ，形成亲和素点阵列；

（3）将生物素化细胞均匀接种在亲和素点阵列上，孵育，得到牛血清 白蛋白-生物素、亲和素和生物素化细胞的三明治结构，清洗除去非特 异性吸附在聚乙二醇区域上的细胞，在六甲基二硅胺点阵列上得到牢 固的细胞阵列，从而定向排布细胞，实现细胞的分离与定位。

本发明的有益效果在于：1）利用光刻和CVD的方法在玻璃基底上进行 图形化，所用材料简单，方法简便，对实验条件要求不高；2）利对H MDS阵列的大小以及排布方式的控制，可以对（单）细胞阵列的排布进 行控制；3）利用NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，N-Hydroxysuccinimide） -LC-Biotin对细胞表面进行生物素化，使其能够被图形化的亲和素捕 获，该方法对细胞的种类没有要求，可使用与各种细胞的图形化；4） 利用亲和素和生物素之间的强结合作用，细胞与基底结合牢固，在芯 片的后续检测应用中，单细胞阵列不易被破坏；5）所用材料以及生化 物质对细胞活性影响不大，能够使其用于活体细胞的检测。

附图说明

图1是细胞阵列结构图。

图2是HMDS与PEG钝化区域图形化流程图。

图3是单细胞制备流程图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施例做进一步说明。

分离定位后的细胞阵列结构，如图1所示。该发明先用光刻和CVD在HM DS 与PEG在玻璃基底上进行图形化，再在HMDS阵列上利用Biotin-BSA、亲 和素以及细胞的三明治结构形成（单）细胞阵列。

1.HMDS与PEG钝化区域的图形化处理：

用Piranha洗液超声清洗载玻片，除去载玻片表面的金属离子以及有机 物；在清洗完的载玻片上旋涂光刻胶，并前烘；将光刻胶进行光刻曝 光并进行中烘；在NaOH显影液中显影得到光刻胶图形并坚膜；利用化 学气相沉积，在HMDS蒸汽中冷却，将载玻片没有光刻胶部分沉积HMDS ；利用丙酮去胶，除去所有光刻胶，形成HMDS点阵列；在PEG-Silane （硅烷）溶液中静置，使载玻片裸露部分覆盖生物钝化材料PEG；最终 ，在载玻片上得到疏水的与生物粘附性良好的HMDS点阵列，而在其余 地方覆盖难以生物粘附的材料PEG，如图2所示。

2.细胞阵列的制备：

1）细胞表面的生物素化

利用NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，N-Hydroxysuccinimide）-LC-Biotin对 细胞表面进行生物素化，使NHS-Biotin与细胞表面蛋白质的胺基反应 ，将生物素与细胞表面蛋白质相连，使活细胞表面生物素化。

2）细胞阵列的装配

在HMDS与PEG钝化区域的图形化载玻片上均匀滴加20μg/ml 的bioti n-BSA溶液，利用BSA的粘附性，使BSA连接在HMDS点阵列上，形成bio tin-BSA点阵列。在biotin-BSA点阵列上均匀滴加20μg/ml的亲和素溶 液，利用亲和素与BSA上的生物素之间的强结合作用，使亲和素与生物 素相连，形成亲和素岛阵列。将5×10⁶/ml生物素化的细胞溶液均匀接 种在亲和素岛阵列上，，孵育30分钟。由于亲和素与生物素之间的强 结合作用，细胞与亲和素岛阵列相连。清洗除去非特异性吸附在PEG区 域上的细胞，形成细胞阵列。特别的，当HMDS岛阵列在单细胞尺度上 时，其上形成的biotin-BSA、亲和素点阵列都在单细胞尺度上，从而 接种细胞后形成单细胞阵列，如图3所示。