大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物

摘要

本发明的目的在于提供一种大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物，所述方法通过荧光PCR直接判断有无曲线增长或观察荧光PCR后的溶解曲线，从而判断是否存在CCR5-Δ32基因型，以及该基因型是否是纯合子或杂合子，从标本加样到完成荧光PCR反应及结果判断，在1个半小时内完成，同时避免了PCR方法最大的缺点，即产物的污染问题，使得结果更准确可信，因此该方法非常适合对标本的大规模初筛。同时可以采用初筛和复查相结合的策略，既在初筛的基础上，可对疑似CCR5-Δ32基因型的标本，进行测序验证，从而保证结果的可靠性。该方法具有快速、准确、简单、成本低、能大规模进行筛选的优点，有利于基层现场的使用和推广。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，特别提供一种大规模筛查人CCR5-Δ32基 因型的方法及其引物。

背景技术

艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）即获得性免疫 缺陷综合症，是人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV） 感染人体后导致免疫缺陷，并发一系列感染及肿瘤，可导致死亡的综合征。 目前，艾滋病已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题，在我国的流 行情况也十分严峻。艾滋病毒分为HIV-1和HIV-2两种基因型，HIV-1是世 界上的主要流行的类型。

HIV-1病毒感染T淋巴细胞，除了需要CD4分子作为受体外，还需要 CCR5和CXCR4等的一些分子作为辅助受体(coreceptor)，只有这些辅助受 体与CD4分子同时存在才能感染特异的CD4+T细胞。根据HIV-1需要的 辅助受体是CCR5或是CXCR4，把HIV-1又分为R5株和X4株，其中又以 需要辅助受体CCR5的R5株为多见，因此对CCR5的研究一直是一大热点。

CCR5是一种趋化因子受体，趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细 胞因子，其功能在于使细胞表面具有跨膜G蛋白偶联受体的细胞聚集在一 起，参与体内的免疫平衡作用。CCR5由352个氨基酸残基组成，分子量为 40.6kDa，大致可分为：胞外N末端，3个胞外环(EL1-3)，3个胞内环(IL1-3)， 7个跨膜α螺旋和胞内C末端构成。具有调控T细胞和单核巨噬细胞迁移、 增殖与免疫的功能，主要表达于T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等的细胞 膜上。

在CCR5基因中存在多种不同的基因多态性，其中CCR5-Δ32的基因 型有着十分重要的价值。CCR5-Δ32是指CCR5基因中发生了32个碱基的 缺失，即在CCR5基因编码区域第185位氨基酸密码子后的3317～3348位 置发生32个碱基丢失了，产生基因读码框架的错位，从而不能合成正常的 CCR5蛋白，在细胞膜上也就没有有功能的CCR5出现，HIV-1病毒就不能 感染宿主细胞。CCR5-Δ32包括纯合子和杂合子两种，纯合子是两个等位基 因的DNA链都发生了缺失，杂合子是两个等位基因中仅有一个等位基因的 CCR5 DNA链发生了丢失，另一个等位基因正常。但CCR5-Δ32缺失的个 体拥有正常的免疫功能，因此CCR5-Δ32仍划归在SNP（单核苷酸多态性） 的范围内。

携带CCR5-Δ32基因型者，感染HIV的几率大大降低，CCR5-Δ32能 够有效抵抗HIV-1的病毒感染以及延缓病情的恶化，使其疾病进展的速度 缓慢。纯合子CCR5-Δ32/Δ32的个体对HIV的感染有抗性，而杂合子 CCR5-+/Δ32的个体可显著的推迟艾滋病的发生。2009年国际著名期刊《新 英格兰医学杂志》杂志报道了一个轰动性的个案，一位艾滋病病人接受了 一位CCR5-Δ32基因型的骨髓移植，从而治愈了艾滋病，这是全球第一位 获得完全治愈的成功范例，具有里程碑式的意义。

从第一位艾滋病治愈的例子中，我们得到一个重要的启示，那就是在 人群中寻找和发现CCR5-Δ32基因型的携带者，然后获得他们的骨髓样品， 或者获得他们的外周血样品，通过目前的诱导干细胞技术（IPSC）获得可 供移植的干细胞，从而移植给其基因配型一致的艾滋病病人，达到治愈病 人的目的。但遗憾的是CCR5-Δ32在人群中的发生率不高，不同的种族有 不同的阳性率，在汉族人群中据有限的调查，报告其阳性率为0.119%，而 在欧洲白人中阳性率可在5-14%之间，在我国的新疆维吾尔族人群中阳性 率会在3.48%左右。因此要寻找和发现CCR5-Δ32基因型的携带者，必须对 大量人群进行筛选，这就要求筛查的方法技术具备简单、快速、价廉、准 确并易于在基层推广的特点。基于此，我们发明了如下的方法技术和大量 筛查的方案。

目前对基因突变的检测都离不开PCR技术。简单的说，PCR就是利用 DNA聚合酶对特定基因做体外的大量合成，通过DNA聚合酶对一对引物 间的DNA序列特异性的复制，可以将一段基因放大为原来的一百亿至一千 亿倍。主要通过变性、退火和延伸三个步骤，经30到40次的重复循环， 在2～3小时就能将待扩目的基因片段复制到成百上千亿倍。PCR反应中， 最重要的是引物的设计，它决定了扩增的成败和扩增片段的特异性，理论 上讲，一个引物只能结合到DNA的特定位置，一对引物只能扩增出一个特 定的基因片段。

在常规定性的PCR方法基础上，科学家又发明出定量的PCR技术，其 主要是通过在PCR反应体系中加入了荧光分子，根据PCR过程中荧光分子 发出的荧光强弱，可以反映出基因片段的扩增情况，从而直接判断PCR的 结果，这一方法就是所谓的荧光定量PCR技术。该技术又根据加入的是荧 光染料还是同样的荧光探针分成两类，荧光染料如SYBR Green等，在PCR 过程中能与双链DNA分子结合发光，通过这一特性来指示扩增产物的增 加，优点是无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低，能适用于任何 一款定量PCR仪，缺点是有非特异性扩增时，不能区别，导致检测的特异 性降低，出现假阳性的结果。荧光探针主要为Taqman探针，该探针是一段 特异序列的寡核苷酸，一般是待扩增片段之内的序列，该探针两端分别标 记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的 荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延 伸阶段），Taq酶的5′-3'切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步，这也是定量的基础所在。由于多加入了一条特异性探针，使 得其扩增特异性大幅度提高，保证了检测的可靠性，从而该方法已成为临 床分子检测的主要手段。无论是荧光染料法PCR还是荧光Taqman探针法， 它们都需要荧光PCR仪，其过程是全封闭检测，无需PCR后处理，有效杜 绝了PCR产物导致的假阳性问题，这是该方法的最大优点。

目前检测CCR5-Δ32基因型的方法大致有以下几种：限制性片段长度 多态性(RFLP)技术、直接测序法及对PCR扩增片段电泳判断长度等方法。

限制性片段长度多态性是利用限制性内切酶能特异识别DNA分子的 特定序列，并切开DNA双链分子，产生长短不一的限制性DNA片段， CCR5-Δ32基因型和CCR5野生型间存在不同的内切酶识别位点，根据这些 差异用不同的限制性内切酶切割，结果将会产生不同大小的酶切片段，通 过电泳即可鉴定出不同的基因型别，该方法虽不需要昂贵的仪器，但存在 操作复杂，周期长，需要DNA量大，容易发生PCR产物的污染，以及分 析速度慢，不适合对大规模标本的筛查工作等缺点。

通过检测PCR扩增片段长度来检测CCR5基因型，是根据在围绕 CCR5-Δ32位点设计引物，其PCR产物片段大小会因CCR5-Δ32基因型和 CCR5野生型间相差32nt，通过电泳区分出不同的基因型，中国专利CN 102321737A报告了类似的方法。虽然该方法省去了限制性内切酶，但仍然 存在容易发生PCR产物的污染，以及分析速度慢，不适合对大规模标本的 筛查工作等缺点。

直接测序法是目前鉴定基因型别的标准方法，在围绕CCR5-Δ32断裂 点的周围，设计一对PCR扩增引物，通过对待检标本的PCR扩增，得到 PCR片段，再对这一片断纯化后直接测序，或将PCR片断克隆至质粒中， 对质粒进行测序。但该方法需要昂贵的仪器，在基层不易实行，同时还存 在操作复杂，周期长，以及分析速度慢，容易发生PCR产物的污染，不适 合对大规模标本的初筛等缺点。

发明内容

本发明根据大规模筛查CCR5-Δ32基因型的实际情况，建立了一种大 规模快速、简便、价廉而又准确筛查CCR5-Δ32基因型的方法。该方法通 过荧光PCR直接判断有无曲线增长或观察荧光PCR后的溶解曲线，就能判 断是否存在CCR5-Δ32基因型，以及该基因型是否是纯合子或杂合子，从 标本加样到完成荧光PCR反应及结果判断，在1个半小时内完成，同时避 免了PCR方法最大的缺点，即产物的污染问题，使得结果更准确可信，因 此该方法非常适合对标本的大规模初筛。同时可以采用初筛和复查相结合 的策略，既在初筛的基础上，可对疑似CCR5-Δ32基因的标本，进行测序 验证，从而保证结果的可靠性。该方法具有快速、准确、简单、成本低、 能大规模进行筛选的优点，有利于基层现场的使用和推广。

本发明具体提供了大规模筛查CCR5-Δ32基因型的引物，其特征在于， 包括针对筛查CCR5-Δ32基因型设计的五组特异性PCR引物，具体为：

第一组：用于荧光染料PCR溶解曲线分析法筛查CCR5-Δ32基因型的 两条引物，序列为SEQ ID No：1和SEQ ID NO：2；

第二组：用于构建CCR5-Δ32基因型阳性质粒的快速突变基因位点引 物，序列为SEQ ID No：3和SEQ ID NO：4；

第三组：用于荧光染料PCR法直接筛查CCR5-Δ32基因型的四条引物， 序列为SEQ ID No：5、7、9和11；

第四组：用于Taqman探针荧光PCR法筛查CCR5-Δ32基因型的Taqman 探针，序列为SEQ ID No：12；

第五组：用于DNA测序法筛查CCR5-Δ32基因型的引物，序列为SEQ  ID No：13。

本发明还提供了一种大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法，其特征在 于，采用荧光染料PCR溶解曲线分析法实现CCR5-Δ32基因型的初步筛查， 步骤如下：

（1）、标本采集；

（2）、标本DNA提取、保存；

（3）、PCR扩增：用于染料法荧光PCR扩增的引物为一对围绕 CCR5-Δ32区域的特异性引物，分别为正向引物SEQ ID No：1和反向引物 SEQ ID NO：2；

（4）、溶解曲线分析：扩增后加上溶解曲线分析程序进行溶解曲线的 分析，其中标本的溶解温度在76.0-78.0℃之间的是纯合野生型（不同的荧 光定量PCR仪得出的溶解温度可不同），溶解温度在73.0-75.0℃之间的是 纯合CCR5-Δ32基因型（不同的荧光定量PCR仪得出的溶解温度可不同）， 如标本的溶解曲线出现两个峰值，溶解温度分别在纯合野生型和纯合 CCR5-Δ32基因型的温度范围内，则该标本为CCR5-Δ32杂合基因型。由于 CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型溶解温度相差2-3℃，在曲线分析上极易 区分，使结果判断变得容易和准确。

标本的采集可来自于无创性的收集，如收集口腔脱落细胞或尿液脱落 细胞，也可采集于外周血的有核细胞。收集好的标本可以直接进入下一步 骤作DNA的提取，也可以放置于-20℃备用。

用常规方法提取标本基因组DNA，如用天根公司或Qiagen公司的基因 组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)，提取步骤按说明书进行。 制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度后，可直接用于检测，也 可保存于-20℃备用。

由于扩增片段的长短会明显影响溶解曲线的位置，片段越短，两条长 度不一的PCR片段，在溶解曲线的位置上越容易区别。因此我们使设计出 的这一对引物其扩增的片段长度尽可能的短，分别为CCR5野生型82bp、 CCR5-Δ32基因型50bp。

为了在分析结果时有不同基因型的阳性对照作为参考，我们在荧光 PCR扩增之前要构建CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型的阳性质粒，由于 人群中大部分人均为CCR5野生型，因此采用引物SEQ ID No：1和2对 正常人的DNA进行PCR扩增，在常规的PCR条件下，得到82bp的反应 产物，其产物直接通过TA克隆的方式，获得CCR5野生型阳性质粒，（可 采用美国Life公司的pCR2.0TOPO T载体，按其操作说明进行TA克隆）；

CCR5-Δ32基因型：采用一对快速突变基因位点的引物将CCR5野生型 质粒直接转变成CCR5-Δ32基因型，引物的序列为SEQ ID No：3和SEQ ID  No：4；（可以按照美国Stratagene公司定点快速突变试剂盒提供的试剂和 方法，进行CCR5-Δ32基因型阳性质粒的构建）。

完成CCR5-Δ32基因型阳性质粒的构建后，均作测序验证，然后进行 上述步骤（3）和步骤（4）的操作，其中，在进行溶解曲线分析时，标本 的溶解温度与CCR5野生型阳性质粒相同的是纯合野生型，溶解温度与 CCR5-Δ32基因型阳性质粒相同的是纯合CCR5-Δ32基因型，如标本的溶解 曲线出现两个峰值，溶解温度分别与CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型阳 性质粒相同，则该标本为CCR5-Δ32杂合基因型。

本发明所述大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法，其特征在于：

PCR反应体系为：20μl PCR反应体系中加入10μl的2X定量PCR预混 液，两条特异性PCR引物均为10μM，模板DNA10-100ng，其余为水；其 中所用荧光染料为SYBR Green、Evagreen、Super Green或LC Green中的 任意一种，优选SYBR Green；

优化后的PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃ 退火及延伸30s，共40个循环。

由于一些医院不具备有溶解曲线分析功能PCR仪，本发明还提供了一 种无需溶解曲线分析的大规模筛查CCR5-Δ32基因型方法，其特征在于， 采用荧光染料PCR法直接实现CCR5-Δ32基因型的筛查，步骤如下：

（1）、标本采集；

（2）、标本DNA提取、保存；

（3）、PCR扩增：用三条引物进行染料法荧光PCR扩增，它们分别是： 共同的反向引物，序列为SEQ ID No：5；野生型CCR5正向引物，序列为 SEQ ID No：7或SEQ ID No：9；和CCR5-Δ32基因型正向引物，序列为 SEQ ID No：11；这三条引物按正反向引物两两配对，分别配成两个独立的 反应管，加入荧光染料，再将同一标本分别加入这两个反应管中，放置于 荧光PCR仪中进行反应；

（4）、结果分析：用有无扩增曲线来直接判断是否为CCR5-Δ32基因 型，仅野生型引物的反应管有扩增，即为CCR5野生型，仅有CCR5-Δ32 型引物的反应管有扩增，即为CCR5-Δ32纯合型，两个管均有扩增，则为 CCR5-Δ32杂合型，两个管均无扩增，表明PCR扩增失败，待检查PCR 体系和DNA样本的质量后，重做PCR。

为提高效率和避免操作出错，最好预先把两两配对的引物分别包被固 化至两个反应管中，并做好标记。

该方法同样可以作为进一步保障筛查结果可靠性的复查方法。

CCR5-Δ32基因型缺失的32个连续核苷酸序列为SEQ ID No：6，本 发明提供的野生型正向引物SEQ ID No：7位于缺失的32个核苷酸内，该 引物与共同的反向引物配对时，由于CCR5-Δ32基因型丢失了这一片段， 因此存在CCR5-Δ32基因型时该引物不能与模板DNA杂交，扩增不能进 行，只有CCR5野生型，引物才能与模板DNA杂交，扩增才能完成，结 果可见有“Ｓ”型的曲线产生，见图3。与此相似，我们还设计了另一条野 生型的正向引物SEQ ID No：9，也能达到相同的效果，其特征为引物的3’ 端一半位于缺失32个核苷酸序列的5’端内，另一半位于缺失的32个核苷 酸序列内部，由于CCR5-Δ32基因型的丢失，该引物不能同CCR5-Δ32基 因型的序列互补杂交，扩增不能完成，该引物只能同CCR5野生型模板 DNA杂交，才能成功扩增，CCR5野生型DNA序列为SEQ ID No：8。

CCR5-Δ32基因型正向引物的一半位于缺失32个核苷酸序列的5’端， 另一半位于缺失32个核苷酸后的序列3’端，该引物横跨32个核苷酸缺失 序列，只有当CCR5-Δ32发生时，才有这一序列的存在，因此当其与同共 用的反向引物配对时，CCR5-Δ32基因型正向引物只能与CCR5-Δ32基因 型的DNA模板杂交，扩增出CCR5-Δ32基因型的PCR片段。CCR5-Δ32 基因型的基因序列为SEQ ID No：10。

由于荧光染料PCR法依然存在假阳性的可能，为保障检测的准确程度 和可靠性，我们还设计了一条Taqman探针，其位于两条正向引物与反向引 物之间，因此该探针是共用探针，与荧光染料PCR法的区别在于，在配制 反应混合液时，用荧光探针替代荧光染料来进行PCR扩增，即采用Taqman 探针荧光PCR法筛查CCR5-Δ32基因型，所述探针是SEQ ID No：12，序 列为5’－CTGGTCCTGCCGCTGCTTGTC－3’，其中5’端的荧光报告基团 是FAM、HEX、JOE、TET或VIC中的任意一种，3’端的荧光淬灭基团是 TAMRA、BHQ-1（Black Hole Quencher-1）或Iowa Black中的任意一种， 结果分析与荧光染料PCR法相同。

本发明还提供了一种大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法，其特征在 于，采用DNA测序法筛查CCR5-Δ32基因型，所用两条引物的序列为SEQ  ID No：13和SEQ ID NO：5；其扩增后的片段经2.5%凝胶电泳，割胶纯化 后可直接测序。

为了保证结果的可靠性，可以采用初筛和复查相结合的策略，既在初 筛的基础上，可对疑似CCR5-Δ32基因的标本进行复查，其特征在于，步 骤如下：

（1）、标本采集；

（2）、标本DNA提取、保存；

（3）、按照权利要求3所述方法构建CCR5野生型和CCR5-Δ32基因 型的阳性质粒；

（4）、按照权利要求3所述方法对CCR5-Δ32基因型进行初筛，收集 结果为阳性的标本进行下一步验证；

（5）、按照权利要求5所述方法对CCR5-Δ32基因型进行进一步筛选， 收集结果为阳性的标本进行下一步验证；

（6）、按照权利要求6所述方法对CCR5-Δ32基因型进行进一步筛选， 收集结果为阳性的标本进行下一步验证；

（7）、按照权利要求7所述方法对CCR5-Δ32基因型进行最终筛选。

本发明提供的荧光染料PCR溶解曲线分析法能够大规模、快速、简便、 价廉而又准确的筛查CCR5-Δ32基因型；且提供了一步构建CCR5-Δ32基 因型质粒阳性对照组的方法，方便快速；同时还提供了具有比荧光染料PCR 溶解曲线分析法更高特异性的荧光染料PCR法以及Taqman探针荧光PCR 法，为方便操作预先把引物探针固化至反应管中，避免了操作中出现混乱 和错误的可能；并且优化了PCR反应条件，使得整个反应能在极短的时间 内完成，保证了方法的快速性；还提供了重新设计的扩增和测序引物，使 得直接对PCR产物进行测序更有保障。最后提供了初筛和复查相结合的策 略，在快速筛查的同时，保证了结果的可靠性。

附图说明

图1阳性质粒测序验证结果图；

图2溶解曲线图；

图3Ｔaqman探针或荧光染料PCR法直接检测CCR5纯合型结果图；

图4Ｔaqman探针或荧光染料PCR法直接检测CCR5杂合型结果图

图5对多个样本的检测结果图。

具体实施方式

下面根据实施案例对本发明作进一步描述：

实施例1

制备CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型阳性质粒：

实验步骤如下：

1)用国内天根公司或Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基 因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分 光光度计测定浓度，将其浓度调整到50ng/μl，保存于-20℃，或直接进行下 面的反应。

PCR扩增体系：12.5μl的2X PCR Master Mix(Fermentas)，正向引物 SEQ ID No：1为10μM，反向引物SEQ ID No：2为10μM，基因组50ng， 加水至总体积25μl。

PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火及延 伸30s，总共35个循环，最后72℃10min DNA，取15μl反应产物，进行 浓度2.5%的凝胶电泳，电泳结束后观察，可在82bp处见一条清晰的条带， 采用美国Life公司的pCR2.0TOPO T载体，按其操作说明，通过TA克隆 的方式，获得CCR5野生型阳性质粒，测序证明样本为CCR5野生型，测 序结果如图1所示。

2)在此基础上，我们设计一对快速突变基因位点的引物，将CCR5野 生型直接转变成CCR5-Δ32基因型，引物的序列如下：

SEQ ID No：3

5’－CAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCATCTTGGG－3’

SEQ ID No：4

5’－CCCAAGATGACTATCTTTAATGTATGGAAAATGAGAGCTG－3’

按照美国Stratagene公司定点快速突变试剂盒提供的试剂和方法，完 成CCR5-Δ32基因型阳性质粒的构建，具体操作按说明书进行，所得到的 质粒均作测序验证，见图1，如图中所示，证明我们按预计分别得到了两种 阳性质粒。

实施例2

用荧光染料PCR加溶解曲线分析法对大规模的口腔脱落细胞标本进行 CCR5-Δ32基因型筛选：

采用富科海科技苏州有限公司一次性可脫落细胞取样棒收集口腔脱落 细胞。

将收集好的细胞用国内天根公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因 组DNA，操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度 计测定浓度后，可直接用于下列检测，也可保存于-20℃备用。

本实施例采用96孔反应板对提取好的DNA进行检测，其中设定一孔 为阴性对照，两孔分别为CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型阳性质粒对照， 其余的93个孔，均为待检测的标本。根据标本数量可调整反应管的数量， 可用8连管或单管，但无论用什么管，其中均要包括阴性对照和两种阳性 质粒对照三个反应管。

荧光PCR的实现：在体积为20μl PCR反应体系中加入10μl的2X  SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(Fermentas)，两条特异性PCR引 物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2均为10μM，模板为50ng，加水补足至20μl。

PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火及延伸30s， 共40个循环，然后加上溶解曲线分析程序，反应结束后，在定量分析的界 面上，获得一特定的Cq值，表明CCR5基因成功得到扩增，如没有曲线增 长，要考虑标本质量问题，要重提标本DNA。

在分析溶解曲线的界面上，我们设定的两个阳性对照分别有特定的溶 解温度，CCR5野生型的溶解温度为77.3℃，而CCR5-Δ32基因型溶解温度 为74.6℃，在同一个管中仅出现一个峰，则为纯合子基因型，与CCR5野 生型溶解温度相符的就为CCR5野生型纯合子，与CCR5-Δ32基因型溶解 温度相符的就为CCR5-Δ32纯合子基因型，如同一个管标本的溶解曲线出 现两个峰值，溶解温度分别是野生型的77.3℃，和CCR5-Δ32基因型的 74.6℃，则该标本为CCR5-Δ32杂合基因型，见图2；对多个样本的检测结 果见图5，除CCR5-Δ32基因型阳性质粒对照有74.6℃峰值曲线外，其余均 峰值在77.3℃，表明样本无CCR5-Δ32基因型，均为CCR5野生型。如溶 解温度与上述都不相符，则为非特异性扩增，对这样的标本需要采用Taqmqn 探针方法重作。

实施例3

用荧光染料PCR加溶解曲线分析法对大规模的外周血标本进行 CCR5-Δ32基因型筛选

使用EDTA抗凝管，采集外周血标本3ml，用Qiagen公司的外周血基 因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)，提取基因组DNA， 具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定 浓度后，可直接用于检测，也可保存于-20℃备用。荧光PCR的实现及结果 的分析判断均同实施例2所述。

实施例4

采用荧光染料PCR结果直接分析法，在实施例3的基础上对标本进行 进一步验证

每个标本使用两个反应管，两个管之间区别仅为引物配对的不同，其 中一管为野生型正向引物和共同的反向引物配对，即引物SEQ ID No.5和 SEQ ID No.7配对，另一管为CCR5-Δ32基因型正向引物和共同的反向引物 配对，即引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.11配对，引物浓度均为10μM， 为了方便起见，将这些引物分别提前固化至PCR反应管中。在体积为20μl  PCR反应体系中加入10μl的2X SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Fermentas)，在对应的两个已含有引物的反应管中加入相同标本的DNA模 板50ng，加水补足至20μl。同时设定阴性对照、CCR5野生型和CCR5-Δ32 基因型阳性质粒对照。

PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火及延伸30s， 共40个循环，反应结束后，在定量分析的界面上，在同一标本的两管反应 中，哪一管有曲线增长，就为哪一种基因型，野生型正向引物管有扩增即 为野生型，CCR5-Δ32基因型正向引物管有扩增即为CCR5-Δ32基因型。如 均无扩增，则要考虑标本质量问题，要重提标本DNA。反应结果见图3和 4。

实施例5

采用荧光染料PCR结果直接分析法，对标本进行CCR5-Δ32基因型筛 查

标本的采集、DNA的提取同实施例2。每个标本使用两个反应管，两 个管之间区别仅为引物配对的不同，其中一管为野生型正向引物和共同的 反向引物配对，即引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.9配对，另一管为 CCR5-Δ32基因型正向引物和共同的反向引物配对，即引物SEQ ID No.5和 SEQ ID No.11配对，引物浓度均为10μM，为了方便起见，将这些引物分别 提前固化至PCR反应管中。在体积为20μl PCR反应体系中加入10μl的 2X SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(Fermentas)，在对应的两个已 含有引物的反应管中加入相同标本的DNA模板50ng，加水补足至20μl。 同时设定阴性对照、CCR5野生型和CCR5-Δ32基因型阳性质粒对照。

PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火及延伸30s， 共40个循环，反应结束后，在定量分析的界面上，在同一标本的两管反应 中，哪一管有曲线增长，就为哪一种基因型，野生型正向引物管有扩增即 为野生型，CCR5-Δ32基因型正向引物管有扩增即为CCR5-Δ32基因型。如 均无扩增，则要考虑标本质量问题，要重提标本DNA。

实施例6

采用Taqman探针荧光PCR法，对标本进行CCR5-Δ32基因型筛查

引物的配制和预包被同实施例4，在体积为20μl PCR反应体系中加入 10μl 2XPCR Master Mix(Fermentas)和2μM的Taqman探针，再加入模板 50ng，加水补足至20μl，每个标本依然加入两个对应的反应管中。PCR反 应条件及结果的分析判断同实施例4。由于探针再一次识别靶DNA，特异 性得到加强，对有非特异性扩增的标本，尤其适合用这一方法筛选。

实施例7

对可疑标本进行DNA直接测序法作进一步验证

在体积为100μl PCR反应体系中加入50μl的2XPCR Master Mix (Fermentas)，两条特异性PCR引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.13（共同的 反向引物和测序引物）均为10μM，模板DNA100ng，加水补足至100μl。

PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火及延伸60s， 共40个循环，反应结束后，将PCR产物，完全上样于2.5%的凝胶中，电 泳后割胶纯化，采用Qiagen公司割胶纯化试剂盒，操作按说明进行，然后 做测序，从测序结果就可清晰判断是否存在CCR5-Δ32基因型。见图1。

为方便起见，我们在实验中采用的是Fermentas公司2XPCR定性和带 荧光染料的定量试剂，实际上其它公司的类似PCR试剂或实验室自行配制 的PCR反应试剂，都能达到相似的效果。PCR反应体积可以根据需要增加 或减少，同样可以获得相同的结果。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此 项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明 的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>沈阳优吉诺生物科技有限公司

<120>大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物

<130>K.Allers，G.Hutter，J.Hofmann，C.Loddenkemper，K.Rieger， E.Thiel，T.Schneider，Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Δ32/Δ32 stem cell transplantation.Blood.117，279(2011).

<160>13

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

cctgcagctc tcattttcca                                                   20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

ccagccccaa gatgactatc                                                   20

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

cagctctcat tttccataca ttaaagatag tcatcttggg                             40

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

cccaagatga ctatctttaa tgtatggaaa atgagagctg                             40

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

ggattcccga gtagcagatg                                                   20

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

gtcagtatca attctggaag aatttccaga ca                                     32

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

gtcagtatca attctggaag aatttc                                             26

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

attacacctg cagctctcat tttccataca gtcagtatca attctggaag aatttc            56

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

ctcattttcc atacagtcag tatc                                               24

<210>10

<211>50

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

attacacctg cagctctcat tttccataca ttaaagatag tcatcttggg                   50

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

ctcattttcc atacattaaa gatag                                              25

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

ctggtcctgc cgctgcttgt c                                                  21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

ggggtggtga caagtgtgat c                                                  21