单纯疱疹病毒2型HSV2检测试剂盒

摘要

本发明提供一种单纯疱疹病毒2型（HSV2）检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化钾20～300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。本发明试剂盒检测HSV2的灵敏度可达400copies/ml，检测线性范围为400～4.00E+10copies/ml；应用该试剂盒可以对生殖道分泌物等未知样本中的HSV2-DNA进行快速准确的检测，为诊断单纯疱疹病毒2型感染提供可靠的实验依据。

说明书

技术领域

本发明提供一种单纯疱疹病毒2型（HSV2）检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的HSV2-DNA检测试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex vires，HSV)是一种有包膜的线型双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，疱疹病毒属，是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的常见病原体，人类是它的唯一自然宿主。根据血清学、流行病学的研究，HSV可分为1型单纯疱疹病毒（HSV-1）和2型单纯疱疹病毒（HSV-2）。HSV-1主要引起眼、口、唇的皮肤和粘膜以及中枢神经系统的感染，产生疱疹性脑炎，疱疹性角膜炎等；HSV-2主要感染外生殖器部位的皮肤粘膜，引起生殖器疱疹（Genital herpes,GH）。

西方国家的GH流行病学调查显示，在性传播性疾病（Sexually Transmited Disease，STD）中GH的发病率越来越高，在全球范围每年约有八千六百万的患者，仅次于非淋病性尿道炎（宫颈炎）和淋病而居第三位。在国内情况也不容乐观，2002年全国STD流行病学调查结果显示，随着人们性行为的改变，STD流行谱在发生变化，GH的发病逐年呈上升趋势。在孕妇中GH的感染率也呈现上升的态势，随着孕妇HSV-2感染率升高，新生儿疱疹的发生率亦在上升。因此最有效的预防措施是开发灵敏、快速、准确的实验室诊断技术，提高无症状GH妊娠妇女的筛查水平，在妊娠早期及晚期及时准确地诊断这类感染者，并采取积极防治措施，降低胎儿及新生儿的感染率，这对促进优生优育、提高人口出生质量具有重要的实际意义。

目前生殖器疱疹的实验室诊断方法主要有细胞培养法、血清学方法、基于PCR技术的检测方法等。细胞培养法的敏感性和特异性均较高，是临床诊断和鉴定HSV感染最为可靠的方法，但此方法对无症状病毒排放、早期皮损及结痂性皮损中的HSV检出敏感性差，培养所需时间长，而且其实验室环境及操作均要求严格，在临床实验室不易普及。血清学方法检测血清中的抗体，适用于潜伏期、无症状或皮疹不典型的病人及流行病学调查；包括型特异性血清抗体检测、间接免疫荧光法（IIF）、免疫印迹法、ELISA法、竞争性ELISA法及SIA等方法，其操作简单，有商品化试剂盒，适合于临床辅助检查诊断及流行病学调查，缺点是无统一的标准。近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。

定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用煮沸法对单纯疱疹病毒2型的核酸进行提取，具体是先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污；另外，对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，能看到沉淀是因为该步骤将病毒与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的则使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。

临床上检测HSV2-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术检测HSV2-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在500~1000copies/ml左右；另外，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。

发明内容

本发明提供一种核酸释放剂在单纯疱疹病毒2型HSV2检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。

在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在单纯疱疹病毒2型HSV2检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该病毒检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。

本发明提供一种单纯疱疹病毒2型HSV2检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。

使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测单纯疱疹病毒2型HSV2的灵敏度可达400copies/ml，检测线性范围为400~4.00E+10copies/ml。

具体地，所述用于靶多核苷酸探针的序列为5’-TCGTCTGCGCCAAATACGCCTTAGC-3’；优选用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物序列分别为：5’-CATCGCGTATCACGGCATG-3’和5’-GCTGAATGTGGTAAACACGCTTC-3’。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。

本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本发明中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且优选内标探针的序列为5'-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3'。

优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5~2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括HSV2阳性对照、HSV2阴性对照和HSV2定量参考品。

本发明还提供一种单纯疱疹病毒2型检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物序列分别为5’-CATCGCGTATCACGGCATG-3’和5’-GCTGAATGTGGTA AACACGCTTC-3’。

本发明又提供一种单纯疱疹病毒2型检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5’-TCGTCTGCGCCAAATACGCCTTAGC-3’。

本发明还具体提供一种单纯疱疹病毒2型检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂、PCR反应液、内标、酶混合液、HSV2阳性对照、HSV2阴性对照和HSV2定量参考品；且所述核酸释放剂中包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%，乙醇0.05~1%和溶剂TE缓冲液；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，用于内标扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，10×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP；所述内标为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

本发明提供的HSV2荧光PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对生殖道分泌物等未知样本中的HSV2-DNA进行快速准确的检测，为诊断单纯疱疹病毒2型感染提供可靠的实验依据。其检测结果可用于HSV2感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为性病的早期诊断以及性病高危人群的初筛提供分子诊断依据。

附图说明

图1中①为实施例中单纯疱疹病毒2型HSV2-DNA检测结果为阳性的待测样本的扩增曲线，图1中②为实施例中HSV2-DNA检测结果为阴性的待测样本的扩增曲线。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1

本实施例提供一种具体的单纯疱疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒，它包括如下组分：

①核酸释放剂：包含莎梵婷（surfactin）0.1mM/L，氯化钾100mM/L，十二烷基磺酸钠（SDS）0.1%，0.1%的乙醇。

②内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为5.00E+05copies/ml，97碱基对的序列为：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。

③PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为0.3μmol/L，用于靶多核苷酸检测的探针为0.3μmol/L，用于内标片段扩增的上下游引物均为0.3μmol/L，用于检测内标的探针为0.1μmol/L。其中，所述10×PCR反应缓冲液为包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于单纯疱疹病毒2型核酸的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为：上游引物：5’-CATCGCGTATCACGG CATG-3’；下游引物：5’-GCTGAATGTGGTAAACACGCTTC-3’；探针：5’-TCGTCTGCGCCAAATACGCCTTAGC-3’；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：上游引物：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’；下游引物：5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3’；探针：5'-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3'。

④酶混合液：包含5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。

⑤HSV2定量参考品：来源于使用HSV-2企业定量线性参考品L1~L5定值后的HSV-2强阳性质粒，该单纯疱疹病毒2型定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为4.00E+07copies/ml（A）、4.00E+06copies/ml（B）、4.00E+05copies/ml（C）、4.00E+04copies/ml（D）。

⑥HSV2阳性对照：为临床医院收集的HSV2强阳性样本，其浓度为4.00E+05copies/ml。

⑦HSV2阴性对照：不含有单纯疱疹病毒、沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌以及人乳头瘤病毒等的灭活阴性临床样本。

实施例2

本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测生殖道分泌物等未知样本中HSV2-DNA的操作步骤：

一、试剂准备

根据待测样本、HSV2阴性对照、HSV2阳性对照以及HSV2定量参考品A~D的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）及内标1.0μl/人份，充分混匀成PCR-mix，例如待测样本为3人份时，一共需配制9人份（上述四者的人份数分别为3、1、1和4）的PCR-mix；瞬时离心后备用。

二、样本处理

1.方法A：样本直接快速核酸释放

每个PCR反应管中加入核酸释放剂2～5μl（建议深吸浅打，避免出现气泡），各管依次加入待测样本、HSV2阴性对照、HSV2阳性对照及HSV2定量参考品A~D各3~5μl，吸打3~5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）；间隔10分钟以上，每管加入PCR-mix40~45μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30秒。

2.方法B：样本经高速离心浓缩后核酸释放

取200~500μl待测样本，13,000rpm离心5分钟后吸弃上清，加入20~50μl核酸释放剂，静置10分钟后，备用；每个PCR反应管加入上述经预处理的待测样本、HSV2阴性对照、HSV2阳性对照及HSV2定量参考品A~D各5~10μl；每个PCR反应管加入PCR-mix40~45μl，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30秒。

三、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测HSV2；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标；参比荧光（Passive Reference）设置为none。

3）荧光定量PCR反应条件见表1：

表1

4）结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。对于测定Ct值≤39（Ct值＞0）的样本，报告为HSV2-DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型，如图1中的①；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为HSV2-DNA阴性，此时待测样本扩增曲线平直，如图1中的②；对于测定Ct值>39的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为低于检测下限。若内标Ct值>39或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

使用本发明中试剂盒的特异性试验表明，其与常见性病病原体HPV、NG、CT、UU等均无交叉反应，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。

使用本发明中试剂盒检测企业工作参考品的阴阳性符合率为100%，定量线性参考品、灵敏度参考品的检测结果符合质量标准；精密度试验表明批内和批间重复性好，其Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。使用本发明中试剂盒对临床样本的检测试验表明，该试剂盒的检测线性范围为400～4.00E+10copies/ml，检测下限即灵敏度为400copies/ml。