单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌

摘要

本发明涉及单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物作用的人工序列，本发明也涉及该细菌的用途、以及用于定性地和/或定量地检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的样品中的存在的方法和试剂盒。

说明书

本发明涉及单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物作用的人工序列，本发明也涉及该细菌的用途、以及用于定性地和/或定量地检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的样品中的存在的方法和试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌是一种致病性的革兰氏阳性细菌。因为造成利斯特菌病，它是最致命的食物传播的病原体之一。

诸如食物样品或临床样品（如血液、组织或粪便）等样品中的病原体的检测，日益变得重要。但是，为了清楚地鉴别和任选地定量在样品中包含的细胞，必须提供用于它们的检测和定量的可靠方法。

自聚合酶链式反应(PCR)的首次实现以来，该分子生物学工具已经发展成为改进的微生物检测提供许多机会的方法。

基于PCR的方法要变成国际公认标准的一个重要的必要条件是，内部扩增对照物(IAC)。IAC是存在于同一样品试管中的非靶物DNA序列，其与靶序列同时共同扩增。在没有IAC的PCR中，阴性结果是不确定的，因为它可以表示，没有靶序列存在，但是也可以表示，扩增反应被各种因素抑制。因此，欧洲标准化委员会（European Standardization Committee）协同国际标准组织(International Standard Organisation, ISO)提出了诊断性PCR的一般指南，该指南要求IAC的存在(ISO/DIS 22174)。

IAC应当能够竞争使用相同的引物结合位点作为靶PCR，并在实时PCR中借助于使用的探针染料的长度和荧光波长可清楚地与靶DNA扩增子辨别开。总之，所述对照物的特征应当接近靶物的特征，尽管如此，还会确保对靶物检测的可忽略不计的干扰。

IAC在PCR试验中的应用，会确保阴性结果的可靠性；但是，仅仅对于在PCR中促进靶物扩增的酶反应而言，和对于以在实时PCR中使用荧光探针为基础的定量和确认检测反应而言，确实如此。但是，这类对照物没有覆盖最初的方法步骤（诸如样品制备和从样品基体中分离/纯化DNA），如果要覆盖的话，通过外部对照物进行检查。这没有考虑到单个样品的对照物，因而阴性结果暗示研究的样品（例如食物）的病原体状态的假验证的可能性。

因此，内部样品过程对照物(ISPC)是必要的，其应当覆盖使用常规或实时PCR对病原体进行可靠定量检测所必需的所有方法步骤。

就食物和水传播的RNA病毒的检测而言，已经报道了猫嵌杯样病毒和噬菌体MS2作为内部对照物的用途(Mattison等人(2009) Int. J. Food Microbiol. 132, 73-77; Di等人(2010) J. Virol. Methods 165, 57-63; Dreier等人(2005) J. Clin. Microbiol. 43, 4551-4557)。

Murphy等人(2007, Int. J. Food Microbiol. 120, 110-119)公开了一种细菌内部样品过程对照物，其用于检测单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）。该对照物是基于包括肠道沙门氏菌的绿荧光基因(gfp)片段和iroB基因片段的重组大肠杆菌菌株。所述对照物没有用于定量目的，作为基础的革兰氏阴性的大肠杆菌菌株在样品制备过程中会表现出与单核细胞增生李斯特菌相比不同的特征。

结果，需要新的可靠方法，所述方法允许通过实时PCR来检测和定量被污染样品中的病原体单核细胞增生李斯特菌。

已经意外地发现，通过使用IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株作为覆盖整个检测过程的内部过程对照物，可以解决该问题。

发明内容

因此，本发明的第一方面是单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物(IAC)作用的人工序列。

单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌是指，使用基因工程技术改变它的遗传物质而产生的单核细胞增生李斯特菌物种。遗传修饰包括插入和/或删除基因。例如，可以如在B?ckmann等人(1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653中所公开地，删除prfA基因。

转录因子PrfA的基因组基因座是指，编码蛋白PrfA的核酸序列。这是705碱基对的序列(Leimeister-W?chter等人, 1990; Proc Natl Acad Sci USA, 87, 8336-40; Glaser等人, 2001; Science, 294, 849-52)。该基因位于在单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素基因(lisA)(GeneID: 987031; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/987031#pageTop)周围的染色体区域内。关于转录因子PrfA的信息也参见：Scortti等人(2007) Microbes and Infection 9, 1196-1207，它通过引用并入本文。PrfA控制单核细胞增生李斯特菌的关键毒力决定簇的表达。PrfA是27 kDa的237残基蛋白。从基因组基因座中删除转录因子PrfA，会使该突变体成为非病原体。

根据本发明，内部扩增对照物(IAC)是指，在PCR反应过程中存在于样品试管中并与某些靶序列一起共扩增的人工核酸序列，正如Hoorfar等人(2003) Lett. Appl. Microbiol. 38, 79-80所定义的。IAC的存在，允许测定假阴性结果。所述IAC序列可以是任意多核苷酸序列。该序列的大小可以变化，这取决于具体的PCR试验及其反应条件。

所述IAC序列优选地是单拷贝核苷酸序列，即在单核细胞增生李斯特菌细菌的单倍体基因组中仅出现1次的核苷酸序列。

优选地，所述IAC序列是这样的序列：所述序列不存在于单核细胞增生李斯特菌或预期天然存在于待测样品中的任何其它物种中，也不存在于样品基体本身中。

优选地，所述IAC序列包括在5’和3’末端处的引物结合序列。

根据本发明，优选地，所述IAC是竞争性IAC，即在相同条件下，在同一PCR管中，在实时PCR过程中，遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌的IAC和野生型单核细胞增生李斯特菌的靶序列prfA用一组共同的引物进行扩增。

因此，所述IAC的引物结合序列特别优选地与野生型单核细胞增生李斯特菌的基因组prfA基因座的引物结合序列相同。

在本发明的一个非常特别优选的实施方案中，所述人工IAC序列是根据SEQ ID NO: 1的100 bp序列：

5′-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3′。

该IAC序列公开在Rossmanith等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771中。根据本发明，可以使用与SEQ ID NO: 1具有超过80% 同源性的IAC序列。优选地，所述序列同源性超过90%，更优选地超过95%。

根据本发明，如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株是优选的。

所述单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株是单核细胞增生李斯特菌血清变型1/2a临床制备物。该菌株是在科学应用中最普遍的模型生物体(GenBank: AL591978; Glaser等人(2001) Science 294 (5543), 849-52)。

本发明的另一个方面是遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，所述菌株包括SEQ ID NO:1的内部扩增对照序列(IAC)，并于2010年5月20日在DSM 23639下作为单核细胞增生李斯特菌ΔprfA/+IAC保藏在DSMZ （德意志微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig）)。

根据本发明的单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌满足对可靠内部样品过程对照物提出的要求。它与野生型单核细胞增生李斯特菌尽可能密切地相关。它不会干扰借助于实时PCR的主检测反应，用于检测所述对照物的基础化学反应的性能与所述主反应相同。另外，使用单核细胞增生李斯特菌细胞作为ISPC，允许覆盖在食物病原体检测中包括的必需方法的从样品制备至使用实时PCR进行检测的整个进程。

本发明的另一个方面是，如上指出的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌用于定性地和/或定量地检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的样品中的存在的用途。

优选地，所述样品是食物样品、体液（尤其是血液、血浆或血清）、水或组织样品。

示例性的样品包括、但不限于：食物（例如母牛、母羊、雌山羊、母马、驴、骆驼、牦牛、水牛和驯鹿的奶，乳制品，肉牛、山羊、羔羊的肉，羊肉，猪肉，蛙腿，小牛肉，啮齿动物，马，袋鼠，禽类包括鸡、火鸡、鸭、鹅、家鸽或野鸽、鸵鸟、鸸鹋，海鲜包括鱼类如鲑鱼和罗非鱼和贝类如软体动物和甲壳类动物和蜗牛，肉制品，植物产品，种子，来自禾本科植物的谷物包括玉米、小麦、大米、大麦、高粱和小米，来自非禾本科植物的谷物包括荞麦、苋菜红和奎藜籽，豆科植物包括豆类、花生、豌豆和扁豆，坚果包括杏仁、核桃、松子，油料种子包括向日葵、油菜和芝麻，蔬菜，如根菜类包括马铃薯、木薯和芜菁，叶菜类包括苋菜红、菠菜和羽衣甘蓝，海蔬菜类包括掌状红皮藻、昆布和dabberlocks，茎蔬菜包括竹笋、nopales和芦笋，开花蔬菜包括洋蓟、绿花椰菜、黄花莱，果实蔬菜类包括西葫芦、秋葵和茄子，水果，草药和香料），全血，尿，痰，唾液，羊水，血浆，血清，肺灌洗液和组织（包括、但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等）。技术人员会明白，从上述示例性样品中的任一种或所述示例性样品的混合物或包含一种或多种所述示例性样品的组合物得到的裂解物、提取物或(均质化的)材料，也是在本发明范围内的样品。

特别优选的是食物样品。

所述食物样品优选地是乳制品，优选奶，特别是生奶、奶粉、酸奶、奶酪或冰淇淋，鱼制品，优选生鱼，肉制品，优选生肉，肉灌制品或香肠，沙拉灌制品，巧克力，蛋或蛋制品如蛋黄酱。

在根据本发明的方法中使用的特别优选的食物样品是，通常已知会包含潜在致病性的单核细胞增生李斯特菌的样品，例如奶酪。

优选地，如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌被用作基于实时PCR的试验的内部样品过程对照物(ISPC)。

根据本发明，ISPC是在样品制备之前加入原始样品中的模型生物体。ISPC会提供从样品制备至靶分子检测的整个分析链的有效性的量度，并覆盖使用常规或实时PCR可靠地定量检测病原体所需的所有方法步骤。

本发明的另一个方面是，一种用于检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述致病性微生物污染的样品中的存在的方法，所述方法包括下述步骤：

(a) 向所述样品中加入预定量的如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌细菌的细胞，

(b) 用提取溶液温育所述样品，

(c) 通过标准方法，分离DNA；

(d) 应用实时PCR，其中使用：(i)对野生型单核细胞增生李斯特菌的基因组prfA基因座和如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌的IAC序列特异性的引物；和(ii)能够与所述prfA基因座特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针，和能够与所述IAC序列特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针，

(e) 定性地和/或定量地测定通过步骤(d)产生的荧光信号，和

(f) 从步骤(e)确定和/或计算野生型单核细胞增生李斯特菌细胞在疑似被所述微生物污染的原始样品中的存在和/或量。

在步骤(a)中，将预定量的如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌细菌的细胞加入样品中。加入样品中的量取决于样品大小。优选地，将25-100000 CFU (菌落形成单位)的量的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌加入例如25 g样品中。特别优选的是，100-5000 CFU/25 g的量。

菌落形成单位(CFU)是样品中的活细胞的量度。它可以通过培养方法来测定，例如通过将样品均匀地铺展在细菌培养凝胶上。在适当培养条件下温育，会导致菌落形成。菌落的数目代表样品中的菌落形成单位的数目。或者，通过荧光染色的细胞的显微镜计数法，例如使用Live/Dead?BacLight?细菌生存力试剂盒(Molecular Probes, Willow Creek, OR, 美国)或相当的商业方法，可以测定细胞数。

在步骤(b)中使用的提取溶液是水溶液或缓冲溶液。它通常具有大于5且小于9、优选大于6且小于8、更优选在6.5至7.5之间的pH值。所述提取溶液可以额外包含最多20%的一种或多种水可混溶的有机溶剂。

可以在本发明方法中使用的缓冲液优选地选自：磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水缓冲液(TBS)和TRIS/EDTA (TE)。

在本发明的一个实施方案中，所述提取溶液另外包含MgCl₂和/或离子液体。所述MgCl₂如果存在的话，通常以0.05-3 M、优选0.1-2 M、更优选0.3-1 M的浓度存在。

在本发明的另一个实施方案中，所述提取溶液另外包含至少一种离液剂和至少一种去污剂。

所述离子液体如果存在的话，通常以0.5-20重量%、优选1-10重量%的浓度存在，这基于混合物的重量。所述离子液体可以是一种离子液体或2种或更多种离子液体的混合物。在一个优选的实施方案中，所述提取溶液包含MgCl₂或离子液体。

在本发明中使用的离子液体是由有机阳离子和通常无机的阴离子组成的离子物质。它们不含有任何中性分子，且通常具有低于373 K的熔点。关于离子液体的综述是，例如，R. Sheldon“Catalytic reactions in ionic liquids”, Chem. Commun., 2001, 2399-2407; M.J. Earle, K.R. Seddon“Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim“Ionische Flüssigkeiten–neue L?sungen für dieübergangsmetallkatalyse”[离子液体- 过渡金属催化的新颖溶液], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945; T. Welton“Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083或R. Hagiwara, Ya. Ito“Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227)。

一般而言，本领域技术人员已知的通式K⁺A^-的所有离子液体，尤其是可与水混溶的那些，适用于-根据本发明的方法中。

如果离子液体或MgCl₂存在的话，在另一个优选的实施方案中，所述提取溶液不包含去污剂，这意味着，不向所述提取溶液中加入阴离子型去污剂、两性离子型去污剂或非离子型去污剂，如十二烷基硫酸钠、CHAPS、Lutensol AO-7。

本文使用的术语“离液剂”表示这样的物质：所述物质造成蛋白或核酸的无序，例如，但不限于，在保持一级结构完整的同时，改变蛋白或核酸的二级、三级或四级结构。示例性的离液剂包括、但不限于：盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、硫氰酸钠(KSCN)、碘化钠、高氯酸钠、脲等等。离液剂和离液盐的描述可以参见，例如，K. Hamaguchi等人(Proc. Natl. Acad. Sci. (1962) 62:1129-1136)。

本文使用的术语“去污剂”表示，具有亲脂以及亲水(即两亲)特征的分子。根据本发明的去污剂可以包含，例如，脂肪酸残基和亲水的(例如阴离子的或阳离子的)部分。

此外，可能向所述提取溶液中加入一种或多种其它物质如去稳定剂或生物聚合物降解酶，所述酶有助于降解在特定样品中存在的物质。一个实例是，向包含大量胶原和/或淀粉的食物样品中加入淀粉降解酶。

所述温育通常在18℃至50℃之间、优选25℃至45℃之间、更优选30℃至42℃之间的温度进行。

通常用所述提取溶液温育样品10分钟至6小时、优选20分钟至1小时的时间。

为了促进样品的溶解，例如可以在用提取溶液温育之前，使用stomacher将所述样品匀浆化。当在温育过程中搅拌混合物时，会进一步支持和/或加速溶解。

其它提取方法可以参见例如：Brehm-Stecher等人(2009) Journal of Food Protection 72: 1774-1789。

根据本发明，在步骤(c)中分离出细菌材料的DNA。本领域已知的各种方法可以用于提取DNA，例如在下述文献中公开的方法：Sambrook等人(1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y。

一般而言，DNA提取包括细胞裂解和DNA纯化，所述纯化通过沉淀或对不同底物（例如二氧化硅）的特异性结合来实现。

细胞裂解可以通过标准方法来实现，例如通过酶促方法、珠方法、声处理、去污剂方法或它们的组合。优选地，采用去污剂方法。

适用于酶促细胞裂解的酶是，例如，溶菌酶、溶葡萄球菌酶、消解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶。

适用于细胞破碎的珠子是由玻璃、陶瓷、锆或钢制成。在将珠子加给细胞以后，搅拌或摇动所述混合物。例如可以用普通的实验室涡旋搅拌器进行搅拌，或在特殊设计的夹子中搅拌。

根据本发明，细胞裂解的另一种方法是声处理。该方法包括：将超声(通常20-50 kHz)应用在样品上。

基于去污剂的细胞裂解会导致在细胞周围的类脂屏障的破坏。合适的去污剂可以选自：非离子型去污剂、两性离子型去污剂和离子型去污剂，例如CHAPS、Triton?X或TWEEN?。

优选地，使用离子型去污剂。合适的离子型去污剂的一个实例是SDS。

除了去污剂的选择以外，最佳细胞裂解的其它重要考虑因素包括：缓冲液、pH、离子强度和温度：

裂解溶液通常具有大于5且小于9、优选大于6且小于8、更优选6.5和7.5的pH值。

可以使用的缓冲液优选地选自：磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水缓冲液(TBS)和TRIS/EDTA (TE)。

任选地，可以将一种或多种螯合剂加入裂解溶液中，以隔离二价阳离子。合适的螯合剂是，例如，EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇四乙酸)或乙二胺。优选地，使用EDTA。

上述的细胞裂解方法之后通常进行离心，以便从细胞物质中分离出DNA。技术人员可以容易地确定离心参数。通常，如在Sambrook等人(1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.中所公开地，进行离心。

在细胞裂解以后，通常通过加入醇（优选地乙醇或异丙醇）来沉淀DNA。

另外，所述DNA可以以下述形式提供：所述形式适合使用可商业得到的DNA分离试剂盒进行扩增，所述试剂盒诸如NucleoSpin?组织试剂盒和支持方案（用于革兰氏阳性细菌）(Machery-Nagel, Düren，德国)或Nexttec?试剂盒（用于来自细菌的基因组DNA）(Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen，德国)。

在本发明的另一个实施方案中，在步骤(c)中，在DNA分离之前，分离细菌材料。该额外步骤是特别优选的，因为它允许在得到的PCR样品中实现更高的DNA浓度。细菌材料的分离，可以通过任意已知的方法来实现，如离心、过滤、介电电泳和超声或亲和结合，例如使用抗体、凝集素、病毒结合蛋白、适体或抗微生物肽(AMP)，它们优选地固定化在珠子上。优选地通过过滤或离心，最优选地通过离心，分离细胞。当复杂的样品包含用本发明方法难以或不能提取的物质时，特别地需要过滤提取的样品。通常，这些物质包括淀粉和/或纤维。但是，从提取混合物中分离细胞的优选方法是离心。

根据样品基体，可以重复温育步骤1次或几次，例如2次、3次、4次、5次或10次。在这些温育步骤之间，可以通过例如离心，从上清液中分离细菌材料和残留的样品基体。

在分离细菌材料以后，优选地用水、缓冲溶液和/或含有去污剂的溶液洗涤细胞。所述洗涤步骤可以重复数次。

在步骤(d)中，应用PCR，优选实时PCR。实时PCR是一种用于检测和测量在每个PCR循环过程中产生的产物的方法，所述产物与PCR开始之前的模板核酸的量成比例。得到的信息，诸如扩增曲线，可以用于定量模板核酸序列的初始量。

所述检测优选地基于，在设定的温度，在每个循环中监测荧光。通常，使用光学装置来收集存在于样品中的特定荧光染料的特定激发和发射波长的数据，从而监测荧光。来自样品的荧光穿过用于检测在背景以上的荧光的阈值时的循环，称作循环阈值Ct，并允许定量起始模板。

PCR条件没有特别限制，但是可以为每个PCR装置选择最佳条件。例如，可以使用下述条件：

- 双链DNA向单链DNA的热变性：通常在约90-98℃、优选地在约92-96℃进行加热，通常持续约3秒至1分钟，优选地约30秒至1分钟。

- 退火：通常在约40-70℃、优选地在55-65℃进行加热，通常持续约5秒至2分钟，优选地约30秒至90秒。

- DNA延伸反应：通常在约60-75℃、优选地在约70-74℃进行加热，通常持续约10秒至3分钟，优选地约30秒至2分钟。

- 反应液中的Mg离子浓度：通常约1-5 mM，优选约1.5-3.5 mM。

该反应通常在约20-50个循环中、优选地在约45个循环中进行，由此可以将靶DNA扩增至可检测的水平。

可以使用任意商业的实时PCR装置。

根据本发明方法的步骤(d)(i)，使用对野生型单核细胞增生李斯特菌的基因组prfA基因座和如上定义的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌的IAC序列特异性的引物。

一般而言，术语“引物”表示短核酸分子，诸如长度为9个或更多个核苷酸的DNA寡核苷酸，其与沿着靶核酸（即基因组prfA基因座和IAC序列）的一条链的一个区段互补，其中引物的目的是启动沿着所述链的更长核酸的核酸复制。根据本发明，15-40个核苷酸的引物是优选的。在本发明中，术语“引物”用于表示侧接要扩增的靶序列的引物对。

优选地，在步骤(d)(i)中使用的引物是Lip1和Lip2。

Lip1的序列是：5′-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3′(SEQ ID NO: 2)，Lip2的序列是：5′-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G-3′(SEQ ID NO: 3)。

根据本发明方法的步骤(d)(ii)，使用能够与所述prfA基因座特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针，和能够与所述IAC序列特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针。

根据本发明，术语“特异性地杂交”是指，可检测地且特异性地结合。在使与非特异性核酸的可检测结合的可察觉量最小化的杂交条件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段会与核酸链选择性地杂交。

荧光标记的寡核苷酸是，表现出通常共价连接的荧光体的寡核苷酸。荧光体是一种化学化合物，当通过暴露于特定波长的光而被激发时，其会发射光(荧光)，例如在不同的光波长。

优选地，能够与所述prfA基因座和所述IAC序列特异性地杂交的寡核苷酸探针会表现出不同的荧光体，所述荧光体发射不同波长的光。这允许一个探针独立于其它探针的检测。

通常用于实时PCR的荧光标记的探针是例如LightCycler (杂交)探针、分子信标或水解探针(也称作TaqMan?探针)。优选地，使用水解探针。

LightCycler探针利用荧光共振能量转移(FRET)技术。就该方法而言，为每个靶序列使用2种分别与FRET供体和FRET受体结合的不同寡核苷酸探针。这些探针肩并肩地结合靶序列，使荧光体靠近。

分子信标(Tyagi等人, Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996)是与报告荧光体和猝灭剂结合的寡核苷酸探针。在5’末端上的核苷酸与在3’末端上的核苷酸互补，从而形成茎环结构。因为荧光体和猝灭剂的靠近，不会观察到荧光。在实时PCR过程中，所述探针与靶序列的杂交，会导致报告物-猝灭剂距离的增加，从而产生报告物的荧光。

优选地，使用水解探针(TaqMan?探针)  (Lee等人, Nucleic Acids Res. 21:3761-6, 1993)。这些探针也利用荧光共振能量转移(FRET)技术。所述探针表现出在一端的荧光报告物和在相反一端的荧光猝灭剂。因为报告物与猝灭剂的紧密靠近，报告物荧光的检测被抑制。在PCR的退火阶段，引物和探针都会与DNA靶物对合。新DNA链的聚合会导致探针的降解（通过聚合酶的5'-3' 外切核酸酶活性）和荧光报告物与猝灭剂的物理分离，从而导致荧光的增加。可以在实时PCR热循环仪中检测和测量荧光，且使用与产物指数增加相对应的它的几何增加来确定在每个反应中的阈值循环(Ct)(参见下面)。

示例性的报告物包括，但不限于：6-羧基荧光素；羧基荧光素(FAM)；二吡咯亚甲基二氟化硼(BODIPY)；吖啶、均二苯乙烯、6-羧基-荧光素(HEX)、TET (四甲基荧光素)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、罗丹明-6G、德克萨斯红、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、Cy?3、Cy?5、VIC?(Applied Biosystems)、LC Red 640、LC Red 705、德克萨斯红、Yakima Yellow?、以及它们的衍生物。优选地，在本发明中使用选自FAM和HEX的报告物。

示例性的猝灭剂包括，但不限于：黑洞猝灭剂(WO 01/86001 A1)如BHQ1^TM和BHQ2^TM、MGB (小沟结合剂，EP 0819133 B1)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、Eclipse?Dark猝灭剂、DABCYL、DABSYL、DDQ I和DDQ II。根据本发明，优选地使用的猝灭剂是MGB或BHQ1^TM。

本领域技术人员可以容易地选择合适的报告物-猝灭剂组合。通常，猝灭剂的吸收谱需要与报告物的发射谱具有良好重叠，以便允许最佳猝灭。

优选地，步骤(d)(ii)的与所述IAC序列杂交的荧光标记的探针是，在Rossmanith等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771中公开的pLucLm4 (SEQ ID NO:4)。与prfA基因座杂交的荧光标记的探针优选地是LipProbe (SEQ ID NO:5)。

所述荧光标记的探针pLucLm4优选地表现出HEX（作为报告荧光体）和BHQ1^TM（作为猝灭剂）。

所述荧光标记的探针LipProbe优选地表现出FAM（作为报告物）和MGB（作为猝灭剂）。

根据本发明，在步骤(e)中定性地和/或定量地测定通过步骤(d)产生的荧光信号。

所述检测优选地基于，在设定的温度，在每个循环中监测荧光。通常，使用光学装置来收集存在于样品中的特定r荧光体的特定激发和发射波长的数据，从而监测荧光。

在步骤(f)中，从步骤(e)确定和/或计算野生型单核细胞增生李斯特菌细胞在疑似被所述微生物污染的原始样品中的存在和/或量。

通常，通过在步骤(e)中定性地测定荧光信号，来测定野生型单核细胞增生李斯特菌细胞在原始样品中的存在。

通常通过包括下述步骤的方法，计算在原始样品中的野生型单核细胞增生李斯特菌细胞的量：

- 使用Ct方法(阈值方法)，基于在实时PCR扩增以后的各种荧光信号，借助于遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌和野生型单核细胞增生李斯特菌的DNA拷贝，计算DNA的初始量。所述阈值方法是基于研究的样品的各种信号与校准标准品的对比(Kaltenb?ck等人(2005), Advances in临床Chemistry 40: 219-259)。

- 基于已知的样品内最初的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌细胞的值和在实时PCR以后通过Ct方法得到的细胞的值，计算在分析操作(包括根据本发明方法的步骤(b)、(c)和(d)的样品制备、DNA纯化和分离和实时PCR)过程中的损失。

- 基于计算的在分析操作过程中的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌细胞的损失，计算存在于疑似被所述微生物污染的样品中的野生型单核细胞增生李斯特菌细胞的数目。

本发明方法是有利的，因为使用单核细胞增生李斯特菌作为分子生物学病原体检测的内部样品过程对照物(ISPC)，会提供与靶生物体的最大相似性，并因此提供用于细菌病原体检测的最大适用性。甚至密切相关的物种诸如无害李斯特菌（Listeria innocua）会导致非竞争性的内部对照物，这在实时PCR过程中需要第二个引物对。单纯地使用从现有IAC衍生出的基于DNA的ISPC，从检测过程的最开始，就不会满足对照物和靶物的最大相似性的必要条件。此外，大多数DNA会在PCR检测之前的各个方法步骤过程中损失。

本发明的另一个方面是一种试剂盒，所述试剂盒用于这样的试验：所述试验用于检测和测定在疑似被野生型单核细胞增生李斯特菌污染的样品中的所述微生物，所述试剂盒至少包括在一个或多个包中的：

(i) 如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌; 

(ii) 对野生型单核细胞增生李斯特菌的基因组prfA基因座和如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌的IAC序列特异性的引物；和

(iii) 能够与所述prfA基因座特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针，和能够与所述IAC序列特异性地杂交的荧光标记的寡核苷酸探针。

优选地，所述试剂盒的引物是Lip1 (SEQ ID NO:2)和Lip2 (SEQ ID NO:3)。

所述荧光标记的探针优选地是pLucLm4 (SEQ ID NO:4)（用于检测IAC序列）和LipProbe (SEQ ID NO:5)（用于检测prfA基因座）。

根据本发明，所述试剂盒可以另外包含提取溶液。

本发明的另一个方面是，一种用于生产如上所述的遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌细菌的方法，所述方法包括下述步骤：

(a) 删除单核细胞增生李斯特菌物种细菌的转录因子PrfA的基因组基因座，

(b) 克隆包含IAC的载体，

(c) 将步骤(b)的载体转化进步骤(a)的细菌物种中。

通过本领域已知的技术，实现根据步骤(a)的PrfA的基因组基因座的删除，且可以例如如在下述文献中公开的那样实现：B?ckmann等人(1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653。大体而言，构建敲除的质粒。将该质粒转化进单核细胞增生李斯特菌细胞中。交换会导致prfA基因的切除。得到的生物体也称作Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌。

 技术人员可以容易地确定单核细胞增生李斯特菌细菌的最佳培养条件。通常，在通气下，在37℃，在TSB-Y (含有酵母提取物的Trypton大豆培养基)中培养所述细菌。

在步骤(b)中，生产包含IAC的载体。

通常，通过常规PCR (Rossmanith等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771)扩增所述序列，从而生产足够用于克隆的量的IAC序列。用于PCR的引物通常包含特殊限制性酶的限制位点，从而允许以后整合进载体中。就根据SEQ ID NO:1的IAC序列而言，优选地使用修饰的引物LipBam (SEQ ID NO:6)和LipSal (SEQ ID NO:7)，它们分别包含限制位点BamHI和SalI。

LipBam的序列是：5`GCG CGG ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG C′3 (SEQ ID NO:6)。

LipSal的序列是：5′GCG CGT CGA CGT GTA ATC TTG ATG CCA TCA GG′3 (SEQ ID NO:7)。

在纯化扩增产物以后，进行限制酶切消化、去磷酸化和与合适的整合载体的连接。

通常通过与可商业得到的限制性酶（其与用于PCR的引物的限制位点相对应）一起温育扩增产物，进行限制酶切消化。优选地，使用BamHI和SalI。

通过与合适的磷酸酶（例如Fast AP^TM热敏感的碱性磷酸酶(Fermentas)）一起温育，实现IAC片段的去磷酸化。技术人员可以容易地选择合适的整合载体。所述载体包含会产生目标受体细菌株对其敏感的抗生素（例如氯霉素）抗性的基因序列，以便允许在以后选择阳性克隆。优选地，使用噬菌体插入载体，例如在Lauer等人(2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186中公开的pPL1或pPL2。噬菌体插入载体pPL2 (6123 bp)是特别优选的，因为它会提供向单核细胞增生李斯特菌的基因组中的稳定单拷贝插入。

可以如下生产足够量的插入载体：在细菌（例如大肠杆菌TOP10F’）中扩增载体，随后进行如上所述的分离、限制酶切消化和去磷酸化。通常，限制位点可以存在于所述载体的多克隆位点(MCS)中。

通常，通过加入DNA连接酶，例如可从Fermentas得到的T4 DNA连接酶，进行连接。

将得到的载体转化进合适的细菌（例如大肠杆菌TOP10F’）中，用于扩增和用于选择阳性克隆。该选择通常如下实现：将所述细菌铺板在含有上述抗生素的培养基上。

在步骤(c)中，将步骤(b)的载体转移进步骤(a)的单核细胞增生李斯特菌细胞中。使用本领域众所周知的多种方法，可以实现转化。实例是通过热激或电穿孔进行的转化。优选地，通过电穿孔实现转化。

热激转化如下进行：在有诸如Ca²⁺ (在CaCl₂中)或Rb²⁺ (RbCl₂)等二价阳离子存在下，冷冻细胞，使得细胞膜变成可透过质粒DNA。与DNA一起在冰上温育细胞，然后短暂地热激(通常在41-43℃维持30-120秒)。

就电穿孔而言，用10-25 kV/cm的电场短暂地电击细胞。优选地，根据Park等人(1990) Gene 94, 129-132，进行电穿孔。

在成功的克隆以后，可以测试得到的生物体。通过PCR扩增499 bp片段(根据Lauer等人(2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186)，和通过测序，可以测试所述载体在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌基因组中的成功插入。

可以如下验证IAC在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌的基因组中的单拷贝插入：基于已知的李斯特菌基因组的大小(Nelson等人(2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395)，与野生型数据相比，对比使用在实时PCR以后的数据通过UV/VIS光谱法测得的转化的单核细胞增生李斯特菌的基因组DNA量。

下述附图和实施例进一步例证了本发明，但是，本发明不限于此。

图1. pPL2-IAC大肠杆菌和IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的确认(根据实施例1.4和1.6)。(A)在转化和质粒分离以后，pPL2-IAC大肠杆菌克隆的实时PCR扩增，其靶向所述质粒内的人工IAC。在左侧的扩增图包括质粒制品作为靶物。在右侧的扩增图(ss IAC)代表校准函数(有效率：96.8%; Rsq: 0.999)。(B) IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆的实时PCR扩增，其靶向所述基因组内的人工IAC，用于证实载体pPL2-IAC在李斯特菌基因组中的整合(有效率：96.0%; Rsq.: 0.999)。在左侧的扩增图包括4个IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆的基因组DNA作为靶物。

图2. pPL2-IAC在李斯特菌基因组中的阳性整合的确认，和通过常规PCR对得到的IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株的确认(根据实施例1.6.)。(A)克隆的菌株（被证实为单核细胞增生李斯特菌）的琼脂糖凝胶。M，标志物；1，伊凡诺夫李斯特菌（L. ivanovii）、西利坚李斯特菌（L. seeligeri）和威尔逊李斯特菌（L. welshimeri）；2，无害李斯特菌（L. innocua）；3，单核细胞增生李斯特菌；4，格氏李斯特菌（L. grayi）；5-8，4个IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆。(B) IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的确认，所述EGDe扩增所有李斯特菌属物种特有的16S rRNA基因和单核细胞增生李斯特菌特有的hly基因。9，李斯特菌属物种；10，单核细胞增生李斯特菌；11-14，4个IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆。(C) pPL2-IAC在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe菌株的基因组中的整合的确认。1-4，4个IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆。在PCR以后得到的499 bp片段指示整合。在1% 琼脂糖凝胶中分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。

在上面和在下面引用的所有申请、专利和出版物的整个公开内容，通过引用并入本文。

1. 实施例：

下述实施例描述了本发明的实际用途。

1.1. 细菌菌株和培养条件。单核细胞增生李斯特菌EGDe (1/2a, 内部编号2964)是在下述地方的细菌菌株保藏物的一部分：Institute of Milk Hygiene, Milk Technology and Food Science, Department of Veterinary Public Health and Food Science, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria (IMML)。Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe (1/2a)是在下述地方的细菌菌株保藏物的一部分：Department of Microbiology, Theodor Boveri Institute, University of Würzburg, Würzburg, Germany。电感受态的大肠杆菌TOP10F′可在Invitrogen (Carlsbad, CA, 美国)得到。使用MicroBank^TM技术(Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hill, 加拿大)，在-80℃维持所有细菌菌株。

使用HP 8452分光光度计(Hewlett Packard, Paolo Alto, CA, 美国)，在600 nm一式两份地测量细菌培养物的光密度(OD₆₀₀)。通过将100μl细菌培养物在平板上划线，或通过环技术，在RAPID′L.mono (Bio-Rad laboratories GmbH, München, 德国)、OCLA (Oxoid产色李斯特菌琼脂; Oxoid, Hampshire, 英国)、PALCAM (Solabia Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, 法国)和血琼脂(Biomerieux, Marcy l’Etoile, 法国)上，选择性地铺板单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型和IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe。

使用平板计数方法或Live/Dead?BacLight?细菌生存力试剂盒(Molecular Probes, Willow Creek, OR, 美国)（根据生产商的说明书），进行细菌悬浮液的计数。

1.2. 寡核苷酸、质粒和酶反应。寡核苷酸和质粒的序列如表1所示。用于常规和实时PCR的引物以及HEX-标记的探针pLuclm4可从MWG Biotech (Ebersberg，德国)得到；MGB-修饰的Lip-probe可从Applied Biosystems (Foster City, CA, 美国)得到。IAC的人工100 bp靶物由VBC Genomics (Vienna, 奥地利)合成。pPL2噬菌体插入载体是根据Lauer等人(2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186。

根据生产商的说明书，使用可从Fermentas (Fermentas International Inc., Burlington, 加拿大)得到的FastDigest?限制性酶BamHI和SalI，进行限制酶切消化。将20μl总反应体积在37℃温育1小时。在连接之前，根据生产商的说明书，使用FastAP?热敏感的碱性磷酸酶(Fermentas)，在37℃进行载体和IAC片段的去磷酸化30 min。在4℃，使用T4 DNA连接酶(Fermentas)连接载体pPL2和人工IAC片段过夜。

根据以前公开的形式，使用引物Lip1和Lip2和FAM-标记的Lip-probe (D'Agostino等人(2004) J. Food Prot. 67, 1646-1655; Rossmanith等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771)，通过靶向prfA基因的274 bp片段，进行单核细胞增生李斯特菌的实时PCR检测。根据Rossmanith等人(2006)，使用Lip1和Lip2和HEX-标记的pLucLm4，进行人工IAC片段的实时PCR检测。

正向引物(Lip1:5′-GATACAGAAACATCGGTTGGC-3′)和反向引物(Lip2:5′-GTGTAATCTTGATGCCATCAGG-3′)会扩增prfA基因的274 bp片段。使用2种不同的TaqMan?探针形式，它们具有增加的解链温度。Lip-probe (5′-FAM-CAGGATTAAAAGTTGACCGCA-MGB - 3′)使用MGB修饰。所述试验的IAC的探针(pLucLm 4: 5′-HEX-TTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC -BHQ1-3`)用HEX标记过。引物和探针pLucLm 4可以购自MWG Biotech (Ebersberg，德国)。MGB-修饰的探针购自Applied Biosystems。

使用引物NC16和PL95 (Lauer等人(2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186)，进行用于确认pPL2-IAC在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe基因组中的插入的常规PCR。如下将IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe鉴别为单核细胞增生李斯特菌EGDe：根据Bubert等人(1999, Appl. Environ. Microbiol. 65, 4688-4692)，扩增单核细胞增生李斯特菌的iap-基因座，并根据Border等人(1990, Lett. Appl. Microbiol. 11, 158-162)，靶向所有李斯特菌属物种特有的16S rRNA基因和单核细胞增生李斯特菌特有的hly基因。

在Mx3000p实时PCR热循环仪(Stratagene, La Jolla, CA, 美国)中进行常规和实时PCR反应。25μl体积含有：20 mM Tris-HCl，50 mM KCl，3.5 mM MgCl₂，500 nM的每种引物，250 nM的每种探针，200μM (各自)的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，1.5 U的Platinum?耐热性DNA聚合酶(Invitrogen, Lofer, 奥地利)和5μl分离的DNA。在94℃初始变性2 min以后，在45个在94℃持续15 s和在64℃持续1分钟的循环中进行扩增。

就用于实时PCR定量的DNA标准品而言，使用用于革兰氏阳性细菌的NucleoSpin?组织试剂盒和支持方案，对1毫升单核细胞增生李斯特菌菌株EGDe的纯培养物进行DNA分离。使用Hoefer DyNA Quant200装置(Pharmacia Biotech)，通过荧光法测量DNA浓度。如下测定prfA基因的拷贝数：基于单核细胞增生李斯特菌的基因组的分子量，假定，1 ng DNA等于3.1×10⁵个完整基因组拷贝，并且prfA基因是单拷贝基因。使用下述方程式，使用标准曲线的斜率(s)来计算PCR效率(E)：E = 10^-1/s–1 [21]。

将实时PCR结果表示为细菌细胞当量(BCE)。如下测定prfA基因和IAC插入物的拷贝数：基于单核细胞增生李斯特菌的基因组的分子量，假定，1 ng DNA等于3.1×10⁵个完整基因组拷贝，并且prfA基因和IAC插入物分别是在基因组内的单拷贝基因和单拷贝插入物(Nelson等人(2004) Nucleic Acids Res. 32, 2386-2395)。除非另外指出，否则一式两份地进行所有实时PCR反应。

在1.5% 琼脂糖凝胶中在90 V分离常规PCR的PCR产物25 min，并用0.5 μg/ml溴化乙锭(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim，德国)染色。使用GeneRuler 100 bp (MBI Fermentas, St. Leon-Rot，德国)作为标准品。

1.3. DNA提取和测量。使用用于革兰氏阳性细菌的NucleoSpin?组织试剂盒(Macherey - Nagel)和支持方案，提取1毫升过夜细菌培养物的基因组DNA。根据生产商的说明书，使用Quiagen质粒微型试剂盒(Hilden，德国)，提取用于克隆实验的质粒DNA。使用Hoefer DyNA Quant200装置(Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, 美国)和8452A二极管阵列分光光度计(Hewlett Packard, Palo Alto, CA, 美国)，通过荧光测量，分析测定DNA浓度。

1.4. pPL2-IAC的克隆。根据Rossmanith等人(2006, Res. Microbiol. 157, 763-771)，使用含有限制位点BamHI和SalI的改进引物LipBam和LipSal，通过常规PCR扩增100 bp片段，从而生产足够量的用于克隆的IAC (IAC: 5`-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGA AGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3′)。使用NucleoSpin?Extract II (Macherey-Nagel)纯化扩增产物以后，如上所述进行限制酶切消化和去磷酸化，然后与载体pPL2连接。在连接之前，通过用于扩增的标准热激技术(Sambrook等人(1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)，将噬菌体整合载体pPL2转化进大肠杆菌TOP10F′中。如上所述提取载体，在纯化、限制酶切消化和去磷酸化以后，用于连接。然后通过热激将得到的质粒pPL2-IAC转化进大肠杆菌TOP10F′中。通过在含有25μg/ml氯霉素的Luria-Bertani培养基(LB; Oxoid)上铺板，选择pPL2-IAC阳性克隆。

挑取单个细菌菌落，并筛选含有pPL2-IAC的大肠杆菌的阳性转化。限制酶切消化分析产生长度为约6,000 bp和100 bp的2个片段，所述长度与载体和插入物的长度相对应，这指示pPL2-IAC转化进大肠杆菌中。使用pLucLm4进行靶向IAC的实时PCR，导致靶物的扩增，从而证实限制酶切消化分析(图1A)。

1.5. pPL2-IAC向Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe中的转化。使用改进的电穿孔方案(Park等人(1990) Gene 94, 129-132)，用pPL2-IAC转化Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe。如下制备电感受态的Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe细胞：在37℃在含有5μg/ml青霉素G的脑心浸液肉汤(BHI; Oxoid)中培养细胞至OD₆₀₀为0.3。在4℃、在8000×g收获细胞10 min，在1/10体积3.5×SMHEM缓冲液(72 mM蔗糖、1 mM MgCl₂和2 mM HEPES)中洗涤沉淀物2次。在将沉淀物重新悬浮于1/100体积3.5×SMHEM缓冲液中以后，在-80℃保存100μl等分试样。

就电穿孔而言，在冰上融化100μl电感受态的Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的等分试样，并与5μl含有pPL2-IAC的DNA悬浮液(约1μg/反应)相混合。在冰上温育1 min以后，在Gene Pulser Xcell^TM电穿孔系统(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, 美国)中进行电穿孔(100Ω, 50μF, 1000 V)。加入1毫升预温热的BHI，将样品在37℃温育6 h，随后在含有25μg/ml氯霉素的BHI琼脂上铺板。在37℃温育24 - 48 h以后，挑取单个菌落，并筛选pPL2-IAC阳性的Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆。

1.6. IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的确认。通过测试IAC序列在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe中的存在，证实4个氯霉素筛选阳性的IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe克隆。这如下实现：使用探针pLucLm4，扩增IAC的100 bp片段。对来自IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的基因组DNA进行实时PCR，导致阳性扩增(图1B)。测试的克隆达到11.5的平均Ct-值(SD (标准差): 0.16)，这与5.36×10⁷个拷贝的平均值相对应。使用与野生型单核细胞增生李斯特菌的prfA基因座的274 bp片段杂交的探针Lip-probe，通过实时PCR，测试克隆的菌株的Δ-prfA状态，这没有导致扩增。

如在段落1.2下所述，使用常规PCR，测试所述载体在基因组内的整合。在电泳以后得到的片段与提议的扩增产物长度499 bp相对应(图2C)。这指示所述载体在李斯特菌基因组中的插入，因为引物NC16和PL95允许跨单核细胞增生李斯特菌血清型1/2a中的附着位点tRNAArg-attBP′进行扩增，从而产生含有载体的序列部分(3′)和李斯特菌基因组的序列部分(5′)的杂种扩增子。

使用引物NC16和PL95，使用该杂种PCR扩增子，进行IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的测序分析。得到的序列与穿梭整合载体pPL2的210 bp片段具有100%同一性，与单核细胞增生李斯特菌的261 bp片段（包括提议的附着位点tRNAArg-attBP′）具有100%同一性(菌株EGDe，整个基因组，区段6/12; emb/AL591978.1)。

如在段落1.2下所述，通过常规PCR，另外进行得到的IAC+、Δ-prfA菌株是单核细胞增生李斯特菌EGDe的确认测试。结果显示在图2A和B中，从而证实了用于2个PCR试验的IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe和对照物单核细胞增生李斯特菌EGDe的匹配片段大小。

1.6. IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe测序。使用NucleoSpin?Extract II试剂盒(Macherey-Nagel)，按照生产商的说明书，纯化在扩增以后来自阳性克隆的PCR产物。将纯化的PCR产物送至Macrogen Inc. (Seoul, 韩国)，用于DNA测序。使用NC16和PL95引物，在循环测序反应中，对样品进行双链测序。

使用可在国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)得到的BLAST服务器，分析和比对得到的序列。

1.7. 用于确认pPL2-IAC在Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的基因组中的单拷贝插入和针对单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型数据进行校准的定量实时PCR。在含有探针pLucLm4和Lip-probe的多路系统中，使用prfA实时PCR试验，对比基因组IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe DNA和单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型的校准标准品。基于prfA是单拷贝基因的假设，对比了两种DNA靶物的10倍稀释度。所述10倍稀释液从1.58×10⁶个拷贝（相当于5 ng基因组DNA，通过荧光和UV-VIS测量测得）开始。结果显示在表3中，并证实2个标准系列的Ct-值的良好一致性。这也证实了2种探针在反应内的相当性能。基础数据源自在4次实时PCR运行中重复的副本。为了证实这些结果，通过活力染色，测定IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的培养物的浓度，并与实时PCR结果相对比。通过实时PCR得到的每个样品的3.2×10³ (RSD.: 6.7%) BCE的数目与通过活力染色测得的每个样品的2.8×10³ (RSD.: 25.0%) CFU相当。

使用多路实时PCR，研究了递增量的源自IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的基因组DNA对主反应的扩增野生型菌株和主要细菌靶物的prfA基因座的影响。相对于基因组IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe DNA的1.58×10⁶至1.58×10¹个拷贝的10倍稀释度背景，使用Lip-probe和pLucLm4，在递增以及递减基体中测试了从基因组单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型DNA的从1.58×10⁶至1.58×10¹个拷贝的10倍稀释度。得到的所有测试组合的Ct值偏离通过两种菌株的基因组标准品的单路实验得到的各个值，对于标准浓度的所有组合，具有0.3的平均标准差。示例性地，相对于IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的1.58×10⁵个拷贝背景，在表3中显示了得到的单核细胞增生李斯特菌EGDe的基因组DNA的10倍稀释度的Ct-值。

1.8. 人工地和天然地污染的食物样品。用于人工污染的超高温奶购自当地的超市，并在接种之前，通过进行靶向单核细胞增生李斯特菌的prfA基因座的实时PCR，证实所述奶是单核细胞增生李斯特菌阴性的。使用含有8.5×10⁸ CFU/ml的单核细胞增生李斯特菌EGDe纯培养物在林格氏溶液(Oxoid)中的10倍稀释系列，进行人工污染。将100μl适当的稀释液加入样品中。将稀释系列制备成含有10¹-10²、10²-10³、10³-10⁴和10⁴-10⁵ CFU/ml。使用含有0.6% 酵母(TSA-Y; Oxoid)的胰蛋白胨大豆琼脂，通过平板计数方法，得到稀释系列的每个步骤的CFU数目。一式三份地进行所述实验。

天然地污染的软奶酪样品由管理当局提供，且源自奥地利Styria的最近单核细胞增生李斯特菌爆发，并在4℃保藏。一式四份地处理来自2个不同生产批次的2个样品，产生8份单独的样品。另外，对每个样品相应地进行ISO 11290-2，以对比使用该标准方法(ISO 11290-2; ISO 11290-2/Amd1)的实验的定量结果。

1.9. 样品处理。使用Mester等人(2010) J. Food Protect. 73, 680-687和Rossmanith等人(2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511公开的基体裂解方案，进行样品处理。

1.10. 统计分析。

通过卡方检验，分析双组对比。计算P值，认为≤0.05的值是显著的。

2. 应用实施例：

2.1. IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe在OCLA、PALCAM、血琼脂和RAPID′L.mono琼脂培养基上的表型。在血琼脂上，IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe没有表现出溶血。在PALCAM琼脂上，IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe表现出与单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型相同的表型，如表2所示。在OCLA上的IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的形态和颜色也与野生型类似，但是在温育24和48 h以后，没有观察到IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe的晕形成。在温育72 h以后，IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe也表现出一些微弱的晕形成。在RAPID′L.mono上铺板的克隆的菌株形成白色，缺少在RAPID′L.mono琼脂上的单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型菌株特有的绿色。

2.2. IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe作为人工污染的超高温奶和天然地污染的Quargel奶酪的内部过程对照物的应用。根据Rossmanith等人(2007) J. Microbiol. Methods 69, 504-511公开的方法，处理人工地以及天然地污染的食物样品。该方法是基于如下的样品制备：裂解食物基体，随后使用离心分离靶细菌，然后进行DNA分离和实时PCR检测。在样品制备过程中，使用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑鎓硫氰酸盐([emim]SCN)作为溶剂。

就人工污染而言，给12.5 g超高温奶样品掺入在部分1.8中描述的单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型的4步10倍稀释系列。另外，向每个内部样品过程对照物IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe样品中，加入1.4×10³ (RSD.: 29.0%) CFU。

从超高温奶中回收主要靶病原体单核细胞增生李斯特菌EGDe野生型，与显微术计数相比，具有55% (RSD (相对标准差): 10.9%)的因数。在对数尺度内的相对标准差是10.9%，这代表在对数尺度回收方面的高水平精确度和再现性，并指示，使用IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe细胞作为内部样品过程对照物没有偏倚影响。

所述内部样品过程对照物指示与显微镜计数法相比的49% (RSD.: 27.1%)回收率。最初，每个样品1.4×10³ (RSD.: 29.0%) CFU (菌落形成单位)在回收和实时PCR检测以后会产生6.9×10² (RSD.: 27.0%) BCE。

然后将该系统应用于天然地污染的Quargel奶酪样品。另外，每个样品中加入1.4×10³ (RSD.: 29.0%) CFU IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe。

以两种方式处理样品：通过基体裂解和随后的实时PCR，得到单核细胞增生李斯特菌的值的直接定量。还进行ISO 11290-2，用于对比。另外，使用DNA分离方案，省略蛋白水解酶K步骤，通过基体裂解和随后的实时PCR，处理样品。这人工地偏倚消化性能及其结果（整个方案的有效性）。

就2种各自的Quargel奶酪负载而言，在实时PCR以后直接得到的样品的单核细胞增生李斯特菌污染值达到1.4×10⁶ (RSD.: 5.9%) BCE和1.1×10⁸ (RSD.: 8.9%) BCE的平均值。根据每个样品的有效性比率，校正这些值，所述有效性比率如下得到：将每次重复的值与IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe过程对照物在实时PCR以后的6.9×10² (RSD.: 5.9%) BCE的平均值相对比。在该校正以后，就两种负载而言，单核细胞增生李斯特菌污染的平均值为1.1×10⁶ (RSD.: 35.8%) BCE和2.3×10⁸ (RSD.: 10.2%)。进行另一种校正，其包括IAC+、Δ-prfA单核细胞增生李斯特菌EGDe过程对照细胞在实时PCR以后从最初的1.4×10³ (RSD.: 29.0%) CFU至6.9×10² (RSD.: 5.9%) BCE的总损失。就两种奶酪负载而言，这产生2.32×10⁶ (RSD.: 36.0%) BCE/g和5.0×10⁸ (RSD.: 9.9%) BCE/g，与此相比，通过ISO 11290-2得到2.07×10⁶ (RSD.: 91.1%) CFU/g和4.9×10⁸ (RSD.: 73.2%) CFU/g。就各种奶酪负载而言，通过人工偏倚的DNA分离处理过的样品的平均基础值为4.9×10⁵ (RSD.: 6.3%) BCE和3.7×10⁷ (RSD.: 2.9%)。在如上所述校正以后，各种单核细胞增生李斯特菌污染是1.8×10⁶ (RSD.: 47%) BCE和4.6×10⁸ (RSD.: 10.1%) BCE。  

序列表

 

<110>  Merck Patent GmbH

 

<120>  单核细胞增生李斯特菌物种的非天然突变体

 

<130>  I10/116

 

<160>  7

 

<170>  PatentIn 3.5版

 

<210>  1

<211>  100

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  内部扩增对照序列(IAC)

 

<300>

<301>  Rossmanith等人

<302>  使用靶向prfA基因的组合的富集/实时PCR方法，

            检测食物中的单核细胞增生李斯特菌

<303>  Res. Microbiol.

<304>  157

<306>  763-771

<307>  2006-04-03

 

<400>  1

gatacagaaa catcggttgg cgtattcgaa atgtccgttc ggttggcgct atgaagagat       60

acgcggtgga acctggaacc tgatggcatc aagattacac                            100

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  引物Lip1

 

<300>

<301>  D'Agostino等人

<302>  一种走向国际标准的、经过验证的基于PCR的、使用生奶作为食物模型的、

             检测单核细胞增生李斯特菌的方法

<303>  J. Food. Prot.

<304>  67

<306>  1646-1655

<307>  2004

 

<400>  2

gatacagaaa catcggttgg c                                                 21

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  引物Lip2

 

<300>

<301>  D'Agostino等人

<302>  一种走向国际标准的、经过验证的基于PCR的、使用生奶作为食物模型的、

            检测单核细胞增生李斯特菌的方法

<303>  J. Food Prot。

<304>  67

<306>  1646-1655

<307>  2004

 

<400>  3

gtgtaatctt gatgccatca gg                                                22

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pLucLm4: 结合IAC的探针

 

<300>

<301>  Rossmanith等人

<302>  使用靶向prfA基因的组合的富集/实时PCR方法，

            检测食物中的单核细胞增生李斯特菌

<303>  Res. Microbiol.

<304>  157

<306>  763-771

<307>  2006

 

<400>  4

ttcgaaatgt ccgttcggtt ggc                                               23

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  Lip探针：结合prfA基因座的探针

 

<300>

<301>  Rossmanith等人

<302>  使用靶向prfA基因的组合的富集/实时PCR方法，

            检测食物中的单核细胞增生李斯特菌

<303>  Res. Microbiol.

<304>  157

<306>  763-771

<307>  2006

 

<400>  5

caggattaaa agttgaccgc a                                                 21

 

 

<210>  6

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  LipBam引物

 

<400>  6

gcgcggatcc gatacagaaa catcggttgg c                                      31

 

 

<210>  7

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  LipSal引物

 

<400>  7

gcgcgtcgac gtgtaatctt gatgccatca gg                                     32