一种粘红酵母及其在不对称催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用

摘要

本发明涉及一种微生物新菌种粘红酵母CCZU-G5及其在生物催化2-氧代-4苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用，所述的粘红酵母CCZU-G5保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为6328。所述的方法是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以粘红酵母CCZU-G5全细胞为生物催化剂，在水/有机溶剂两相体系中进行微生物不对称催化还原反应，反应结束后转化液经过分离纯化得到(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。本发明与传统方法相比，在保证高产率和高立体选择性的同时提高底物的摩尔转化率，整个反应过程不需要添加辅酶，反应条件温和，操作简单、产品易于分离、无副产物生成、对设备要求不高、环境友好且生产成本明显降低，在工业上是一种能提高生产效益的新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及不对称生物催化技术领域，尤其涉及一种微生物新菌种粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5，以及该微生物在水/有机溶剂两相体系中全细胞不对称催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备方法。 

背景技术

（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[（R）-HPBE]是有机合成中一种重要的手性医药中间体，被广泛用于赖诺普利、苯那普利、西拉普利、依那普利和雷米普利等众多普利类血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）的合成中。这些普利类药物通过抑制血管紧张素转换酶的活性和血管紧张素的生成来产生降压作用，是目前市场上最畅销的用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病的药物之一。 

（R）-HPBE的制备方法主要有化学法和生物法，二者又都包括拆分和合成两种途径。拆分法是通过物理、化学或生物的手段将外消旋化合物分离成某单一对映体的手性化合物，但该方法需要先合成外消旋的目标底物，然后再进行拆分，理论产率不超过50%。从原子经济的角度来说，该方法较实用但不够经济。化学合成法，主要包括由手性试剂催化的不对称还原和由手性催化剂催化的不对称还原两种。化学合成法原子经济性较高，但光学选择性较差，副产物较多，污染较严重，且手性试剂和催化剂的价格昂贵，制备也比较困难。生物法中直接利用醇脱氢酶催化底物制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，虽然具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点，但是整个反应过程中不仅要 有酶蛋白参加反应，而且还要添加价格昂贵的辅助因子，在实际应用中受到一定的限制。 

生物催化是利用酶或微生物细胞作为催化剂进行化学反应的过程，具有高度的专一性、催化效率高、环境友好、操作条件温和等优点。与水相生物催化反应相比，非水相生物催化有其独特的优越性，如可大幅度增加水不溶性底物和产物的溶解度；可改变反应的平衡点，使反应向所期望的方向进行；能提高有机溶剂中酶的热力学和操作稳定性；可减少水相中副反应的发生；减少反应后产物的分离过程等。对于微生物催化的羰基不对称还原反应，由于反应需要昂贵的辅酶参与，而微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、所有必需的辅酶及其再生途径，辅酶循环再生由细胞自动完成。进行不对称还原反应时只需加入少量的能源物质如葡萄糖或醇类等作为辅助底物即可，同时所有的酶和辅酶处在天然的细胞环境中，可减少环境因素对酶活的影响。因此，与纯酶催化相比，利用微生物全细胞进行不对称催化反应具有不可比拟的优势。 

由于生物催化高度的专一性，利用微生物全细胞催化不对称还原，可以直接将前手性的底物直接转化为目标产物，因此全细胞催化成为国内外研究和开发的热点。同时由于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯易于合成且价格低廉，以其为底物进行微生物催化的不对称还原反应获得具有光学活性的（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是非常经济有效的制备途径，而且反应产物不易为微生物代谢所利用，用微生物活细胞催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯非常有利。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成在成本，立体选择性，产物产率，对环境的影响方面存在的缺陷，为了解决上述问题，本发明提供一种可供生物转化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成（R）-2-羟 基-4-苯基丁酸乙酯微生物新菌种：粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5，以及该菌株在不对称生物催化合成（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的应用，该应用在保证高产率和高光学纯度的同时提高底物了底物的浓度，降低生物催化不对称还原制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的生产成本，其反应条件温和、操作简单、耗能少、转化效率高、产物易于分离、反应过程无污染。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

本发明所述的粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，位于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No.6328，保藏日期2012年7月12日。 

该粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5菌落特征和生化特性：在光学显微镜下菌株呈椭圆形，琼脂板培养基上呈现出红色，表面光滑、有光泽，质地粘稠、边缘整齐。 

菌株来源：本发明中所述的微生物菌株粘红酵母CCZU-G5是从江苏常州周边油脂厂、化工厂和学校食堂周围采集的80份土样中筛选得到。 

将上述粘红酵母CCZU-G5应用于不对称催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中，该应用是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以粘红酵母CCZU-G5全细胞为生物催化剂，在水/有机溶剂两相体系中进行微生物不对称催化还原反应，反应结束后转化液经过分离纯化得到（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。具体按照如下步骤进行的： 

（1）粘红酵母湿菌体的制备 

将粘红酵母CCZU-G5经过活化培养和发酵培养后得到发酵培养液，经过离心得到粘红酵母CCZU-G5湿菌体，作为全细胞生物催化剂； 

（2）配制反应体系 

在有机溶剂与pH 5～9的磷酸盐缓冲液配制成反应体系中，加入浓度为20～100g/L的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作为底物，再加入一定量的辅助底物； 

（3）生物催化反应 

在步骤（2）的反应体系中加入步骤（1）所述湿菌体，在反应温度为20～50℃，摇床转速100～250r/min条件下反应1～30h； 

（4）转化液后处理 

在步骤（3）的生物催化反应后转化液经过离心分离菌体，取出上层有机相，下层水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液和有机相，再干燥脱水过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发回收溶剂，得到无色油状液体（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。 

作为对本发明的限定，在上述步骤（1）中活化培养是按以下步骤进行的：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:葡萄糖10～100g/L，蛋白胨10～100g/L，酵母粉10～100g/L，pH自然；115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子，在20～40℃，摇床转速100～250r/min的条件下培养1～5天，作为活化培养种子液。 

在上述步骤（1）中发酵培养液是按以下步骤制备的：将发酵培养基的各组分按照浓度浓度配制：葡萄糖10～100g/L，蛋白胨10～100g/L，酵母粉10～100g/L，MgSO₄0.1～1g/L，（NH₄）₂SO₄0.1～1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.1～1g/L，KH₂PO₄0.1～1g/L，pH 5～9，115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3～10%接种活化培养种子液，在温度20～40℃，摇床转速100～250r/min的条件下培养1～5天后，得发酵培养液。 

在上述步骤（2）中所述的有机溶剂是乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、壬烷或癸烷中的一种，上述产品均为市售分 析纯；在用有机溶剂与pH 5～9的磷酸盐缓冲液配制成反应体系时，按有机溶剂的体积百分浓度为5～80%配制成水/有机溶剂两相体系，其中水相即指磷酸缓冲溶液。所述的磷酸缓冲溶液采用本领域常规的配制方法配制即可。 

微生物催化的不对称还原反应通常需要辅酶的参与，微生物全细胞尤其是酵母细胞中含有可催化氧化还原反应的多种脱氢酶和辅酶，用微生物整细胞作为生物催化剂可省去酶的分离纯化步骤，同时不需要添加辅酶再生系统。但是微生物细胞中的辅酶含量有限，添加一定量的辅助底物有利于辅酶的回收利用。因此，在上述步骤（2）中添加辅助底物，辅助底物选自乙醇、异丙醇、甘油、乳糖、蔗糖、葡萄糖中的一种，其加入量为10～100g/L。 

步骤（3）中所述的湿菌体的加入量为10～100g/L。 

本发明产物的分析方法是：取（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MS进行定性分析，样品与标准品（Sigma Co.）质谱图对照，确定为同一物质。步骤（3）所得转化液经过处理后通过气相色谱（GC）测定产物浓度，再结合带手性柱的高校液相色谱（HPLC）测定产物的对映体过量值（e.e.值），确定转化液的主要组分，具体如下： 

（1）产物（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯产率测定：使用日本岛津GC-14C气相色谱仪，FID检测器；毛细管柱SE-30（25m×0.25mm×0.25μm），色谱条件为：汽化室250℃，检测器250℃，程序升温：160℃下保留1.5min，以10℃/min升温至250℃维持10min，以正十二烷为内标物，进样量0.2μL；柱流速2.0mL/min；载气H₂流速30mL/min，分流比：50:1。 

（2）产物（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯e.e.值测定：使用安捷伦1260高效液相色谱仪，Chiral OD-H柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相正己烷：异丙醇=95:5（V/V）；进样量5μL，流速1mL/min；柱温20℃；紫外检测波长225nm。 （R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯e.e.值由下式计算： 

$e.e.\%=\frac{A_R-A_S}{A_R+A_S}\times 100\%$

式中A_R、A_S分别表示从色谱柱流出的R型和S型产物的峰面积。 

本发明采用粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5作为催化剂，在水/有机溶剂两相体系中将2-羰基-4-苯基丁酸乙酯还原为（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的生物催化机理如下： 

采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果是，本发明通过实验室筛选获得了高对映体选择性的粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5，在水/有机溶剂两相体系中催化不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯生成的产物（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯对映体过量值达到99%以上；同时供给能量物质，添加高浓度底物，可以获得高对映体值、高反应摩尔转化率、高产物浓度。 

在反应介质中存在一定体积比的水，使微生物催化剂能很好溶解；所筛选的有机溶剂对微生物细胞的毒性较小且对底物和产物具有良好的溶解性，在添加高浓度的底物条件下可以大幅度提高底物的转化率和产物的产率；生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉；整个反应过程中不需要添加辅酶；反应条件温和，无副产物生成，对设备要求不高，环境友好， 生产成本明显降低，在工业上是一种能提高生产效益的新方法。 

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。 

实施例1：粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5湿菌体的制备 

将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，pH自然；然后115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子，在30℃，摇床转速180r/min的条件下培养1～5天，作为活化培养种子液。 

将发酵培养基的各组分按照浓度浓度配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄0.5g/L，pH 7.0，115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3～10%接种活化种子培养液，在温度30℃，摇床转速180r/min的条件下培养1～5天后，得发酵培养液。离心10min（8000r/min）收集菌体，用磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.0）洗涤菌体两次，4℃保存待用，发酵液中湿菌体的量约为2g/50mL。 

实施例2：粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5湿菌体的制备 

将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH自然；115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子，在20℃，摇床转速100r/min的条件下培养1～5天，作为活化培养种子液。 

将发酵培养基的各组分按照浓度浓度配制：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，MgSO₄0.1g/L，（NH₄）₂SO₄0.1g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.1g/L，KH₂PO₄0.1g/L，pH 5，115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3～10%接种活化培养种子液，在温度20℃，摇床转速100r/min的条件下培养1～5天后，得发酵培养液。离心10min（8000r/min）收集菌体，用磷酸盐缓冲液（0.1M， pH 7.0）洗涤菌体两次，4℃保存待用，发酵液中湿菌体的量约为2g/50mL。 

实施例3：粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5湿菌体的制备 

在上述步骤（1）中活化培养是按以下步骤进行的：将活化培养基的各组分按照以下浓度配制:葡萄糖100g/L，蛋白胨100g/L，酵母粉100g/L，pH自然；115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，接入斜面种子，在40℃，摇床转速250r/min的条件下培养1～5天，作为活化培养种子液。 

将发酵培养基的各组分按照浓度浓度配制：葡萄糖100g/L，蛋白胨100g/L，酵母粉100g/L，MgSO₄1g/L，（NH₄）₂SO₄1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，KH₂PO₄1g/L，pH 9，115℃灭菌30分钟，灭菌后冷却，按接种量体积比3～10%接种活化培养种子液，在温度40℃，摇床转速250r/min的条件下培养1～5天后，得发酵培养液。离心10min（8000r/min）收集菌体，用磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.0）洗涤菌体两次，4℃保存待用，发酵液中湿菌体的量约为2g/50mL。 

实施例4：不同有机溶剂与水组成的两相体系下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%不同有机溶剂和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，同时加入20g/L的底物和30g/L的葡萄糖，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表1所示。 

表1：不同有机溶剂与水组成的两相体系下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  有机溶剂   产率/%   e.e.值/%   产物构型   乙酸乙酯   11.3   16   R   乙酸丁酯   14.3   18   R   苯   36.1   45   R   甲苯   44.1   49   R   正己烷   69.3   99.5   R   正庚烷   89.3   99.4   R   正辛烷   90.3   99.4   R   异辛烷   98.1   99.5   R   正壬烷   63.1   99.5   R   正癸烷   52.8   99.3   R

实施例5：不同有机溶剂体积百分比下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL不同体积比的异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，同时加入20g/L的底物和50g/L的葡萄糖，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表2。 

表2：不同有机溶剂体积百分比下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  有机溶剂体积百分比/%   产率/%   e.e.值/%   5   64.3   99.4   20   69.3   99.5   30   95.4   99.5   50   98.3   99.4   80   90.3   99.3

[0052] 实施例6：不同反应温度下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，葡萄糖的含量为50g/L，分别于20℃、30℃、50℃180r/min条件下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表3。 

表3：不同反应温度下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  反应温度/℃   产率/%   e.e.值/%   20   90.91   99.3   30   96.25   99.5   50   54.23   99.5

实施例7：不同pH值磷酸缓冲液下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和不同pH值磷酸盐缓冲液组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，葡萄糖的含量为50g/L，于30℃，180r/min条件下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表4。 

表4：不同pH值磷酸缓冲液下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  反应pH   产率/%   e.e.值/%   5   80.31   99.2   7.5   98.73   99.5   9   34.10   99.4

实施例8：不同摇床转速下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，葡萄糖的含量为50g/L，于30℃，摇床转速分别为100r/min、150r/min、180r/min、250r/min条件下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表5。 

表5：不同摇床转速下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  摇床转速/r/min   产率/%   e.e.值/%   100   81.23   99.4   150   90.20   99.4   180   98.15   99.5   250   97.99   99.3

实施例9：不同底物浓度下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，葡萄糖的含量为50g/L，分别添加不同浓度的底物，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去 除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表6。 

表6：不同底物浓度下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  底物浓度/g·L^-1  产率/%   e.e.值/%   20   98.3   99.5   40   80.7   99.4   60   52.6   99.3   100   10.1   99.4

实施例10：不同辅助底物下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，分别添加50g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、乙醇、异丙醇作为辅助底物，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表7。 

表7：不同辅助底物下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  辅助底物   产率/%   e.e.值/%   乙醇   24.7   99.1   异丙醇   46.0   99.3   甘油   69.4   99.5   葡萄糖   98.6   99.4   乳糖   85.2   99.5   蔗糖   88.1   99.5

实施例11：不同葡萄糖浓度下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛 烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，分别添加不同浓度的葡萄糖，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表8。 

表8：不同葡萄糖浓度下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

实施例12：不同菌体浓度下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为10～100g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，葡萄糖的含量为30g/L，起始底物浓度为20g/L，于30℃，180r/min下反应18小时，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表9。 

表9：不同菌体浓度下（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  菌体量/g·L^-1  产率/%   e.e.值/%   10   56.7   99.2   50   84.6   99.4   75   98.9   99.5   100   98.5   99.5

[0080] 实施例13：不同反应时间下催化制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯 

粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5按实施例1方法培养72小时后，称取浓度为75g/L的湿菌体加入到50mL三角瓶装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，添加30g/L的葡萄糖，于30℃，180r/min下反应并于不同时间取样，反应结束后离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，将有机相用滤纸过滤，收集有机相，旋转蒸发去除溶剂，异丙醇重新溶解产物，进行气相色谱和高效液相色谱分析产物的产率和对映体过量值，结果如表10。 

表10：不同反应时间时（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的产率和e.e.值 

  时间/h   产率/%   e.e.值/%   1   16.8   64.3   6   75.4   92.5   12   95.5   99.0   18   98.7   99.5   24   98.2   99.5   30   98.3   99.4

实施例14：产物鉴定 

按实施例1所述方法生产粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CCZU-G5菌株，按实施例9进行转化，称取浓度为75g/L的湿菌体重新分散到装有20mL含50%异辛烷和磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.5）组成的两相体系中，起始底物浓度为20g/L，添加30g/L的葡萄糖，于30℃，180r/min反应18小时，离心除去菌体，取出上层有机相，下层水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋转蒸发去除溶剂，并用柱层析（石油醚：乙酸乙酯/5：1）分离纯化产物，减压蒸干溶剂，得到（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，e.e.值99.5%。 

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.27(d,J=7.2Hz,2H)；7.19(m,3H)；4.20(m,3H)；3.07(d,4.55Hz,1H)；2.75(m,2H)；2.11(m,1H)；1.95(m,1H)；1.27(m,3H) 用GC-MS分析其分子量为208.2，碎片离子峰分别为76.1，91.1，104.1，117.1，与标准质谱图对照，确定样品与标准品为同一物质。 

利用该菌株的培养条件和生物转化工艺，还可应用于其他羰基化合物的不对称生物催化中。 

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。