一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法，含以下步骤：(1)选取离体乳鼠皮层神经元；(2)选取离体大鼠骨髓间充质干细胞；(3)将大鼠骨髓间充质干细胞经预处理后，接种于乳鼠皮层神经元中进行共培养；(4)将共培养后的大鼠骨髓间充质干细胞和乳鼠皮层神经元经光镜、荧光显微镜、原子力显微镜及扫描电镜，确立模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型以及在超微结构上确定皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间生长趋势、相互作用及突触样结构的形成。其为间充质干细胞移植提供了一个简化的体外模型，同时此模型中所形成的突触样结构为间充质干细胞损伤机制提供了结构整合机制的体外证据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法。

背景技术

近年来，骨髓间充质干细胞，作为移植治疗中枢神经系统疾病的种子细胞之一，在基础实验与临床试验均得到了广泛的研究和关注。就当前的研究而言，骨髓间充质干细胞参与修复中枢神经系统疾病的机制主要包括：细胞替代，因子分泌，促血管生成等。为了进一步探索骨髓间充质干细胞与中枢神经系统中神经元之间的相互作用，并达到最简化的模型来对骨髓间充质干细胞修复中枢神经系统疾病机制的精确探索，那么将体内移植的实验转移到体外并模拟构建体外移植模型：即将皮层神经元与骨髓间充质干细胞行共培养，以观察两种细胞间的相互作用为基础，为后续众多研究提供研究方法，实验工具和深入研究的基础。

目前，还未有单位或者个人进行这个方面的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法，该方法通过将皮层神经元与骨髓间充质干细胞行共培养，观察两种细胞间的相互作用，建立一种模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型，并能观察到细胞间突触样结构的形成。

本发明的上述技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种模拟骨髓间充质干细胞移植体外模型的构建方法，含以下步骤：

(1)选取离体乳鼠皮层神经元，经培养鉴定后待用；

(2)选取离体大鼠骨髓间充质干细胞，经培养鉴定后待用；

(3)将大鼠骨髓间充质干细胞经预处理后，接种于步骤(1)的乳鼠皮层神经元中进行共培养，接种密度为1.0-5.0×10⁴个/cm²，共培养时间为4~6天；

(4)将共培养后的大鼠骨髓间充质干细胞和乳鼠皮层神经元经光镜、荧光显微镜、原子力显微镜及扫描电镜检测，确立模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型建立，并在超微结构上鉴定确定皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间突触样结构的形成。

本发明步骤(1)中离体乳鼠皮层神经元优选通过免疫荧光法来鉴定乳鼠皮层神经元。

本发明步骤(2)中大鼠骨髓间充质干细胞优选采用流式法进行鉴定。

本发明步骤(3)中大鼠骨髓间充质干细胞预处理时优选为：取步骤(2)中的大鼠骨髓间充质干细胞，经胰酶消化，离心后，再经DMEM/F12培养基、2%B-27和2%胎牛血清重悬处理大鼠骨髓间充质干细胞即可。

本发明具有如下优点：

(1)本发明为间充质干细胞移植提供了一个简化的体外模型，在此模型的基础上，可以继续深入的进行大量的基础研究，比如进行基因敲除来鉴定某些基因、小RNA及药物在移植过程中发挥的作用，为进一步研究间充质干细胞移植修复损伤的机制提供了很简化且很好的平台；

(2)本发明模拟的体外模型中所形成的突触样结构为间充质干细胞损伤机制提供了结构整合机制的体外证据；

(3)本发明模拟的体外模型，比起体内试验，能够更精确的反应修复过程中其决定性作用的因素，避免了体内微环境中复杂成分的干扰。

附图说明

图1是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图2是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天，高倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图3是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天抗MAP2蛋白阳性，荧光显微镜bar=100μm；

图4是实施例1中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天抗β-tubulin蛋白阳性，荧光显微镜bar=100μm；

图5是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图6是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，高倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图7是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天FITC同型对照阴性，流式细胞仪；

图8是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD34表达阴性，流式细胞仪；

图9是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD29表达阳性，流式细胞仪；

图10是实施例1中100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天CD90表达阳性，流式细胞仪；

图11是实施例1中共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图12是实施例1中共培养体系建立6天在共培养体系中神经元轴突呈沿着骨髓间充质干细胞表面或间隙迁移趋势，高倍倒置相差显微镜bar=100μm；

图13是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势，荧光显微镜bar=100μm；

图14是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈沿着骨髓间充质干细胞表面或者间隙迁移趋势（红色为神经元特异性表达蛋白β-tubulin），荧光显微镜bar=100μm；

图15是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势，原子力显微镜；

图16是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈沿着骨髓间充质干细胞表面或间隙迁移趋势，原子力显微镜；

图17是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成三围成像，原子力显微镜；

图18是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成的放大图，原子力显微镜；

图19是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势，扫描电镜×0.5K；

图20是实施例2中共培养体系建立6天神经元轴突呈沿着骨髓间充质干细胞表面或间隙迁移趋势，扫描电镜×0.5K；

图21是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成，扫描电镜×5K；

图22是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成，扫描电镜×10K；

图23是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成，扫描电镜×5K；

图24是实施例2中共培养体系建立6天后皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间类突触结构形成，扫描电镜×10K；

图25是本发明试实验流程图。

具体实施方式

以下结合实施例和对比对本发明进行阐述，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。以下就本发明的发酵培养说明。

实施例1模拟骨髓间充质干细胞移植的体外模型建立的方法

（一）皮层神经元的获取与培养：

动物选择：出生3天以内的wistar近交系乳鼠1只；

在冰上操作，断头，剥离乳鼠颅骨，暴露脑组织，使用显微器械分离出置于装有冷的DMEMF12培养基的培养皿中的大脑皮层；

将大脑皮层转移到无菌青霉素瓶中，并剪成约1mm×1mm×1mm大小的碎片，往瓶内加入0.015g/mL木瓜蛋白酶400μL，50mM乙二胺四乙酸（EDTA）60μL，1mg/mL半胱氨酸200μL和5.34ml DMEM/F12培养基摇匀于37℃培养箱中消化10分钟。胰酶抑制剂终止消化，使用吸管适当的吹散皮层，过滤，取滤液，离心；

用DMEM/F12培养基与2%B-27将离心所得细胞团块重悬，并以4.0×10⁴个/cm²接种于预先使用多聚左旋赖氨酸过夜铺板的24孔板内培养。

（二）皮层神经元的鉴定

由于微管相关蛋白-2（MAP2）蛋白和β-tubullin蛋白均为皮层神经元特异性表达蛋白，实验中通过免疫荧光对此蛋白表达阳性来鉴定皮层神经元。

用PBS将上述培养4天的皮层神经元清洗3次，用37℃、4%多聚甲醛固定20分钟；

PBS清洗3次，5%山羊封闭血清常温孵育45分钟；

分别加入抗MAP2与抗β-tubullin一抗，4℃孵育，过夜；

PBS清洗3次，加入羊抗兔荧光二抗37℃孵育2小时，

PBS清洗3次，加入DAPI染料，荧光显微镜下观察，其中出生3天内wistar乳鼠皮层神经元培养4天，倒置相差显微镜其低倍显微镜图如图1中所示，高倍显微镜图如图2中所示。图3表示细胞表达了神经元特异蛋白MAP2，图4表示细胞表达了神经元特异蛋白β-tubullin，故所培养的细胞为神经元。

（二）骨髓间充质干细胞的取材、培养：

动物选择：100-150g的wistar近交系大鼠1只；

无菌条件下，分离大叔股骨与胫骨，剪开骨骺端；

使用装有5ml DMEM/F12培养基的无菌注射器冲洗骨髓腔，收集冲洗液，400目滤网过滤，取滤液，1000r/min离心5分钟；

弃离心后上清液，加入DMEM F12培养基重悬细胞，接种，培养条件DMEMF12+10%胎牛血清。

细胞扩增至第二代，进行流式鉴定及实验，鉴定结果如图5-6，其中图5是100-150gWistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，低倍倒置相差显微镜bar=100μm；图6是100-150g Wistar大鼠骨髓间充质干细胞第二代培养4天，高倍倒置相差显微镜bar=100μm。

（三）骨髓间充质干细胞的流式鉴定：

1、0.25%胰酶消化2瓶长满的骨髓间充质干细胞，PBS清洗3次；

2、分别使用100μl PBS将细胞重悬成4管（1管为阴性对照），其余3管一次加入流式抗体CD29,CD44和CD90，避光室温孵育15分钟；

3、使用PBS清洗抗体孵育后的细胞，使用PBS调成适当的细胞悬液，流式细胞仪检测，图7表示培养的细胞在单纯的FITC染料中不带荧光，也就是FITC对细胞没有非特异着色；图8表示培养的细胞不表达造血干细胞特异蛋白CD34；图9与图10表示培养的细胞表达间充质干细胞特异性蛋白CD29和CD90。

（四）体外移植模型（共培养体系）的建立：

取1瓶长满的骨髓间充质干细胞，使用0.25%胰酶消化，收集细胞，1000r/min离心5分钟；

使用DMEM/F12培养基、2%B-27（其中B-27是神经元生长需要的一种试剂，申请人从美国invitrogen公司或美国sigma公司购买均可，其中sigma公司的货号是58672c，invitrogen公司的货号是17504044）和2%胎牛血清重悬骨髓间充质干细胞以1.0×104个/cm2接种于上述（一）的神经元中。

共培养体系培养4-6天，共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势如图11-12所示，图11-12表示共培养体系中神经元朝向骨髓间充质干细胞生长或者沿着骨髓间充质干细胞表面生长的2种趋势。

（五）体外移植（共培养体系）模型的形态学观察：

体外模型建立后，通过普通光镜、荧光显微镜、原子力显微镜及扫描电镜对模型的确立和皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间突触样结构形成的鉴定。

实施例2

体外模型建立后，通过免疫荧光显微镜、普通光镜、荧光显微镜、原子力显微镜及扫描电镜对模型的确立和皮层神经元与骨髓间充质干细胞之间突触样结构形成的鉴定。

其中免疫荧光图见图13-14，共培养体系建立6天神经元轴突呈朝向骨髓间充质干细胞迁移趋势如图13-14所示，图13-14是通过免疫荧光技术显示共培养体系中神经元朝向骨髓间充质干细胞生长或者沿着骨髓间充质干细胞表面生长的2种趋势。其中，细胞核为DAPI核染成蓝色，胞浆为β-tubulin表达阳性成红色，图13-14中表达β-tubulin阳性的神经元轴突在共培养体系中朝向骨髓间充质干细胞的生长趋势。

其中原子力显微镜的结果见图15-18，图15-16通过原子力显微镜显示共培养体系中神经元朝向骨髓间充质干细胞生长或者沿着骨髓间充质干细胞表面生长的2种趋势。图17-18表示在原子力显微镜下神经元轴突与骨髓间充质干细胞之间的突触样结构。其中图18是在图17的基础上放大了很多倍的图形，图17示共培养体系中，原子力显微镜显示的神经元轴突与骨髓间充质干细胞之间形成的类突触样结构，图18是对该类突触结构进行放大。BMSCs代表骨髓间充质干细胞；neuron代表神经元。具体步骤：共培养模型成熟后，标本尽量保存在4度且适当的湿度，使用PBS洗样品，2%多聚甲醛固定30分钟，双蒸水清洗3次；将标本置于原子力显微镜载物台上，原子力显微镜选择接触模式，悬臂系数为2牛/米，探针曲率为10纳米，探针扫描范围为125*125微米，扫描频率为1赫兹；输出图片及三围重建。

图19-20通过扫描电镜显示共培养体系中神经元朝向骨髓间充质干细胞生长或者沿着骨髓间充质干细胞表面生长的2种趋势。图21-24表示在扫描电镜下神经元轴突与骨髓间充质干细胞之间的突触样结构。BMSCs代表骨髓间充质干细胞；neuron代表神经元。↑：代表突触样结构。K：代表千。具体步骤：共培养模型成熟后，样品使用2.5%戊二醛固定液固定2小时后，PBS清洗3次；锇酸固定，PBS清洗3次；50%,70%,90%,100%酒精梯度脱水；标本喷金；上机观察。

通过上述模型的建立，然后使用倒置相差显微镜，荧光显微镜，原子力显微镜及扫描电镜四种形态学方法可以得出结论：

(1)共培养体系中神经元朝向骨髓间充质干细胞生长或者沿着骨髓间充质干细胞表面生长的2种趋势；

(2)神经元轴突与骨髓间充质干细胞之间的突触样结构形成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。