一株暗双孢AGR0073菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂与应用

摘要

本发明公开了一株暗双孢AGR0073菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂与应用，属微生物农药技术领域。所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂的活性成分为暗双孢（

说明书

技术领域

本发明涉及一株暗双孢真菌及其抗香蕉小窦氏叶斑病的微生物制剂的制备方法和应用，属微生物农药技术领域。 

背景技术

香蕉小窦氏叶斑病又称煤纹病，是由半知菌亚门簇生长蠕孢菌[Helminthosprium torulosum (Syd) Ashby]侵染引起的一种香蕉生产上较为严重叶部病害之一。早在20世纪30年代初期在中美洲和南太平洋地区普遍发生，70年代我国的台湾、广东、海南、云南等蕉区亦普遍发现。主要为害叶片引起蕉叶干枯，叶片的光合作用面积明显减少，导致植株早衰，影响果实充实，可减产30％以上。此外，病株的果实品质欠佳、不耐贮藏，容易腐烂。随着国际贸易的发展，水果的远距离销售和人员流动的增加，扩大了病害转播的途径，使病害的传播更为迅速和广泛，也给研究者们带来了巨大的挑战。 

目前对香蕉小窦氏叶斑病的防治尚无有效方法。在农业防治方面主要采用合理密植、清除园内杂草、合理施肥等技术提高植株抗病力外，对该病的控制主要还是集中在化学药剂防治。目前普遍采用的有铜制剂、有机硫类杀菌剂和敌力脱、抑霉唑等抑制甾醇类杀菌剂, 但是施药要求做好病害的监测和预测预报工作, 否则防效不理想，造成浪费和对环境造成污染, 提高成本，而且仅局限在小范围内控制病害的发生与蔓延。研究者们认为, 在探讨香蕉小窦氏叶斑病发生规律的基础上，研究切实有效的防治方法是当前研究工作的重点。 

随着病原菌生理小种的变异和抗药性产生，生物防治因环境和防治成本的要求而普遍受到研究者的重视。有研究表明，从香蕉叶面上筛选到具有拮抗活性的细菌菌株, 其在培养基条件下对香蕉小窦氏叶斑病菌表现出拮抗作用, 但很难在香蕉叶面繁殖，防病能力有限。目前，尚无抗小窦氏叶斑病微生物制剂田间应用的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一株对香蕉小窦氏叶斑病防治效果好的暗双孢菌株及抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂及其制备方法和应用。 

本发明目的是通过以下技术方案来实现的： 

1、本发明提供的一株暗双孢菌株是暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株。

2、一种抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂的制备方法，其步骤如下： 

（1）试管种培养

将暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养120h，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g，蔗糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

（2）液体种子培养

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：马铃薯 200g，蔗糖20.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121℃灭菌20min，冷却后接入1cm²的试管种，28℃下于转速为220 r·min^-1的摇床上培养72h得液体种子；

（3）制备所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂

采用三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯 200g，蔗糖20.0g，酵母浸膏5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却后接入10ml步骤

（2）培养得到的液体种子，28℃下于转速为220 r·min^-1的摇床上培养120h得发酵液；

③在发酵液中加入等体积的以质量分数计的100%丙酮，经摇床振荡12 h后，用转速为4000r·min^-1的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上25℃蒸发去除丙酮，用水稀释到原发酵液体积，即得到所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂。

3、一种抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂，所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂含有暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株。 

4、一种抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂，按上述技术方案2所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂的制备方法制备得到。 

5、上述技术方案1所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株在抗香蕉小窦氏叶斑病中的应用。 

6、上述技术方案3或4所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂在抗香蕉小窦氏叶斑病中的应用。 

将本发明所述的含有暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的微生物制剂，采用孢子萌发抑制法、菌丝生长抑制法及盆栽活体试验三种方法，试验该制剂对香蕉小窦氏叶斑病的防治作用表明： 

本发明所述的含有暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病具有显著的离体和活体防效，防治香蕉小窦氏叶斑病效果显著，可用于香蕉作物上小窦氏叶斑病的防治。

本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂在孢子萌发抑制法试验中，对香蕉小窦氏叶斑病菌孢子的萌发抑制率达到100%；在菌丝生长抑制法试验中，对香蕉小窦氏叶斑病菌菌丝生长的抑菌圈直径平均为20.48mm（5次重复），两项试验结果表明本发明暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病菌生长具有很强的抑制活性。 

盆栽活体试验结果表明：本发明暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对盆栽香蕉的小窦氏叶斑病表现出了显著的防治效果，平均防治效果达到91.71%。 

本发明具有原料成本低、生产工艺简单、防治效果好等优点，具有较好的应用前景。 

本发明所述的Cordana musae AGR0073 CGMCC No. 6644菌株于2012年09月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC），保藏号是CGMCC No. 6644，该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

具体实施方式

以下各实施例所用的各种试剂均为常规试剂，这些试剂及其它试验材料均可从商业渠道购买到。以下各实施例无特别说明为常规方法。 

实施例1  暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的获得、鉴定和培养。 

1、暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的获得。 

1.1 材料 

1.1 来源

本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株是从中国云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐捧镇一株巴西蕉(Musa AAA Cavendish subgroup cv. Brazil)根部分离得到。

1.2 培养基 

培养基配方：马铃薯200g；蔗糖20 g；蒸馏水1000m l；pH7.0。

1.3 方法 

样品消毒处理：预先取巴西蕉健康植株根部用自来水冲洗干净、晾干水分后，采用以下方法进行表面消毒：0.2%升汞消毒30s，无菌水冲洗后75%乙醇消毒60s，最后再用无菌水冲洗、晾干。所述的百分数是质量分数。

分离培养：上述巴西蕉根组织样品经处理完毕后，在无菌条件下，切成0.2cm×0.2cm片段移植于上述培养基内，置于28℃培养箱中培养。5—10d后，培养基中可见有菌落形成，挑取植物组织周围的菌落转接入斜面培养基中，经纯化后即得到内生真菌。所述的培养基的制备方法是：取马铃薯200g去皮后切成小块，加蒸馏水1000mL煮沸30分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，琼脂15g，pH 7.0。 

分类鉴定：采用真菌学插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。在显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、孢子着生状态等形态特征，确定所分离获得的内生真菌的分类地位。分类检索参照文献[1、2、3、4 ]。 

[1] 魏景超. 真菌鉴定手册[M] . 上海: 上海科学技术出版社,1979. 

[2] H. L 巴尼特, B.B 亨特. 沈崇尧译. 半知菌属图解[M] . 北京: 科学出版社,1977.

[3]中国科学院微生物研究所. 常见与常用真菌[M].北京:科学出版社, 1978.

[4]邵力平, 沈瑞祥, 张素轩, 等.真菌分类学[M] 北京: 中国林业出版社, 1984.

上述得到的内生真菌菌株在培养基平板上形成不规则橘黄色菌落，气生菌丝灰白、绒毛状。菌落生长较慢，接种3-4天后出现菌落，一个月左右产孢；分生孢子双胞、倒卵形，无色至淡褐色，隔膜处稍缢缩，脐点明显突出，大小为(14～18.5)μm×(9.0～11.5)μm。分生孢子梗直立或微弯曲，无分枝，褐色，隔膜数个。形态鉴定结果与Cordana musae的形态相吻合。

经上述鉴定表明所分离获得的菌株为暗双孢（Cordana musae），其代号定为AGR0073，所述的Cordana musae AGR0073菌株于2012年09月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC），保藏号是CGMCC No. 6644，该普通微生物中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

该暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的培养保存方法： 

短期培养保存：将暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株接种在PDA固体斜面培养基上（即马铃薯葡萄糖琼脂培养基），待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

长期培养保存：将暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株接种在装有脱脂牛乳滤纸片的安瓿管中，待菌丝长满后，用真空泵抽气至干，熔封后-20℃低温保存。 

实施例2：孢子萌发抑制法试验 

1、抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂及其制备方法

抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂的制备方法，其步骤如下：

（1）试管种培养

将所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养120h，获得试管种；所述的固体培养基的配方为：马铃薯 200g；蔗糖20g；琼脂15g；蒸馏水1000ml；pH7.0；

（2）液体种子培养

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体种子培养基，按液体种子培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体种子培养基，所述的液体种子培养基的配方是：马铃薯 200g；蔗糖20.0g；酵母浸膏5.0g；蒸馏水1000ml；pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入100ml所述的液体种子培养基，121℃灭菌20min，冷却后接入1cm²的试管种，28℃下于转速为220 r·min^-1的摇床上培养72h得液体种子；

（3）制备所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂

采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是：

①配制液体发酵培养基，按液体发酵培养基配方所述的各成分及其含量混合而成液体

发酵培养基，液体发酵培养基配方是：马铃薯 200g；蔗糖20.0g；酵母浸膏5.0g；蒸馏水1000ml；pH 7.0；

②在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却后接入10ml步骤

（2）培养得到的液体种子，28℃下于转速为220 r·min^-1的摇床上培养120h得到发酵液；

③在发酵液中加入等体积的以质量分数计的100%丙酮，经摇床振荡12h后，用转速为4000 r·min^-1的离心机离心15min，取上清液并在旋转蒸发仪上25℃蒸发去除丙酮，用水稀释到原发酵液体积，即得到所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂。

本发明所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂可以通过上述方法制备得到。 

2、制备香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子悬浮液 

香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子悬浮液的制备方法及其致病菌的分离按本领域的常规方法，具体是在云南省元江县的香蕉种植区采集小窦氏叶斑病典型病叶，用单孢分离法进行病原菌的分离，并通过柯赫氏法则验证菌株的致病性。菌株在PDA斜面上保存，备用。将香蕉小窦氏叶斑病菌接种到培养基上28℃下培养，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，于400nm日光灯照射下培养产分生孢子，2－3d待产生分生孢子后，用蒸馏水洗下分生孢子，并稀释成浓度为在10×10低倍镜下、每个视野30－40个分生孢子的香蕉小窦氏叶斑病分生孢子悬浮液备用。

3、孢子萌发抑制试验 

将上述制备的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂与配制好的香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子悬浮液等体积混合，取75μl加在凹玻片上，每处理5个重复，同时设清水为空白对照。在28℃下保湿培养24h后察看空白对照分生孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发，当空白对照分生孢子的萌发率达到85%后，观察抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子萌发的抑制情况。其中对照孢子萌发率是97.62%，处理的5个重复的孢子萌发率均为零，按以下公式计算孢子萌发抑制率为100%。

孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率）/（对照孢子萌发率）×100% 

实验结果表明，用含有本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子的萌发抑制率为100%。

实施例3：菌丝生长抑制试验 

菌丝生长抑制试验：在内径为9cm的已灭菌培养皿中倒入10ml的水琼脂培养基，水琼脂培养基配方为：琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0 。将实施例2制备的香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子悬浮液1ml与10 ml培养基充分混匀，倒入已盛有10ml的水琼脂培养基的培养皿中，制成双层带菌培养基。菌丝生长抑制实验采用常规的杯碟法，即在每个带菌双层平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入实施例2所述的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂0.2ml，以清水为空白对照，重复5个样品，置28℃恒温箱中培养72h后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。

实验数据：5次重复抑菌圈直径测量结果分别为19.40mm、21.5 mm、20.7 mm、19.6 mm、21.2 mm，平均为20.48 mm。实验结果表明：含有本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病菌的菌丝生长具有较强的抑制作用。 

实施例4  温室盆栽活体试验 

试验用香蕉苗的准备方法：在塑料大棚中，将组培的香蕉苗洗净根部的培养基后，移栽于育苗袋中，待香蕉苗长出3~4片叶（约1个月）后，再移植于直径30cm的育苗盆中，移栽后经常淋水保湿，每周施肥（每株2g/次复合肥溶于水中施用，以质量分数计，复合肥中的N-P₂O₅-K₂O为15-15-15）1~2次。待香蕉苗长出6~8片叶（约2个月）后，备用。

将实施例2所制备的本发明抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂喷施在长势一致的上述盆栽香蕉植株上，待药液晾干后，用悬滴法将实施例2制备的香蕉小窦氏叶斑病菌分生孢子悬浮液接种在香蕉叶片上，每株香蕉苗接种3－5片叶，每片叶接种10滴，同时设清水为空白对照，接种后置于28℃培养箱中保湿培养6d后，观察本发明抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉叶片上香蕉小窦氏叶斑病发病的抑制情况，统计各处理叶片接种点发病率、发病严重度和病情指数，并计算防治效果。 

药效的计算采用下列两公式： 

病情指数= [〔∑（病级叶数×代表级数）〕/（叶数总数×最高代表级值）]×100

防治效果（%）=[（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数]×100%

实验数据： 含有本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂对香蕉小窦氏叶斑病4次重复的温室盆栽防治效果分别为92.47%、 91.24%、 90.97%、92.14%，平均为91.71%。实验数据表明：含有本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株的抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂在盆栽香蕉上也表现出显著的防治效果，其对香蕉小窦氏叶斑病的平均防治效果为91.71%，与其室内离体抑菌效果具有较好的相关性。表明本发明所述的暗双孢（Cordana musae）AGR0073 CGMCC No. 6644菌株及其抗香蕉小窦氏叶斑病微生物制剂能实际应用，对香蕉小窦氏叶斑病具有显著的离体和活体防效，防治香蕉小窦氏叶斑病效果显著。