用于在RNA噬菌体的病毒样颗粒上进行肽展示和亲和选择的质粒和方法

摘要

本发明涉及调控病毒样颗粒(VLPs)，尤其是包括MS2VLPs上的肽展示效价的系统和方法。在该方法中，可以由单一RNA产生大量野生型和少量单链二聚体外壳蛋白。通过提供这样的系统来调控免疫原(疫苗)生产中的效价，所述系统使得可以由单一RNA产生大量野生型和少量单链二聚体外壳蛋白，从而能够在大范围内(从每个颗粒平均小于1到多达90个)灵活地调节VLPs，特别是MS2VLPS上的展示效价水平。这将有助于免疫原和疫苗，包括呈现低效价的VLPs的产生。本文公开了可用于表达病毒样颗粒的核酸构建体，所述颗粒由通过插入异源肽被改造的MS2外壳多肽构成，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上并包裹MS2mRNA。还公开了可用于表达病毒样颗粒的核酸构建体，所述颗粒由通过插入异源肽被改造的PP7外壳多肽构成，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上并包裹PP7mRNA。

说明书

相关申请和基金支持

本申请要求:2009年12月31日提交的名为"Control of Peptide Display  Valency on VLPs"的美国临时申请61/335,122；2009年12月31日提交的名 为"Plasmid Vectors for Facile Construction of Random Sequence Peptide  Libraries on Bacteriophage MS2VLPs and Related Constructs,Libraries,and  Methods"的美国临时申请61/335,120；以及2009年12月31日提交的名为 “Peptide Display on Virus-Like Particles of Bacteriophage PP7”的美国临时申 请61/335,121的优先权，每个申请的内容均通过引用全部并入本文。

本专利申请得到了National Institutes of Health的基金GM042901和 RO1AI065240的支持。美国政府对本申请拥有某些权利。

发明领域

本发明涉及在RNA噬菌体，特别是MS2和PP7的病毒样颗粒(VLPs) 上进行肽展示的系统和方法。描述的方法和质粒载体用于协助构建高复杂度 的随机序列和抗原片段文库，从而由其经亲和选择分离具有所需结合功能的 肽。由于肽展示的密度是亲和选择严紧度的一个重要决定因素，还描述了用 于控制VLPs上肽展示效价的方法和质粒。本发明的方法使得可以在大范围 内灵活地调节VLPs，特别是MS2VLPs上的展示效价水平(即从每个颗粒上 平均低于1到多达90)，从而促进免疫原和疫苗的鉴定和生产，包括展现低 效价的VLPs。尽管该系统主要是为了疫苗开发而建立的，它在许多其他应 用中也有用途，包括鉴定可用于细胞型或组织型特异性靶向递送药物和造影 剂的肽-VLPs，和新材料的模板法合成。

本申请描述了协助实施VLP展示系统的方法和质粒载体。发明提供了 可用于病毒样颗粒的表达的核酸构建体，所述病毒样颗粒包含MS2或PP7 的外壳多肽，各自经插入异源肽进行了改造，其中所述异源肽被展示在病毒 样颗粒上，并包裹着特定的RNA(MS2或者PP7的RNA)，后者引导VLP 以及其上展示的肽的合成。还提供了相关的病毒样颗粒、方法和免疫原性组 合物。

发明背景

VLPs作为疫苗。近年来重组DNA技术的发展引领了疫苗的产生，其中 免疫原性蛋白经过鉴定、克隆并在合适的宿主中表达以获得足够量的蛋白， 从而在动物和人中达到有效的保护性免疫。最有效的疫苗中有许多是基于毒 粒表面强有力引发中和抗体的能力。这包括已被许可的能够有效诱发保护性 抗体反应的灭活或减毒病毒疫苗，比如脊髓灰质炎、流感和狂犬病疫苗。最 近，Food and Drug Administration批准的亚基疫苗是基于人乳头瘤病毒(HPV) 和乙肝病毒(HBV)的结构蛋白的自我组装。所述亚基在合适的宿主中得以表 达，然后自组装成某种颗粒，其在结构上类似真正的病毒，但因缺少病毒基 因组而没有感染性。这些所谓的病毒样颗粒(VLPs)大体来说是高度免疫原性 的，因为组成它们的结构蛋白在每个单独的颗粒中有多个拷贝。这种高密度 抗原呈递使得这些颗粒能够特别有效地激发强抗体反应。HBV和HPV疫苗 是基于由相应病毒自身的结构蛋白组装而成的VLPs，但VLPs也可以作为 支架用于异源表位的高密度展示。由于VLPs一般代表了高度重复，因此也 是高度免疫原性的结构，它们可以来源于任何数量的不同病毒类型。发明所 述方法致力于利用RNA噬菌体(尤其是MS2和PP7)VLPs，通过与噬菌体 展示[1，2]类似的方法进行免疫原展示和表位搜寻。

RNA噬菌体。单链RNA噬菌体是一组在自然界中广泛分布的病毒。有 多种RNA噬菌体在基因组序列、分子生物学和衣壳结构与组装方面已被深 入研究过。MS2可能是这组病毒中被最好地研究过的成员，也是发明人实验 室中进行过的多数工作的重点，虽然我们的近期工作也探索了称为PP7的相 关噬菌体。MS2含有3569个核苷酸组成的单链RNA基因组，其仅编码四 种蛋白:成熟酶、外壳、裂解和复制酶。病毒颗粒由180个外壳多肽、一个 成熟酶分子和一个拷贝的RNA基因组构成。因为外壳蛋白自己完全负责二 十面体壳的形成，可以由质粒以单个基因的产物生成MS2VLP。因此，与 用于肽展示的其他噬菌体相比，RNA VLPs出奇地简单。发明人近期报道[1, 2]了对MS2和PP7VLPs进行改造用于肽展示和亲和选择，本文件后面也将 有描述。

通过常规噬菌体展示进行的表位鉴定。噬菌体展示是可能呈递大的随机 氨基酸序列文库的几种技术中的一种，其目的在于从中挑选具有某些特定功 能(例如，结合特定抗体的能力)的肽。最常用的噬菌体展示方法建立在丝状 噬菌体(例如M 13)的基础上。基本的想法是生成重组噬菌体基因组，所述重 组噬菌体基因组含有随机化序列文库，这些随机化序列在噬菌体的DNA基 因组中与病毒结构蛋白之一进行了基因融合。这些重组体被转染到细菌中 时，每个生产出的病毒颗粒在其表面展示特定的肽并包装着编码所述肽的相 同重组基因组。这就建立了对所述方法很重要的基因型和表现型的联系。通 过利用亲和选择，然后将选中的经过在大肠杆菌中生长进行扩增，可以从复 杂的肽展示噬菌体文库中挑选任意功能(例如能够结合受体，免疫原性)。在 非常大的肽展示噬菌体文库中，很小的一部分能够结合特定受体(例如单克 隆抗体)，可以通过亲和纯化，然后在大肠杆菌中增殖而对它们进行扩增。 通常反复进行几轮选择和扩增即可得到较为简单的群体，从中将展示具有所 需活性的肽的单个噬菌体克隆，然后进行表征。当选择分子是抗体时，这样 鉴定到的肽代表该抗体能够识别的表位，并且在合适的条件下，可能能够在 接受免疫的患者或动物中激发象该表位在其天然抗原中激发的特异抗体反 应。

但是丝状噬菌体展示存在缺陷。最重要的是，丝状噬菌体分子生物学的 某些怪异之处使得它很难或者不可能以足够引起真正强的免疫原性的高密 度对肽进行展示。这意味着虽然可以通过亲和选择鉴定到肽表位，但要把它 们作为免疫原(即疫苗)，还是必须化学合成，然后偶联上免疫原性更强的载 体。不幸的是，肽在亲和选择和优化过程中，当脱离它所处的结构环境时经 常失去活性。相反，本文描述的RNA噬菌体VLP展示系统建立了在单一平 台上进行亲和选择以及免疫原性表位呈递的能力。这是高密度肽表位展示和 亲和选择性能结合在一起的结果，意味着在免疫过程中可以维持表位在亲和 选择时的结构制约，从而提高了表位保留激发预期抗体反应所需的结构的可 能性。

RNA噬菌体VLP展示方法的概述。发明人先前描述过基于RNA噬菌 体(包括MS2和PP7)VLPs的肽展示和亲和选择技术[1.2]，此处仅作简单 解释。VLP展示方法的建立需要满足两个前提条件:首先必须鉴定到一种形 式的RNA噬菌体外壳蛋白，和它内部的一个位点能够容忍插入外来肽而不 破坏它恰当折叠并组装成VLP的能力。外壳蛋白表面上的AB环被选中作 为肽插入位点。插入这里的肽突出展示在VLP表面。不幸的是，野生型外 壳蛋白对于在AB环插入肽极其不容忍，绝大多数(通常>98%)最终不能折 叠。外壳蛋白正常情况下折叠成二聚体，90个二聚体组装成二十面体VLP。 发明人设计制成了新型外壳蛋白使它更稳定，并且更容忍AB环插入。为了 这个目的，发明人利用了二聚体中两个相同多肽链N和C末端的接近性(图 1)。通过复制外壳蛋白编码序列，然后将两个拷贝融合成单个读框，发明人 制作了所谓单链二聚体。蛋白的这种形式在热动力学上显著更稳定，其折叠 对插入到单链二聚体中下游拷贝的AB环中的肽明显更容忍[1，2]。得到的 VLPs每个二聚体展示一个肽，或者每个VLP展示90个肽。肽展示/亲和选 择性能的第二个前提条件是表现型与基因型的关联性，因为给亲和选择到的 序列提供一个扩增手段很重要。该项要求的满足是发明人证实RNA噬菌体 VLPs包裹着引导其合成的信使RNA[1,2]。这意味着亲和选择到的肽-VLPs 可以通过逆转录和聚合酶链式反应来扩增。当选择目标是单克隆抗体时，得 到的亲和选中的VLPs代表了用于在动物或患者中激发抗体的疫苗候选物， 所述激发的抗体的活性模拟挑选使用的抗体的活性。

与肽展示效价及其控制相关的考虑。本申请描述了这样的质粒载体，所 述质粒载体能够帮助构建位于RNA噬菌体VLPs上的复杂随机序列和抗原 片段文库，以及从所述文库中亲和选择与特异单克隆抗体(或其他任意受体) 结合的肽。注意正如前面描述过的，因为单链二聚体的一个AB环中插有肽， VLP由90个二聚体构成[1，2]，所以RNA噬菌体VLP展示技术在每个VLP 上呈递90个肽。这些颗粒的多价性对于MS2VLP的多数应用是有益的。例 如，颗粒的高免疫原性与展示肽的高密度相关，因此是疫苗的一个可贵属性。 但是，在亲和选择过程中，多价性使得很难将颗粒区分开，比如展示对选择 目标有固有的高结合亲和力的肽的颗粒和只是由于多个同时的弱相互作用 而紧密结合的颗粒。这种“亲合力(avidity)vs.亲和力(affinity)”的困局是利 用丝状噬菌体展示选择高亲和力肽配体过程中有大量记载的复杂情况[3-5]。 本发明通过引入一个在大范围内(即从平均每个颗粒效价小于1到多达90) 调节肽展示平均效价水平的手段，解决了VLP展示系统中的这个问题。这 使得有可能在亲和选择过程中改变肽展示的密度。筛选分几轮进行，第一轮 通常利用多价展示进行，这样得到比较复杂的群体，包含对目标物有某些最 低亲和力的所有肽。在随后的几轮中，可以降低肽展示效价，从而提高筛选 严紧度，导致分离到对抗体目标物质有更高亲和力的肽，和更佳的优选表位 模拟分子。

发明目的

发明的一个目的是提供展示低效价异源肽的VLPs。

发明的另一个目的是提供制备VLPs，包括展示低效价或高效价异源肽 的VLPs的核酸构建体。

发明的再一个目的是提供制备VLPs，包括可以控制低效价或高效价异 源肽的展示的VLPs的核酸构建体。

发明还有一个目的是提供制备VLPs，包括可以控制低效价或高效价异 源肽的展示的VLPs的核酸构建体，从而达到鉴定高亲和力免疫原以及将这 些免疫原用于医疗和其他制剂或应用的目的。

发明的另一个目的是提供鉴定免疫原性肽的方法，所述免疫原性肽显示 对选中的抗体有高亲和力。

发明的再一个目的是将高亲和力肽合并到VLPs中。

发明的其他目的是提供利用本发明的VLPs的免疫原性的方法和组合 物。

发明的这些和/或其他目的中的任何一个或多个可以容易地从以下的发 明描述中得出。

发明概述

本发明涉及组合物、结构(包括质粒)、系统和方法，所述组合物、结构、 系统和方法能够协助构建高度复杂的任意序列和抗原片段肽文库，并且使得 可以对MS2VLPs上展示的肽的效价(即密度)进行调控，从而提供了更有效 的鉴定和提供VLPs的手段，其中所述VLPs选择性地引入了免疫原性肽。 本发明是美国专利公开US2009/0054246和专利申请PCT/US2007/018614(以 WO08/024427公开)中公开的方法、组合物、颗粒、单位以及其他公开内容 的延伸，这两份专利申请的全部内容通过引用并入本文，并且在上文和[1,2, 6,7]中进行了简要描述。

本发明认为通过选择对给定单克隆抗体亲和力最高的肽可以提供天然 抗原的最佳分子模拟物，并且这些肽最有可能提供或诱发出相关的抗体反 应。这些肽预计特别适合用于在患者中诱发免疫原性和提供保护性应答。由 这些肽制备的和/或引入了这些肽的疫苗更有效，而副作用减少，特别是在 没有佐剂的情况下给予的发明所述的疫苗。

本文描述了质粒载体，所述质粒载体可以协助构建位于RNA噬菌体 MS2的VLPs上(pDSPl和pDSP62)和来源于RNA噬菌体PP7的VLPs上 (pET2P7K32和pDSP7)的任意序列或抗原片段肽文库。这些载体使得有可能 制备含有超过10¹¹-10¹²个独立成员的文库。但是，这些载体产生的VLPs 一致以高密度(即每个VLP展示90个)展示外来肽。正如以上解释过的， 由于这样赋予了肽高水平的免疫原性，对于疫苗应用是一个明显的优点，但 经常给亲和选择过程带来问题，因为高效价会降低选择的严紧度，使得难以 优先挑选到群体中结合最紧密的种类。

本发明给肽展示效价调控问题提供了简单的解决方案，即一个允许由单 一RNA生产大量野生型外壳蛋白和少量含有长度至少四个(4)氨基酸的异源 肽的单链(优选二聚体)外壳蛋白的系统。这个方法包括构建比如pDSPl(am)、 pDSP62(am)、pET2P7K32(am)和pDSP7(am)的质粒。这些是上文描述的质粒 的简单变体，它们经过改造含有终止密码子(优选琥珀终止密码子)，代替了 例如通常编码单链二聚体中下游外壳蛋白拷贝的第一个氨基酸的密码子(丙 氨酸)。由于这些质粒在单链二聚体两部分的连接处有一个终止密码子(参见 例如pDSPl)，它们正常情况下只产生单位长度的野生型外壳蛋白，后者当 然组装成VLP。而在本方法中，质粒或第二质粒(例如pNMsupA)经过改造 含有插入的tRNA基因[8,9]，比如丙氨酸插入抑制型tRNA基因，其表达处 于启动子(例如位于来自不同不相容群的氯霉素抗性质粒上的lac启动子)的 调控下，这样抑制型tRNA产生的量导致翻译外壳序列的核糖体中有小部分 通读过终止密码子，产生了包含异源肽的单链二聚体。得到的蛋白含有的外 来异源肽优选插入在例如蛋白的第二个AB环或者羧基末端或者下游亚基内 的其他位点，与由相同mRNA表达的野生型蛋白共同组装形成镶嵌的VLPs， 表现出低效价。

根据本发明的方法，可以有控制地产生VLPs，使每个VLP上呈递少于 1个或者多达九十个(90)异源肽，优选每个VLP上呈递大约一个至大约十个 (10)异源肽，更优选每个VLP上呈递大约1至大约5个异源肽，更优选每个 VLP上呈递大约1至大约3个异源肽，最优选每个VLP上呈递大约2至大 约4个异源肽。根据本发明，肽密度的降低导致可以提高VLPs的亲和选择 严紧度，从而容易鉴定到高亲和力肽，之后回到高展示密度平台时，变成强 免疫原性。琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹证实按照本发明产生的颗粒包裹 着相关的RNA。本发明的方法还提供了通过控制抑制型tRNA的表达水平 在大范围内调节效价(每个VLP产生的肽的数量)，例如通过调节抑制型 tRNA的合成水平，而实现所述合成水平的调节可以通过例如由启动子(例如 proB或其他合适的启动子)引导tRNA的表达，其中所述启动子的活性受到 诱导物浓度的调节。还可以通过使用具有更高或更低内在抑制效率的不同抑 制型tRNAs或其突变体来控制效价水平。

人们可能会想知道是否可以通过将重组蛋白与过量的野生型外壳蛋白 共表达，从而使得产生的镶嵌壳体中的外来肽含量下降而更简单地实现效价 的控制。不幸的是，这种方法不现实，因为要把效价降低到合适的水平(例 如降到平均每个VLP有低于1或者少数几个肽)需要表达的野生型蛋白大大 超过重组肽。该共表达策略将产生过多的无关(即不是编码外来肽的)RNA， 这些RNA由于极其丰富，会优先于肽编码RNA被包装在VLPs中。因为具 体的衣壳化似乎不依赖于RNA中存在的任何简单包装信号(1)，看上去没有 简单的方法可以标记占少数的肽编码RNA使它们被选择性地衣壳化。可以 想见这种共表达方法会有一些变化形式是可行的，但这些变化形式常常太过 复杂。我们的系统通过由单一mRNA产生两种形式的蛋白解决了这个问题。

作为例子，可以利用以下实施方案来进一步示范本发明。应当指出，下 文包含的每个实施方案中，MS2外壳多肽或PP7外壳多肽可以用于各个核 酸构建体，但不应当看作是只限于MS2或PP7外壳多肽，除非对于描述语 境来说这样的限制是合适的。

本发明的一个实施方案提供核酸构建体(参见例如pDSPl)，其包含:

(a)细菌或噬菌体启动子(例如象以下发明详述部分描写的)，其可操纵 地连接噬菌体MS2单链外壳多肽二聚体的编码序列，其中所述外壳多肽二 聚体编码序列经过改造限定一个第一限制性酶切位点(例如SalI或KpnI)，该 位点位于序列中限定外壳多肽二聚体AB环的部分的5’方向；

(b)第二限制性酶切位点(例如BamHI)，其位于外壳多肽二聚体编码序 列的3'方向；

(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位点的5’方向和第二限制性酶切位 点的3’方向(发明详述中给出了相关PCR引物的定义和列表)；

(d)抗生素(例如卡那霉素)抗性基因，和

(e)用于在原核细胞内进行复制的复制原点(例如来自质粒ColE l的复 制原点)。

本发明另一个实施方案中提供核酸构建体(参见例如pDSP62)，其包含:

(a)细菌或噬菌体启动子，其可操纵地连接噬菌体MS2单链外壳多肽二 聚体的编码序列，其中所述单链二聚体序列的两部分之一经过多个沉默核苷 酸取代的改造(即“密码子颠倒(codonjuggled)”)产生改造的二聚体，从而使 得致突变寡核苷酸引物可以特异地与所述改造二聚体中被改造的一半或者 未被改造的一半退火(优选地，AB环任何一侧20个核苷酸单元内有足够数 量的突变使两条序列可以通过与引物的杂交情况区别开);

(b)第一限制性酶切位点(例如SalI)，其位于外壳序列中限定AB环的那 部分的5’方向；

(c)第二限制性酶切位点(例如BamHI)，其位于外壳多肽二聚体编码序 列的3'方向；和

(d)PCR引物，位于第一限制性酶切位点的5’方向和第二限制性酶切位 点的3’方向(发明详述中给出了相关PCR引物的定义和列表)；

(e)第一抗生素抗性基因;

(f)用于在原核细胞内进行复制的复制原点;

(g)来自单链DNA噬菌体(例如M l3或fd)的第二复制原点；以及

(h)辅助性单链DNA噬菌体(例如，M13、fd)，其经过改造含有赋予对第 二抗生素抗性的基因。

在另一个实施方案中，相对本发明的核酸构建体，噬菌体MS2(或者PP7) 单链外壳多肽二聚体的编码序列还包含编码异源肽的核酸序列，并且所述构 建体任选包含位于第二限制性酶切位点3’方向的转录终止子。这种核酸构建 体可用于包含被插入异源肽的MS2(或PP7)外壳多肽的病毒样颗粒的表达， 其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上，并包裹着MS2(或PP7)mRNA。

另一个实施方案中(例如pET2P7K32)，核酸构建体包含:

(a)细菌或噬菌体启动子，其可操纵地连接噬菌体PP7(或MS2)单链外 壳多肽二聚体的编码序列，其中所述外壳多肽二聚体编码序列经过改造限定 一个第一限制性酶切位点，该限制性酶切位点位于外壳多肽二聚体编码序列 的下游部分并且位于限定外壳多肽二聚体AB环的序列之内或者5’方向；

(b)第二限制性酶切位点，其位于外壳多肽二聚体编码序列的3'方向；

(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位点的5’方向和第二限制性酶切位 点的3’方向(发明详述中给出了相关PCR引物的定义和列表)；

(d)抗生素抗性基因，和

(e)用于在原核细胞内进行复制的复制原点。

在替代的实施方案中(例如pDSP7)，核酸构建体包含:

(a)细菌或噬菌体启动子，其可操纵地连接噬菌体PP7单链外壳多肽二 聚体的编码序列，其中所述单链二聚体序列的一半经过多个沉默核苷酸取代 的改造(即“密码子颠倒”)使得致突变寡核苷酸引物可以特异地与一半或者 另一半退火(优选地，AB环任何一侧20个核苷酸单元内有足够数量的突变 使两条序列可以通过与引物的杂交情况区别开);

(b)第一限制性酶切位点，该限制性酶切位点位于外壳多肽二聚体编码 序列的下游部分并且位于限定外壳多肽二聚体AB环的序列之内或者5’方 向；

(c)位于外壳多肽二聚体编码序列的3'方向的限制性酶切位点；

(d)PCR引物，位于第一限制性酶切位点的5’方向和第二限制性酶切位 点的3’方向(发明详述中给出了相关PCR引物的定义和列表)；

(e)第一抗生素抗性基因;

(f)用于在原核细胞内进行复制的复制原点；

(g)来自单链DNA噬菌体(例如M l3或fd)的第二复制原点；

(h)辅助性单链DNA噬菌体(例如，M13、fd)，其经过改造含有赋予对第 二抗生素抗性的基因。

在本发明的另一个实施方案中，核酸构建体包含

(a)细菌或噬菌体启动子，其可操纵地连接噬菌体MS2或PP7单链外壳 多肽二聚体的编码序列，其中所述外壳多肽二聚体编码序列经过改造(1)限 定一个第一限制性酶切位点，该限制性酶切位点位于外壳多肽二聚体编码序 列的下游部分并且位于限定外壳多肽二聚体AB环的序列之内或者5’方向; 和(2)含有核苷酸序列(NNS)X，其中N是任意核苷酸，S是鸟苷核苷酸(G) 或者胞嘧啶核苷酸(C)，并且x是从1到500的整数；

(b)第二限制性酶切位点，其位于外壳多肽二聚体编码序列的3'方向；

(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位点的5’方向和第二限制性酶切位 点的3’方向;

(d)抗生素抗性基因;以及

(e)用于在原核细胞内进行复制的复制原点。

在本文描述的发明的某些实施方案中，以上列举的元件中的某一些可能 是任选的，但优选包含在构建体中。

在其他实施方案中(例如以上描述的质粒的衍生质粒，被称为DSP 1 (am)、pDSP62(am)、pET2P7K32(am)和pDSP7(am))，通过包含以下额外特 征赋予了对展示效价的调控:

(a)无义密码子(例如本文描述的琥珀密码子)，其位于单链二聚体上游 和下游一半的连接处；

(b)质粒(例如pNMsupA)，其产生的抑制型tRNA(例如丙氨酸插入琥珀 抑制序列)能够部分抑制在以上(a)中描述的无义密码子的地方发生的翻译终 止。该质粒含有来自第二个不相容群的复制原点，并且赋予对第二抗生素的 抗性，因此使它能稳定维持在细菌中，所述细菌还含有以上描述的产生外壳 蛋白的质粒。

关于疫苗候选物的文库构建和亲和选择的概述。这里以MS2VLP系统 作为例子，但应该理解类似的方法可以应用于本申请中还提出的PP7系统。

1.文库构建。可以通过两种方法中的任一种产生随机序列文库。这些 方法在下文有更详细的描述，并在图9b和15中阐释。(A)将PCR产物克隆 到pDSPl中的SalI和Bam HI之间，随机序列的附着方式使它们被导入AB 环。该方法适用于方便地构建复杂度较低的文库(一般是10⁷-10⁸个成员)， 但不便于提升到更高的水平。(B.)对于更高复杂度的文库(例如10⁹-l0¹¹或 以上)，将合成寡核苷酸引物与单链形式的pDSP62退火，利用DNA聚合酶 延伸产生双链环形分子，然后利用DNA连接酶将该双链环形分子共价闭合 (参见图12)。通过两种方法中的任一种产生的重组DNA分子被导入合适的 大肠杆菌表达菌株(例如BL21(DE3))，它们在菌株中合成VLPs。由pDSPl 或pDSP62产生的颗粒以每个颗粒90的密度(高密度)展示外来肽。

2.亲和选择。通过将VLP文库经过一个过程(例如生物淘选或者其他快 速鉴定和分离对抗体显示高亲和力的肽的方法)进行亲和选择，在所述过程 中单克隆抗体被吸附在多孔塑料培养板中一或多个孔的表面。VLP文库溶液 与固定化抗体一起温育，然后将未结合的VLP洗下来丢掉，通常通过降低 溶液pH将所有结合的VLPs洗脱。

随后，洗脱下来的VLPs被热变性，它们所含的RNA利用与RNA 3’端 附近(BamHI位点的很下游)退火的寡核苷酸引物通过逆转录拷贝为DNA。 然后利用与第一限制性酶切位点(例如SalI)上游和第二限制性酶切位点(例 如BamHI)下游特异退火的引物经PCR扩增得到的cDNA。

3.再克隆。以上获得的PCR产物用第一和第二限制性内切酶(例如SalI 和BamHI)消化，然后再次克隆到合适的表达载体中。如果第二轮筛选要在 低肽效价进行，PCR产物可以克隆到pDSPl(am)或pDSP62(am)中，整个选 中的群体被导入含有pNMsupA的大肠杆菌表达菌株(参见图7)。这样产生的 VLPs平均来说只会展示少数几个拷贝的外来肽(即低效价)，而且因为它们是 已经经过亲和选择的，所以呈现的是比初始文库呈现的简单得多的肽群体。

4.按照以上描述反复进行额外几轮亲和选择和再克隆。一般来说，两 到四轮，或者优选三到四轮(在高效价进行一或两轮，然后低效价进行一或 两轮)即足以产生一个简单的展示与筛选使用的单克隆抗体牢牢结合的肽的 VLPs群。当认为筛选结束时，序列再次被克隆到pDSPl或pDSP62中，肽 又被高密度(高达每颗粒90个肽)展示以达到最大的免疫原性。获得各单独克 隆并通过DNA序列分析进行表征。评估它们在体外对筛选时使用的抗体的 亲和力并确定其引发所需抗体反应的能力。在采用已被充分研究过的单克隆 抗体目标物进行的演示试验中，发明人回收到一些肽，这些肽的序列模拟先 前鉴定到的表位的序列。用得到的VLPs免疫动物产生了识别原来的抗原的 表位的抗体。

质粒和发明的其他方面在以下发明详述中有进一步描述。

由以下对发明的描述可以容易地进一步得到符合本发明的以上实施方 案和/或其他实施方案中的任何一或多个。

附图简述

图1图示了MS2外壳蛋白二聚体的结构。左上图板强调了两个亚基链 N和C末端的接近程度。这一特点有助于构建对插入外来肽有高容忍度的单 链二聚体。还图示(左下)了AB环在二聚体中和在完整VLP中的高可接近性。 右侧显示了VLP本身的结构。构成VLP的外壳蛋白根据准等构原则处于三 种略有不同的构象，以红、蓝和绿色表示。AB环以黄色表示。注意它们的 重复特点以及暴露在VLP表面的情况。

图2显示随机序列肽库在VLPs上展示的基本情况。通过重组DNA方 法制备随机序列肽插入文库，得到的质粒群经转化导入大肠杆菌，从而产生 VLPs文库。群体中各个单独的VLP在其表面展示不同的肽并且里面(以 mRNA的形式)含有决定其合成的遗传信息。

图3阐述了亲和选择的过程。将代表随机序列肽文库的一个VLPs群与 固定在表面的单克隆抗体一起温育。一般来说，绝大多数的VLPs不能与抗 体结合，而是被洗掉并丢弃。然后将任何其肽表现出对抗体的结合的VLPs 特异洗脱，通过逆转录将它们含有的RNA拷贝为DNA，经PCR扩增，然 后再克隆到表达质粒(例如pDSP62或pDSP62(am))中产生经亲和选择而选出 的VLP。通常选择要反复进行几次(即两次以上)，优选3-5轮。

图4显示了肽展示效价的重要性。多价展示使得很难将内在的紧密结合 分子和同时与多个受体相互作用的弱结合分子区分开。通常第一轮亲和选择 在高效价进行，但后续的轮中效价被降低到低水平，这样可以提高选择严紧 度，保证分离到对选择使用的抗体有最高亲和力的肽。

图5显示了质粒pDSPl，其中的克隆位点方便进行AB环插入。pDSPl 表达经过改造含有例如独特的SalI和KpnI限制性酶切位点的单链二聚体编 码序列。该二聚体有助于将外来序列简单地克隆到AB环内。要保证这些位 点是独特的，需要破坏掉载体和上游外壳序列中的几个SalI和KpnI位点。

图6显示了质粒pDSP62。为了辅助单链DNA的产生，在质粒中引入 M13复制原点，根据M13原点的方向命名为pDSP61和pDSP62。该质粒在 单链二聚体上游一般还含有所谓“密码子颠倒的”外壳序列。密码子颠倒的 一半所编码的氨基酸序列与下游一半所编码的序列相同，但区别在于前者含 有最大可能数量的沉默取代，使这两部分可以通过与寡核苷酸的退火情况区 分开。

图7显示的示范性系统可以由单一RNA产生大量野生型和少量AB环 重组蛋白。构建了pDSPl的变体—(pDSPl(am))，该质粒中正常情况下编码 单链二聚体中下游外壳蛋白拷贝的第一个氨基酸-丙氨酸被琥珀终止密码子 所取代。此外，合成并克隆了丙氨酸插入抑制型tRNA基因，产生的tRNA 的量使得翻译外壳序列的核糖体的一小部分通读过琥珀(终止)密码子并产生 单链二聚体。得到的蛋白(含有外来肽)与相同mRNA表达的野生型蛋白共组 装形成镶嵌壳体，效价如文中其他部分描述的被降低。

图8呈现的是由以下列举的质粒产生的纯化VLPs的SDS凝胶电泳图。 试验的用意是显示纯化VLPs中单链“通读”产物(如以上图7和本申请实施 例部分中描述)的含量。纯化的VLPs由以下质粒(由左至右)产生:

pDSPl产生的VLPs仅含有外壳蛋白单链二聚体。

pDSPl-Flag产生的VLPs仅含有单链二聚体，且第二个AB环中插入了 Flag表位。

pDSPl(am)在单链二聚体中外壳序列连接处有一个无义突变，导致它产 生大量野生型外壳蛋白，在有抑制型tRNA(由pNMsupA提供)的情况下， 还产生少量单链二聚体。因为这种情况的无义抑制效率低，核糖体只有小部 分通读过终止密码子产生单链二聚体。两种形式的外壳蛋白共组装成镶嵌的 或者杂合的VLP，主要由野生型外壳蛋白和少量单链二聚体(估计大约是野 生型外壳蛋白水平的3%)构成。

pDSPl(am)-Flag与pDSPl(am)一样，只是单链二聚体的第二个AB环中 插入了Flag表位。它主要产生野生型蛋白和少量带有插入在AB环的Flag 肽的单链二聚体。

图右边的两个箭头表示通过抑制pDSPl(am)和pDSPl(am)-Flag的终止密 码子产生的两种蛋白。

图9a和9b描述了pDSPl质粒(9a)和将编码异源肽的核酸序列插入质 粒使用的技术(9b)。

图10描述了pDSP62质粒并示意了如何设计合成寡核苷酸引物从而将 序列特异地插入单链二聚体下游拷贝的AB环中。设计的寡核苷酸与侧接 AB环的外壳序列完美地退火，将外来序列插在它们之间。

图11a含有pDSPl质粒的核酸序列(SEQ ID NO:1)；图11b显示了 pDSPl(am)的核酸序列(SEQ ID NO:2)；图11c显示了pDSP62质粒的核酸 序列(SEQ ID NO:3)；图11d给出了pDSP62(am)的核酸序列(SEQ ID NO: 4)。注意pDSPl(am)和pDSP62(am)质粒序列与pDSPl和pDSP62的不同只是 引入了琥珀密码子的核苷酸取代。图11e是M13K07的氯霉素抗性衍生物 -M13CM1的核酸序列(SEQ ID NO:5)。

图12描述了利用pDSP62和M13CM1产生随机肽序列文库的方法。 M13CM1是一个使pDSP62从它的M13原点开始复制的辅助病毒。因此， M13CM1感染含有pDSP62的大肠杆菌细胞将会产生单链环形pDSP62。当 生长在dut^-,ung^-细菌菌株中时，DNA中通常存在的dTTP中有一些被dUTP 取代。通过用DNA聚合酶对合成寡核苷酸进行延伸来实现肽编码序列的定 点插入，并利用DNA聚合酶将环闭合。得到的共价闭合环形DNA经电穿 孔导入大肠杆菌的dut+,ung+菌株，在大肠杆菌中dUTP取代的链被降解， 导致插入片段的高合并率(通常85-90%)[10]。

图13a和13b描述了pP7(13a)和p2P7K32(13b)质粒。这些质粒只是用 于PP7VLP平台的建立过程中通过翻译阻遏和VLP组装分析法来检测PP7 外壳蛋白AB环对插入的容忍性(参见实施例部分)。不应把它们与 pET2P7K32或pDSP7混淆，后两种质粒下文有描述，用于构建VLP文库进 行亲和选择。

图14提供了PP7外壳蛋白AB环附近的核苷酸和氨基酸序列，还提供 了用于插入一些特定肽插入片段的引物序列。插入了多种特异和随机肽序列 来检测PP7单链二聚体对AB环插入的总体容忍性，并确定特异插入肽的免 疫原性。

图15阐述了为了展示PP7单链外壳蛋白AB环对插入的容忍性，在 p2P7K32中构建随机序列肽文库所用的方案。这个方法与图5b中阐述的插 入pDSPl中的MS2单链二聚体的方法类似。

图16提供了24个克隆的全细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳结果，所述克 隆来自本文描述的各个不同的文库。获得的克隆几乎100%有翻译阻遏能力， 表明每个蛋白可能都被适当地折叠。为了进一步验证蛋白正确折叠，通过给 随机挑选的几个克隆进行电泳和Western印迹(如本图所示)来评估每个克隆 形成VLP的能力。每组中上半部分是溴化乙锭染色的胶，下半部分是相同 胶的Western印迹结果。每组中最左道是p2P7K32对照。每个克隆含有不同 的随机产生的肽序列。几乎每一个克隆都产生了VLP，这一事实显示了PP7 外壳蛋白单链二聚体对插入片段的高度容忍性。

图17a阐述了pETP7K质粒、图17b阐述了pET2P7K32质粒、图17c 阐述了pDSP7质粒。这些质粒是为了高水平过表达PP7外壳蛋白而制备的。 pDSP7质粒含有PP7外壳蛋白的单链二聚体，其中序列的一半在AB环编 码序列附近含有足够数量的核苷酸突变，使得就与致突变寡核苷酸退火的目 的来说，这两半是可以区分的。在本图显示的例子中，整个上游序列经过改 造含有最大可能数量的沉默突变。pET2P7K32和pDSP7应当被看作是MS2 外壳蛋白产生质粒—pDSPl和pDSP62的PP7类似物。

图18–提取自在含有pETP7K或pET2P7K32的细菌中产生的VLPs的 RNA在甲醛/琼脂糖凝胶上的电泳结果显示了它们产生的VLPs包裹着指导 其合成的mRNAs。这提供了通过逆转录和PCR回收亲和选择得到的序列的 手段。交替泳道含有相同质粒体外转录产生的RNAs。左侧图板显示溴化乙 锭染色的胶。右侧是用对PP7外壳蛋白有义链特异的寡核苷酸探测同一凝 胶的印迹结果。该探针未能与相似量来源于MS2或QB外壳蛋白序列体外 转录产生的RNA反应(未显示)。

图19提供了克隆到PP7外壳蛋白中的几个特定肽序列列表。

图20显示了抗L2mAb (RG-1)与PP7L2-VLPs结合，但不与PP7 V3-VLPs结合。稀释的mAb RG-1与500ng/孔的L2-VLPs或V3-VLPs反应。 利用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠次级IgG，随后用ABTS显影来检测 结合情况。通过测量405nm (OD 405)处的吸光度确定反应性。

图21显示了展示V3肽的PP7VLPs在用于免疫时诱发了抗V3IgG反 应。图中显示的是用PP7V3-VLPs或作为对照的L2-VLPs免疫的小鼠中的 抗V3IgG抗体反应。小鼠用10μgVLPs和不完全弗氏佐剂免疫三次，然后 在最后一个加强剂后两周采集血清。通过ELISA测试来自七只独立小鼠(六 只用V3-VLPs免疫，一只用L2-VLPs免疫)的稀释血清与代表来自HIVLAI 的V3环一部分的肽的反应性。利用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠次级 IgG，随后用ABTS显影来检查结合情况。通过测量405nm(OD 405)处的吸 光度确定反应性。

图22显示了利用MS2VLP展示和抗Flag M2抗体进行的亲和选择的 结果，其中所述抗体的表位序列已被其他人透彻研究过。显示了来自四轮中 每一轮的几个肽的序列来展示选择的进展。第1和第2轮中发现的肽含有可 识别的天然表位的元件，但是到第3和第4轮相似性很明显，这些序列与野 生型表位非常吻合。事实上，第4轮得到的序列比以前通过成熟的丝状噬菌 体展示方法获得的序列(参见"NEB Transcript,Summer,1006–在New  England Biolabs网站可以找到，www.neb.coni)更接近天然表位。

图23a-23d显示了pET2P7K32(SEQ ID NO:6)、pET2P7K32(am)(SEQ ID  NO:7)、pDSP7(SEQ ID NO:8)和pDSP7(am)(SEQ ID NO:9)质粒的核苷酸序 列。这些是与图11a-11d中显示的MS2VLP产生质粒的PP7外壳蛋白产生 类似物。

发明详述

根据本发明，可以采用现有技术范围内的常规分子生物学、微生物学和 重组DNA技术。文献中充分解释了这些技术。参见例如Sambrook.et al.2001, "Molecular Cloning:A Laboratory Manual"；Ausubel,ed.,1994,"Current  Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III；Celis,ed.,1994,"Cell Biology: A Laboratory Handbook"Volumes I-III；Coligan,ed.,1994,"Current Protocols  in Immunology"Volumes I-III；Gait ed.,1984,"Oligonucleotide Synthesis"； Hames&Higgins eds..1985,"Nucleic Acid Hybridization"；Hames&Higgins, eds.,1984,"Transcription And Translation"；Freshney.ed.,1986."Animal Cell  Culture";IRL Press,1986."Immobilized Cells And Enzymes"；Perbal.1984,"A Practical Guide To Molecular Cloning″。

在提供数值范围的情况中，应当理解为在所述范围的上限和下限之间的 每一居间值(至该下限的最小整数的十分之一，除非文中另有明确规定)，以 及在该申明范围内的任何其他申明的数值或者居间值都被发明所涵盖。这些 较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也涵盖在发明内，适 用该申明的范围内任何特别排除的端值。当申明的范围包括上下限中的一个 或者两者时，排除这些被包括在内的一个或两个界限的范围也包含在发明 中。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本发明所属领域技术人员通 常理解的意义相同。虽然任何与本文描述的方法和材料类似或等同的也可以 用于发明的实施或测试，这里描述了优选方法和材料。

必须指出，用于本文和所附权利要求,单数形式的“一个”(″a"、"an" 和"the")包括复数的指代物，除非上下文明确另有指示。

此外，以下术语具有如下定义。

本文中，术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合物形式的核苷酸(核糖 核苷酸或者脱氧核糖核苷酸)，包括双链和单链DNA和RNA。多核苷酸可 能包含具有不同功能的核苷酸序列，比如编码区和诸如调控序列(例如启动 子或转录终止子)的非编码区。多核苷酸可以直接从天然来源获得，或者可 以借助重组、酶学或化学技术制备。多核苷酸在拓扑学上可以是线性或者环 形的。多核苷酸可以是例如质粒或噬菌体载体(比如表达或克隆载体)的一部 分或者片段。

限制性核酸内切酶是在确定序列对DNA进行切割的酶。它们被用于重 组DNA技术，产生例如特异的DNA片段，所述DNA片段与利用相同限制 性核酸内切酶消化产生的其它DNA片段经过DNA连接酶的作用容易地连 在一起。本申请中提到的几个特异限制性核酸内切酶包括SalI、KpnI和 BamHI，它们的识别序列分别是GTCGAC、GGTACC和GGATCC。

本文中，术语“多肽”是泛指通过肽键连接在一起的两个或多个氨基酸 聚合物。术语“多肽”还包括含有一个以上通过二硫键连接的多肽的分子， 或者共价地或非共价地连接成多聚体(例如，二聚体、四聚体)的多肽复合体。 因此，术语肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义中，这些术语可以交换使 用。应当理解，这些术语没有暗示氨基酸聚合物的具体长度，也不隐含或者 区分多核苷酸是否是利用重组技术、化学或酶法合成制备的，还是天然的。

术语“单链二聚体”是指通常处于二聚体形式的蛋白质，它的两个亚基 被基因(通过共价键化学地)融合为单一的多肽链。具体来说，本发明中构建 了MS2和PP7外壳蛋白的单链二聚体形式。这些蛋白中每一个天然是相同 多肽链的二聚体。在MS2和PP7外壳蛋白二聚体中，一个亚基的N末端与 相伴亚基的C末端在物理学上很接近(参见图1)。单链外壳蛋白二聚体的 产生是利用重组DNA方法通过复制外壳蛋白的DNA编码序列，然后将它 们头尾相连地融合在一起。得到的单一多肽链中外壳蛋白氨基酸出现两次， 其中上游拷贝的C末端与下游拷贝的N末端共价融合。正常情况下(野生型)， 两个亚基仅通过两条链间的非共价相互作用联系在一起。在单链二聚体中， 这些非共价相互作用被保留，但两个亚基另外还被共价地连在一起。这极大 地稳定了蛋白的折叠后结构，赋予它对肽插入片段的如上所述的高容忍性。

本申请经常提到外壳蛋白的“AB环”。RNA噬菌体外壳蛋白具有保守 的三级结构。MS2和PP7外壳蛋白,各自具有例如以图1显示的MS2外壳 蛋白为例的结构。每个多肽链折叠成多个β折叠，以字母A到G示意。β 折叠A和B形成一个发卡，在发卡顶端有一个连接两个折叠的三氨基酸环， 该环在这里暴露在VLP的表面。如本申请所示，插入到AB环中的肽被暴 露在VLP表面，具有强免疫原性。

优选本文描述的氨基酸残基处于“L”异构型。但是，“D”异构型的 残基可以取代为任何L型氨基酸残基，只要多肽保留所需的功能。NH2是 指位于多肽氨基端的游离氨基基团。COOH是指位于多肽羧基端的游离羧基 基团。

术语“编码序列”在本文中定义为核酸序列中直接决定其蛋白产物的氨 基酸序列的部分。编码序列的边界通常由位于开放读框开始的地方(通常靠 近mRNA的5’端)的核糖体结合(或者Shine-Dalgarno)位点和翻译起始密码子 (通常是AUG)(对于原核生物)或者AUG起始密码子(对于真核生物)，以及 位于并且确定开放读框结束的地方(通常靠近mRNA的3’端)的翻译终止序 列(无义密码子之一:UAG、UGA或UAA)确定。编码序列可以包括，但不 限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

正如上文简要提到的，“终止密码子”(stop codon或termination codon) 是信使RNA中示意翻译终止的核苷酸三联体。蛋白质是独特的氨基酸序列， 信使RNA中的多数密码子对应向不断延长的蛋白链添加氨基酸—终止密码 子示意这一过程的结束，氨基酸链的释放。在标准遗传密码中，有三个终止 密码子:UAG(在RNA中)/TAG(在DNA中)(又称为“琥珀”终止密码子)、 UAA/TAA (又称为“赭石”终止密码子)和UGA/TGA (又称为“乳白”或 “棕土”终止密码子)。已知这个主要的密码子群有多个变化形式。本发明 中使用的终止密码子通常会停止或中断蛋白的合成。

但是，tRNAs中的某些突变使它们能够识别终止密码子，导致核糖体通 读过终止密码子，使得终止密码子下游编码的肽得以合成[11-13]。例如tRNA 中的一个突变能够识别琥珀终止密码子，使翻译越过该密码子，产生全长蛋 白，从而重新得到正常形式的蛋白而“阻抑”了终止密码子。很多时候，对 终止密码子的抑制仅仅部分有效—经常只有低百分比的核糖体通读过终止 密码子。但是在某些情况中，阻抑可以有效的多。少数几个抑制型tRNAs就 是具有更高的内在抑制效率。其他情况中，可以通过提高其表达水平使弱抑 制分子更有效。本发明的某些实施方案中，为了控制终止密码子下游的转录 单元所编码的肽的合成，在转录单元中引入了终止密码子。通过提供能够识 别终止密码子并允许终止密码子下游肽的合成的tRNA的受控合成，可以产 生在外壳蛋白群体(大多数不含有异源肽)中包含异源肽的外壳蛋白。这样得 到的由异源肽混合物组装而成的VLPs含有野生型(没有异源肽)外壳蛋白， 导致异源呈递效价低得多。

重组细胞的“外源”区域是较大核酸分子内的可辨认核酸区段，所述区 段在自然情况下与该较大核酸分子不相关联。“异源”肽是这样的肽，所述 肽是多肽中与较大多肽在自然情况下不相关联的可辨认区段。

VLP的效价是指颗粒上展示的外源肽的拷贝数。展示“低效价”异源肽 (优选至少4个肽单位的免疫原性肽)的病毒颗粒是这样的颗粒，所述病毒颗 粒在构成该病毒颗粒的外壳多肽二聚体中展示小于1个到最多大约10个或 以上异源肽。展示低效价的病毒颗粒由复数个不含异源肽的外壳多肽二聚体 (优选野生型外壳多肽)和少数包含外源肽(优选位于外壳多肽下游亚基的AB 环内或者位于单链外壳多肽二聚体的羧基末端)的外壳多肽二聚体形成，因 此形成的是镶嵌VLP。

用于本文的语境，“复制原点”一般是指通过指定DNA复制起始的区 域参与DNA合成的那些DNA序列。在有所需因子(DNA聚合酶等)的情况 下，复制原点导致与它关联的DNA被复制。例如ColEl复制原点(用于象 pDSP1等质粒)使许多常用的质粒克隆载体具有了独立于细菌染色体复制的 能力。另一个例子是本申请材料中其他地方描述过的质粒pNMsupA(参见图 7)中使用的p15A复制原点。质粒上有额外的来自噬菌体M13的复制原点 (例如象pDSP62的情况)赋予质粒在大肠杆菌细胞被所谓辅助噬菌体(例如 本申请中描述的M13CM1)感染时，利用该原点进行另外的复制的能力。M13 在胞内复制为双链环形DNA；但也可能产生单链环的形式，并包装在噬菌 体颗粒中。这些颗粒给诸如pDSP62和pDSP7(本申请其他地方描述过，用 于利用图12阐述的方法构建文库)的质粒提供了方便的单链环形DNA来源。

“启动子序列”是能够与细胞中的RNA聚合酶结合并启动下游(3’方向) 编码序列的转录的DNA调控区。为了说明本发明的目的，启动子序列包括 以可检测的高于背景的水平启动转录所需的最小数量的碱基或元件。在启动 子中有负责与RNA聚合酶以及转录起始所需的任何相关因子结合的DNA 序列。细菌启动子通常由-35和-10共有序列和或多或少特异的转录起始位点 构成。真核启动子经常，但不是总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。细菌 表达载体(通常是质粒或噬菌体)一般利用来自天然来源的启动子，包括那些 来源于大肠杆菌乳糖、阿拉伯糖、色氨酸和ProB操纵子的启动子，以及其 他来自噬菌体来源的启动子。例子包括来自λ、T7、T3和SP6噬菌体的启 动子。

在细菌中，转录通常止于特异的转录终止序列，所述转录终止序列一般 根据它们的活性是否需要细菌rho因子的作用，而分为rho依赖性和不依赖 rho(或者固有)的终止子。这些终止子限定了导致RNA聚合酶停止其转录活 动的位点，因此它们大体上限定了RNAs的3’端，尽管有些时候后续的核糖 核酸酶作用会对RNA进行进一步修剪。

“抗生素抗性基因”是指所述基因编码的蛋白质赋予细菌对给定抗生素 的抗性。例如卡那霉素抗性基因引导合成磷酸转移酶，后者能够将所述药物 修饰和灭活。质粒(例如pDSPl)上有卡那霉素抗性基因提供了挑选存在质粒 的转化细菌的一个机制。类似地，氯霉素抗性基因通过产生乙酰基转移酶， 使抗生素被乙酰化失活，从而细菌能够在有氯霉素的情况下生长。在本申请 中，利用氯霉素抗性来保证细菌中保留了pNMsupA和M13CM1。

本申请中提出的“逆转录和PCR”是作为扩增亲和选择到的VLPs的核 酸序列的手段。“逆转录”是指通过逆转录酶的作用产生RNA分子(或cDNA) 的DNA拷贝的过程。在本申请中，利用逆转录产生亲和选择到的VLPs内 包裹的RNA序列的DNA拷贝。逆转录酶需要引物退火到RNA上(参见下 文)。

术语“PCR”是指聚合酶链式反应，用于体外扩增特定DNA序列的技 术。术语“PCR引物”是指能够与靶DNA退火，从而使DNA聚合酶(例如 Taq DNA聚合酶)能够启动DNA合成的DNA序列(通常是合成的寡核苷 酸)。象例如图9b和15中显示的，在聚合酶链式反应中使用PCR引物对来 启动DNA双链中每条链的DNA合成，从而扩增两个引物之间的DNA区段。

这里给出了逆转录和PCR使用的引物的例子。

E2:5’TCA GCG GTG GCA GCA GCC AA 3'–与包裹在本申请描述的 VLPs中的RNAs的3’端附近退火；用于引导逆转录。

E3.2:5’CGG GCT TTG TTA GCA GCC GG 3’–与上述逆转录产生的 cDNAs的3’端附近退火，退火位点恰好在E2引物位点的上游；作为对亲和 选择得到的序列进行扩增的PCR反应中的3’引物。

E2和E3.2引物含有pDSPl、pDSPl(am)、pDSP62、pDSP62(am)、 pET2P7K32、pET2P7K32(am)、pDSP7和pDSP7(am)共有的序列，因此可用 于由这些来源中的每一个对VLPs包裹的RNA进行逆转录和PCR。PCR依 赖于将E3.2与以下描述的质粒特异的5’引物之一配对。为了简单起见，只 显示了用于pDSPl和pDSPl(am)的引物，但应当理解，根据需要还使用了对 其他VLPs中的序列特异的类似引物。

J2:5’ACT CCG GCC TCT ACG GCA AC 3’-与pDSPl中单链二聚体序 列连接处的序列特异退火的引物。在用E3.2进行的PCR反应中，含有单链 二聚体下游一半(包括AB环中插入的肽的序列)的DNA区段被扩增。PCR 产物经过SalI和BamHI消化产生的片段可以插入到相关质粒中SalI和 BamHI之间(参见例如图9a)。

J2(琥珀):5'AC TCC GGC ATC TAG TAG AAC TTT AC 3'–该引物与 以上J2作用方式完全一致，但是是对pDSPl(am)产生的序列特异。

“表达调控序列”是控制和调节另一个DNA序列的转录和翻译的DNA 序列。当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA，然后mRNA被翻译为所述 编码序列编码的蛋白时，编码序列“受控于”细胞中的转录和翻译调控序列。 转录调控序列是参与编码序列在宿主细胞中表达的DNA调控序列，比如启 动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等。翻译调控序列通常通过控制核 糖体结合和翻译启始的效率，决定信使RNA的翻译效率。例如象本申请中 其他地方讨论过的，RNA噬菌体的外壳蛋白是已知的噬菌体复制酶的翻译 抑制剂。随着外壳蛋白在被感染细胞中积累到足够高的浓度，它与含有噬菌 体复制酶基因的翻译起始区(Shine-Dalgarno和起始密码子AUG)的RNA发 夹结合。这阻碍了核糖体结合，使复制酶合成被关闭，此时病毒的生命周期 发生从复制到病毒组装的转换。

当细胞内被导入了外源或异源DNA，细胞称为被这些DNA“转化”。 转化DNA可能整合或者没有整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体 DNA中。例如在原核细胞、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可能维持在 诸如质粒的附加型元件上，所述质粒通常借助质粒上存在的复制原点，能够 独立于细菌染色体复制。对于真核细胞来说，稳定转化细胞是其中的转化 DNA已经整合到染色体中，因此可以通过染色体复制被子细胞继承。真核 细胞具有的建立细胞系或克隆的能力显示了这一稳定性，其中所述细胞系或 克隆包含含有所述转化DNA的子细胞群。

应当理解，本发明范围还包括编码发明所述多肽的核酸序列，所述核酸 序列编码的多肽具有与本文公开的序列相同的氨基酸序列，但是是本文公开 的核酸的简并序列。“简并”意味着用不同的三字母密码子来限定特定氨基 酸。

本文中，“表位”是指多肽的抗原决定簇。表位可以包含处于该表位特 有的空间构象的三个氨基酸。一般来说，表位由至少5个这样的氨基酸，更 通常地，由至少8-10个这样的氨基酸构成。确定氨基酸空间构象的方法是 本领域已知的，包括例如x-射线晶体分析法和2维核磁共振。

本文中，“模拟表位(mimotope)”是模拟真实抗原表位的肽。某些情况 中，氨基酸序列可能与原来的抗原表位有某些相似性，但也有一些情况没有 或者只有很少的序列相似性。这类情况中，模拟表位利用不同的氨基酸序列 模拟表位的3D结构。甚至可以鉴定到模拟非肽表位的模拟表位s，比如模 拟碳水化合物的。

本文中，术语“外壳蛋白”是指噬菌体或者RNA噬菌体中能够被合并 到噬菌体或RNA噬菌体的衣壳组装的蛋白。

本文中，“外壳多肽”在文中定义为具有外壳蛋白功能的外壳蛋白的多 肽片段，还包括全长外壳蛋白或其单链变体。

本文中，术语“免疫反应”是指引发B-和/或T-淋巴细胞和/或抗原呈递 细胞的活化或增殖的体液免疫反应和/或细胞免疫反应，但是在某些情形中， 免疫反应强度可能很低，只有在使用至少一种根据发明的物质时才能检测 到。“免疫原性的”是指试剂用于刺激活生物体的免疫系统，从而使免疫系 统的一或多个功能得到提高并且针对该所述免疫原性剂。“免疫原性多肽” 是在有或没有佐剂的情况下，能够单独或者与载体相连引发细胞和/或体液 免疫反应的多肽。优选地，抗原呈递细胞被活化。

本文中，术语“自体抗原”是指宿主DNA编码的蛋白以及由蛋白产生 的产物或者宿主DNA编码的RNA。此外，由两个或多个自体分子组合产生 的蛋白，或者代表自体分子的一个级分的蛋白，以及与上述两种自体分子有 高同源性(>95%,优选>97%,更优选>99%)的蛋白，也可视为自体的。自体 抗原的例子包括，但不限于ErbB-2、β淀粉样蛋白、免疫球蛋白E(IgE)、胃 泌素、胃促生长素、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素(IL)-17、IL-23、IL-13、 CCR5、CXCR4、神经生长因子(NGF)、血管紧张素II、TRANCE/RANKL 和MUC-1。

本文中，术语“疫苗”是指含有本发明的组合物并且处于能够给予动物 的形式的制剂。

本文中，术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指这样的病毒样颗粒(VLP)， 所述颗粒与噬菌体结构相似，但不能复制没有感染性，并且通常缺少噬菌体 作为感染性病毒进行繁殖所需要的一或多个病毒基因。RNA噬菌体的VLPs 一般还缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白的基因。

这个定义还包括了这样的噬菌体病毒样颗粒，所述颗粒中存在上述基因 但是已失活，因此也造成噬菌体病毒样颗粒不能复制没有感染性。

“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”定义为由RNA噬菌体外壳蛋白的一或 多个亚基自组装形成的衣壳结构，通常含有自身外壳蛋白的mRNA，任选含 有宿主RNA。为了本申请的目的，RNA噬菌体VLPs通常是由180拷贝的 野生型外壳蛋白二聚体或者90拷贝的单链二聚体外壳蛋白组装成的；或者 组装成含有不同数量野生型二聚体和单链二聚体外壳蛋白，每个颗粒总共 90个分子的镶嵌VLPs。

当表达调控序列控制并且调节着核酸序列的转录和翻译时，所述核酸分 子与所述表达调控序列是“可操纵地连接”或者“可操纵地关联”。术语“可 操纵地连接”包括在待表达的核酸序列前面有合适的起始信号(例如ATG)， 并且维持正确的读框以允许核酸序列在表达调控序列的控制下进行表达并 产生由所述核酸序列编码的所需产物。如果希望插入重组DNA分子的基因 不含合适的起始信号，可以在所述基因前面插入这种起始信号。

术语“严紧杂交条件”是本领域技术人员已知的，可以在Current Protocols  in Molecular Biology,John Wiley&Sons.N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。严 紧杂交条件的优选的非限制性例子是于大约45°C在6X氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)中杂交；然后于50°C，优选55°C，更优选60°C或65°C在0.2.X SSC, 0.1%SDS中清洗1或多次。

病毒样颗粒的产生

本发明涉及病毒样噬菌体颗粒以及产生这些颗粒的体内和体外方法。正 常情况下，这些颗粒是在体内产生的，但这些颗粒的用途完全可以应用在体 外情景中，这种做法也在本发明预期范围内。本发明有可能使实验室复杂性 提高，减少了反复选择需要的时间。方法一般包括体外制备毒粒和回收毒粒。 本文中，“体外”产生毒粒是指在细胞外，例如无细胞系统中产生毒粒；而 “体内”产生毒粒是指在细胞内，例如大肠杆菌或铜绿假单胞菌细胞内产生 毒粒。

噬菌体

本文设想的系统基于单链RNA噬菌体的特性(参见RNA Bacteriophages, in The Bacteriophages.Calendar.RL.ed.Oxford University Press.2005)。属于 这类的已知病毒攻击诸如大肠杆菌、假单胞菌和不动杆菌等多样化的细菌。 每个具有高度相似的基因组组织方式、复制策略和毒粒结构。具体来说，所 述噬菌体含有单链(+)义RNA基因组，含有成熟酶、外壳和复制酶基因， 并且有小的(<300埃)二十面体外壳。这些包括，但不限于MS2、Qβ、R17、 SP、PP7、GA、M11、MX1、f4、Cb5、Cb12r、Cb23r、7s和12RNA噬菌 体。

PP7是铜绿假单胞菌的单链RNA噬菌体，与诸如MS2和Qβ的大肠杆 菌噬菌体是远亲。虽然PP7噬菌体正常情况下感染的是铜绿假单胞菌，当在 大肠杆菌中由诸如图9和13中描述的质粒表达PP7外壳蛋白时，可以容易 地产生病毒样颗粒。PP7外壳蛋白经确定是特异性RNA结合蛋白，能够阻 遏与复制酶翻译起始区融合的序列的翻译。因为该外壳蛋白阻遏PP7的翻译 操纵序列，而不能阻遏MS2或Qβ噬菌体的操纵序列，可以知道它具有特异 性的RNA结合活性。已经建立了外壳蛋白的纯化条件和由解体的病毒样颗 粒重构其RNA结合活性的条件。体外PP7操纵RNA的解离常数经确定为 大约1nM。利用一个外壳蛋白阻遏复制酶-β-半乳糖苷酶融合蛋白的翻译的 基因系统，鉴定了蛋白中对结合PP7RNA重要的氨基酸残基(Peabody,et al, Translational repression and specific RNA binding by the coat protein of the  Pseudomonas phage PP72001,J.Biol.Chem.,Jun 22;276(25):22507-13.Epub 2001Apr 16)。

已知有多个单链RNA噬菌体的外壳蛋白是翻译阻遏物，能够通过结合 含有复制酶核糖体结合位点的RNA发夹关闭病毒的复制酶合成。对RNA噬 菌体进行的X射线结构确定表明从比较外壳蛋白氨基酸序列可以看到的明 显的同源性也反映在三级结构中。作为阻遏物和病毒颗粒基本构成元件的外 壳蛋白二聚体由两个交织的单体构成，这两个单体一起形成大的β折叠表 面，RNA即结合其上。每个外壳蛋白利用共同的结构框架结合不同RNA， 因此提供了机会来考察特异性RNA-蛋白识别的基础。文中描述了PP7(铜绿 假单胞菌的RNA噬菌体，其外壳蛋白和MS2的外壳蛋白只显示出13%的氨 基酸序列同一性)外壳蛋白的RNA结合特性。还给出了以下发现:(1)PP7的 外壳蛋白是翻译阻遏物；(2)含有PP7复制酶翻译起始位点的RNA发夹在 体内和体外均被PP7外壳蛋白特异结合，表明这个结构代表了翻译操纵序 列；以及(3)RNA结合位点位于外壳蛋白β折叠上。已提供该位点的图谱。 见上文。

为了说明的目的，利用了该群中研究特别透彻的成员—MS2的基因组， 所述基因组是3569个核苷酸长的单链(+)义RNA，仅编码4个蛋白质，其中 两个是毒粒的结构成分。构成病毒颗粒的二十面体衣壳是由180拷贝的外壳 蛋白和一个分子的成熟酶蛋白以及一个分子的RNA基因组形成。其外壳蛋 白也是特异性RNA结合蛋白。当外壳蛋白与其特异识别目标—靠近复制酶 顺反子5’端的RNA发夹结合时，组装可能被启动(参见图1B和2009年2 月26日出版的US20090054246的SEQ ID NO:l，该申请通过引用全文并入 本文)。然后当细胞在病毒裂解蛋白的影响下破裂时，病毒颗粒被释放到培 养基中。形成感染性病毒需要至少三个成分，即外壳蛋白、成熟酶和病毒基 因组RNA，但试验显示二十面体衣壳的组装所需要的信息完全包含在外壳 蛋白本身内。例如纯化的外壳蛋白在被RNA刺激的过程中可以体外形成衣 壳(Beckett et al.,1988,J.Mol Biol 204:939-47)。并且，由质粒在细胞内表达 的外壳蛋白可以体内组装成病毒样颗粒(Peabody,D.S.,1990.J Biol Chem 265:5684-5689)。

外壳多肽

由编码序列编码的外壳多肽一般长度至少有120个，优选至少125个氨 基酸，不超过大约135个氨基酸，优选不超过130个氨基酸。预计可以使用 来自几乎任何单链RNA噬菌体的外壳多肽。外壳多肽的例子包括，但不限 于MS2外壳多肽(参见例如美国专利申请公开US20090054246的SEQ ID  N0:2)、R17外壳多肽(参见例如Genbank登录号P03612)、PRR 1外壳多肽 (参见例如Genbank Accesssion No.ABH03627)、fr噬菌体外壳多肽(参见例 如Genbank登录号NP 039624)、GA外壳多肽(参见例如Genbank登录号 P07234)、QP外壳多肽(参见例如Genbank登录号P03615)、SP外壳多肽(参 见例如Genbank Accession No P09673)、f4外壳多肽(参见例如Genbank登录 号M37979.1)和PP7外壳多肽(参见例如Genbank登录号P03630)。

PP7外壳多肽的例子包括，但不限于与RNA发夹形成复合物的PP7外 壳蛋白二聚体的各个链(例如Genbank登录号2QUXR、2QUXO、2QUX L、 2QUXJ、2QUX_F和2QUX C)。还可参见本文中的实施例1和Peabody.et al, RNA recognition site of PP7coat protein,Nucleic Acids Research.2002,Vol.30, No.194138-4144[14,15]。

可用于本发明的外壳多肽还包括与以上公开的外壳多肽序列中的一或 多个有相似性的那些。所述相似性是指结构相似性。结果相似性的确定可以 通过将两个氨基酸序列(即候选氨基酸序列和氨基酸序列)的残基进行比对使 它们沿着序列的相同氨基酸数量最大化；为了优化相同氨基酸的数量，虽然 每个序列中的氨基酸必须保持正确的顺序，但允许在比对时在一个序列或者 两个序列中存在空位。候选氨基酸序列是与例如美国已公开专利申请 US2009/0054246中给出的氨基酸序列进行比较的氨基酸序列。候选氨基酸 序列可以分离自单链RNA病毒，或者可以利用重组技术产生，或者化学或 酶法合成。优选地，两个氨基酸序列可以利用GCG软件包(10.2版本， Madison WI)中的BESTFIT算法，或者BLAST 2搜索算法中的程序进行比较， 所述程序在Tatusova.et al.(FEMS Microbial Lett 1999,174:247-250)中有描 述，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html有提供。优选地，所 有BLAST 2搜索参数使用缺省值，包括矩阵=BLOSUM62;开放空位罚分= 11；扩展空位罚分=1；空位丢弃值=50；期望值=10；字段长度=3，任 选地，过滤器打开。在利用BLAST搜索算法进行的两个氨基酸序列的比较 中，结构相似性被称为“同一性”。

优选地，外壳多肽还包括这样的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与以 上公开的氨基酸序列中的一或多个有至少80%的氨基酸同一性、至少85% 的氨基酸同一性、至少90%的氨基酸同一性或者至少95%的氨基酸同一性。 优选地，外壳多肽有活性。外壳多肽是否有活性可以通过评估所述多肽形成 衣壳和包裹单链RNA分子的能力来确定。利用体内或体外系统可以完成这 种评估，这类方法是本领域已知的常规方法。替代地，如果多肽与提到的外 壳多肽有相似的三维结构和/或功能活性，它可以被认为是结构相似的。

插入到外壳多肽或多肽的异源肽序列可以是随机肽序列。在特定实施方 案中，所述随机序列具有Xaa_n的序列，其中n是至少4、至少6，或者至少 8并且不大于20，不大于18或者不大于16，每个Xaa是独立的随机氨基酸。 替代地，肽片段可能有明确的序列，具有已知的功能(例如抗原性、免疫原 性)。异源序列可以位于外壳多肽的氨基末端、外壳多肽的羧基末端或者位 于外壳多肽内的其他地方。优选地，异源序列在外壳多肽中的位置使得插入 序列会被表达在衣壳的外表面。在特定实施方案中，并且如下文实施例中描 述的，肽序列可以被插入到以上提到的外壳多肽的AB环区域。这类位置的 例子包括，例如插入序列被插入到外壳多肽中紧接氨基酸11-17，或者外壳 多肽中紧接氨基酸13-17的后面。在非常特定的实施方案中，异源肽被插入 到对应MS-2中氨基酸11-17或者特别是13-17的位点。

根据本发明的某些实施方案中，异源肽插入的位点对应:

(a)MS-2、R17和fir外壳多肽的氨基酸11-17或者特别是13-17；

(b)GA外壳多肽的氨基酸10-16；

(c)QP和SP外壳多肽的氨基酸10-17;

(d)PP7外壳多肽的氨基酸8-11，和

(e)PRR1外壳多肽的氨基酸9-17。

替代地，异源肽可以被插入到外壳多肽的N-末端或C-末端。

异源肽可以选自下述的肽：HIV肽、自体抗原、Flag肽、来源于人16 型乳头瘤(HPV16)次要衣壳蛋白L2的氨基酸序列、HIV-1gp120的V3环、 炭疽芽孢杆菌保护性抗原、受体、结合细胞表面受体的配体、对丝状噬菌体 颗粒特异肽的任何一端有亲和力的肽、金属结合肽或者对MS2表面有亲和 力的肽。

异源肽包括，但不限于选自下述的肽：HIV肽、自体抗原、Flag肽、来 源于人16型乳头瘤(HPV16)次要衣壳蛋白L2的氨基酸序列、HIV-1gp120 的V3环、炭疽芽孢杆菌保护性抗原、受体、结合细胞表面受体的配体、对 丝状噬菌体颗粒特异肽的任何一端有亲和力的肽、金属结合肽或者对PP7 表面有亲和力的肽。

为了确定结构相似外壳多肽中的相应位点，将该结构相似外壳多肽的氨 基酸序列与上文中限定的外壳多肽的序列进行比对。例如将与M2-2外壳多 肽结构相似的外壳多肽的相应位点与(已公开的美国专利申请 US2009/0054246中的)SEQ ID NO:2(该申请通过引用并入本文)比对。由这个 比对，可以确定另一个外壳多肽中与SEQ ID NO:l (也是已公开的美国专利 申请US2009/0054246中的)中给定位点对应的位点。

在特定实施方案中，外壳多肽是含有上游和下游亚基的单链二聚体。每 个亚基含有有功能的外壳多肽序列。可以将异源肽在以上提及的位点插入到 上游和/或下游亚基中，例如优选下游亚基的AB环区域。在特定实施方案中， 所述外壳多肽是MS2外壳多肽的单链二聚体，其可能具有已公开的美国专 利申请US2009/0054246(该申请通过引用并入本文)中SEQ ID NO:12描述 的序列。

在特定实施方案中，外壳多肽是含有上游和下游亚基的单链二聚体。每 个亚基含有有功能的外壳多肽序列。可以将异源肽在以上提及的位点插入到 上游和/或下游亚基中，例如优选下游亚基的AB环区域。在特定实施方案中， 外壳多肽是PP7外壳多肽的单链二聚体。

转录单位的产生

本发明的转录单位包含表达调控区(例如，启动子)、编码外壳多肽的序 列和转录终止子。RNA多核苷酸可以任选地含有外壳识别位点(又称为“包 装信号”、“翻译操纵序列”、“外壳识别位点”)。替代地，转录单位可 能不含翻译操纵序列。启动子、编码区、转录终止子以及可能存在的外壳识 别位点通常是可操纵地连接。“可操纵地连接”或“可操纵地关联”是指排 列方式，其中被这样描述的成分所处的关系使它们能够以预期的方式发挥作 用。当调控序列与编码区的连接方式使得编码区在适合调控序列的条件下可 以发生表达，调控序列与编码区即是“可操纵地连接”或“可操纵地关联”。 外壳识别位点，如果存在的话，只要能够以预期方式发挥作用，可以位于 RNA多核苷酸内的任何位置。

发明不限于使用任何特定启动子，有许多已知的启动子。用于发明的启 动子可以是组成型或诱导型启动子。优选的启动子能够驱动产生编码外壳多 肽的编码区产生高水平RNA。这类启动子的例子是本领域已知的，包括例 如lac启动子T7、T3和SP6启动子。

编码本文描述的外壳多肽之编码区的核苷酸序列可以容易地确定。编码 本文描述的一个外壳多肽的一类核苷酸序列的例子是(已公开的美国专利申 请US2009/0054246中的)SEQ ID NO:3的核苷酸4080-4470(所述申请通过 引用并入本文)。这类核苷酸序列有很多但是是有限的，其中每个成员的核 苷酸序列可以由本领域技术人员通过参照标准的遗传密码容易地确定。

此外，RNA噬菌体单链外壳多肽的编码序列包含异源肽的插入位点和 异源肽本身的编码序列。在特定实施方案中，异源肽插入位点是限制性酶切 位点。

在特定实施方案中，编码区编码单链外壳多肽二聚体。在非常特定的实 施方案中，编码区编码经过改造的单链外壳多肽二聚体，其中所述改造包括 在插入位点插入了至少四个氨基酸的编码序列。已公开的美国专利申请 US2009/0054246中图3图解了这类转录单位的一个具体实施方案。转录单 位可以含有细菌启动子，比如lac启动子；或者可以含有噬菌体启动子，比 如T7启动子和任选地T7转录终止子。

除了含有启动子和编码融合蛋白的编码区，RNA多核苷酸一般还包含 转录终止子，和任选的外壳识别位点。外壳识别位点是处于RNA形式时形 成发卡结构的核苷酸序列。它在本领域中又被称为翻译操纵序列、包装信号 和RNA结合位点。在没有限制意图的情况下，该结构被认为是作为翻译阻 遏物(例如外壳多肽)识别的结合位点，并能启动RNA的包装。外壳识别位 点的核苷酸序列是本领域已知的，包括例如SEQ ID NO:1(参见已公开的美 国专利申请US2009/0054246中的图1B)的核苷酸。单链RNA噬菌体R17、 GA、Qβ、SP和PP7中的其他外壳识别序列也已有研究，技术人员很容易获 得。只要能够与启动子一起发挥作用，几乎任何转录终止子都可以用于RNA 多核苷酸中。转录终止子对本领域技术人员是已知的，易于获得并且常规使 用。

合成

正如以下会详细描述的，通过将转录单位导入细菌，特别是如果转录单 位含有细菌启动子时，可以体内合成本发明的VLPs。替代地，可以在偶联 的无细胞转录/翻译系统中体外产生VLPs。

包裹异源物质的VLPs的组装

在VLP的合成过程中，VLP通常与通过翻译能产生它们的信使RNA关 联。这对于本申请中描述的系统的亲和选择性能很重要。但是，在某些其他 应用中(例如药物或显像剂的靶向递送)，可能希望向VLP中引入其他物质。 可以在有所述异源物质的情况下，进行体外VLP组装反应来组装成这些 VLP。具体来说，由已经用变性剂(通常是醋酸)分解了的VLP获得纯化的 外壳蛋白亚基。将蛋白亚基与异源物质混合。在特定实施方案中，所述物质 对VLP内部有某些亲和力，优选是带负电荷的。

另一种方法涉及将异源物质附着到合成RNA形式的翻译操纵序列上。 在体外组装反应过程中，所述RNA会与它的识别位点紧密结合，带着外来 物质有效地合并到产生的VLP中。

在另一个实施方案中，物质经过VLP表面天然存在的孔被动扩散到VLP 内。在特定实施方案中，所述物质小到足以经由这些孔(在MS2中，直径大 约10埃)透过，并且对VLP内部有高亲和力。

VLP群

正如以上提到的，发明涉及VLP群或文库。术语“群”和“文库”在 本说明书中可以互换使用，因此被看作是同义词。在一个特定实施方案中， 文库可以是随机文库；在另一个实施方案中，所述文库是抗原片段文库，即 来源于抗原性多肽的片段的文库。

随机文库(群)

可以制备编码肽的寡核苷酸。在一个特定实施方案中，编码特定氨基酸 的三联密码子具有NNS的组成，其中N是A、G、C或T；S是G或T；或 者具有NNY的组成，其中N是A、G、C或T；Y是C或T。将多个三联 密码子插入外壳蛋白基因，导致蛋白产物中被插入相应的肽。为了尽量减少 存在的终止密码子，可以利用由定做的三核苷亚磷酰胺混合物(可从Glen  Research,Inc.购买)合成的寡核苷酸来构建肽文库，所述混合物经设计能更准 确地反映天然的氨基酸组成，并且完全缺乏终止密码子。

在外壳蛋白中插入这类随机序列导致合成VLPs群(或文库)，每个颗粒 在其表面展示不同的肽。这种群可能是极大的，由十几亿个独立成员组成。 经常观察到这种文库中存在几乎任何受体(例如单克隆抗体)的特异配体，虽 然它们通常代表的只是整个群体的一小部分。亲和选择和之后的扩增(对本 发明，是通过对被包裹RNA的逆转录和PCR)使得能对这些稀少种类进行回 收、分析和开发。

实施例

参考以下非限制性实施例可以更好地理解发明，这些实施例仅供作为发 明的范例。提供以下实施例是为了更全面地阐述发明的优选实施方案，而不 是对发明广泛范围的限制。

展示低效价异源肽的VLPs的产生.

本申请详细描述了在MS2VLPs上进行肽展示的近期技术发展，包括用 于简单地生产随机序列肽文库和控制肽展示效价的新质粒载体。它代表了已 公开的美国专利申请US20090054246中描述的方法的进展。

本发明涉及建立具有与丝状噬菌体展示类似的亲和选择性能的MS2病 毒样颗粒(VLP)平台。本发明部分基于RNA噬菌体的外壳蛋白既有展示外 来肽又能包裹作为其合成模板的同一mRNA的能力。这个过程在形成VLPs 的细菌细胞中由质粒合成外壳蛋白-随机肽融合。从细胞中提取VLPs，根据 与特异抗体的结合进行亲和选择。最后，从选中的VLPs中提取RNA并进 行逆转录和PCR来回收和扩增所包裹的序列，然后将所述序列克隆并重新 导入细菌，它们就在细菌中作为模板进行另一轮的合成、组装和选择。按需 要将过程反复进行多次，最后，克隆选中的序列以便高水平细菌表达选中的 VLPs。

为协助疫苗开发而建立的本发明的方法，除其他几个用途之外，具有以 前不能在单一平台上实现的重要特征。首先，所述方法通过在病毒样颗粒 (VLP)表面展示密集的外来肽重复阵列保证了高免疫原性。这不仅会产生对 外来抗原的强劲免疫反应，还能克服免疫耐受并诱发抗自体抗原的抗体。第 二，在类似噬菌体展示的过程中，本发明的平台允许从复杂的随机序列文库 中对亲和选择的序列进行回收和扩增。因此本发明在单一平台中结合了通过 限制效价和亲和选择来鉴定相关表位的能力，和然后将这些表位作为疫苗呈 递给免疫系统的能力。通过针对抗体目标物进行亲和选择来鉴定和优化表 位，然后，在不用换平台的情况下，将表位直接作为疫苗呈递给免疫系统。 在无需改变初始选择过程中呈现的结构限制的情况下，肽被高密度展示，从 而提高了分离到忠实模拟天然表位的分子的可能性，免疫过程中维持最佳结 构的可能性，以及诱发相关抗体反应的可能性。

用于在MS2VLPs上构建高复杂度随机序列肽文库的质粒载体.

利用MS2VLP随机序列肽文库的第一个试验在pET3d(带有T7转录单 位的氨苄青霉素抗性质粒)的简单衍生质粒中进行。结果对于方便地产生高 复杂度文库来说，这并非是最佳系统，发明人之后又制备了一系列结合了多 种看似重要的任选特征的载体。所述特征表壳:

A.带有方便插入AB环的克隆位点的单链二聚体。pDSPl (图1)表达 单链二聚体的编码序列，所述序列经过改造在AB环编码序列里面或者附近 含有例如独特的SalI和KpnI限制性酶切位点。一般在外壳序列的下游包含 BamHI位点。这种二聚体形式有助于简单地将外来序列克隆到AB环中。为 了使这些位点是独特的，需要破坏掉载体和上游外壳序列以及质粒序列中的 多个SalI和KpnI位点。

B.卡那霉素抗性。pDSPl赋予对卡那霉素的抗体。这使得可以相对开 始的高背景未转化细胞挑选液体培养物中的转化细胞，从而极大地促进文库 的构建。第一代质粒载体带来的氨苄青霉素抗性不适合这个目的，因为被转 化大肠杆菌会快速降解抗生素，导致惊人短的时间内培养物中即失去选择的 能力。这样未转化细胞就会过度生长，而未转化细胞显然通常在群体中占绝 大多数，即使使用的转化方法效率高。

C.M 13复制原点。到目前为止，发明人已经通过这样一个步骤构建了 随机序列文库，所述步骤中利用PCR引物产生一端附着有随机化序列的片 段。片段然后用合适的限制性核酸内切酶消化并克隆到pDSPl中的上述独特 位点(一般在SalI和BamHI之间，见图1)。利用这种方法，发明人已经制 备了由多达10⁹个独立重组体构成的文库。但是，这种规模的文库不方便用 这些方法构建；要构建更大的文库需要能够有效产生比典型连接反应中产生 的重组DNA产量大得多的方法。具体来说，其他人已经利用定点突变方法 产生了10¹¹复杂度范围的丝状噬菌体文库(3)，发明人利用了所述方法的变 化形式(2)。该方法依赖错配引物在dUTP取代的单链环形模板(通过将模板 DNA生长在诸如CJ236或BW313的dut^-、ung^-宿主即可实现dT被dU取代) 上的延伸。为了产生随机序列肽文库，引物每边含有通过与AB环任意一侧 外壳序列的序列互补旁接的随机DNA序列。引物用DNA聚合酶进行延伸， 利用DNA连接酶产生共价闭合的双链环。转化(例如通过电穿孔)ung+菌株 导致强选择性地增殖突变链，并且得到高产量的带有插入序列的重组体。这 些插入突变反应可以对相对大量(例如20ug)的DNA进行，通过电穿孔足以 容易地产生10¹¹或以上数量级的独立重组体。

为了协助产生单链DNA，给质粒中引入M 13复制原点，根据M 13原 点的方向命名为pDSP61和pDSP62(图2)。还构建了被称为M13CM1的辅 助噬菌体。它是M13K07的衍生物，其中的卡那霉素抗性被氯霉素抗性代替， 使得能选择同时存在辅助M13cml和pDSP6，后者赋予了卡那霉素抗性。 M13辅助噬菌体超感染含有质粒的dut^-、ung^-菌株(例如CJ236)很容易地产 生dUTP取代的单链DNA。

D.合成的“密码子颠倒的”外壳基因。希望利用引物延伸突变来构建 文库引起了新的问题，使得有必要给pDSP6引入所谓的“密码子颠倒的” 外壳序列。本发明的肽展示方法依赖于只给单链二聚体中两个AB环中的一 个特异引入外来肽的能力。在以上描述的方案中，致突变引物在正常情况下 与单链二聚体的两半均会退火，造成双重插入。但发生在两个AB环的同时 插入会导致高频率的蛋白折叠失败。因为这个原因，合成了密码子颠倒形式 的外壳蛋白。所述密码子颠倒形式在单链二聚体的上游一半中引入了最大可 能数量的沉默核苷酸取代，因此产生具有野生型外壳蛋白氨基酸序列的多 肽。但是大量突变的存在使密码子颠倒的序列不能有效地与致突变寡核苷酸 退火。这样插入只针对单链二聚体下游一半。

pDSPl和pDSP62的变体，分别称为pDSPl(am)和pDSP62(am)保留了 pDSPl和PDSP62的所有特征，但通过定点突变将丙氨酸密码子(限定单链二 聚体中下游外壳蛋白拷贝的第一个氨基酸)转换为UAG(被称为琥珀密码子 的特异无义或终止密码子)。该终止密码子被阻遏时即可由单一mRNA合成 野生型和单链二聚体型外壳蛋白。这就能够如下文更详细描述的控制肽展示 的平均效价。

通读无义密码子通常需要有被抑制的特定终止密码子的特异性抑制型 tRNA。对所有三种终止密码子有活性的抑制型tRNAs已有描述，是分子生 物学家熟知的。本文描述的工作使用了琥珀密码子，因此需要用到琥珀抑制 型tRNA，在这里经特别设计可以插入丙氨酸。但是应当明白，可以类似地 使用对其他终止密码子(UAA和UGA)特异的并且能插入各种氨基酸的抑 制型tRNAs。

为了在细菌细胞中产生抑制型tRNA，制备了名为pNMsupA的质粒(见 图3)。该质粒是pACYC18的衍生质粒，含有来源于p15A质粒不相容群的 复制原点。它还提供对氯霉素的抗性。这意味着它能稳定保持在已含有 pDSPl(am)或pDSP62(am)的细菌细胞中，这两种质粒含有ColEl原点并赋予 对卡那霉素的抗性。质粒pNMsupA还含有lac启动子和来自pUC 18的多接 头位点，所述多接头位点中插入了合成的抑制型tRNA基因。tRNA基因的 转录处于lac启动子的控制下，意味着lac操纵子(例如IPTG)的诱导物可以 调控抑制型tRNA的合成。合成tRNA基因的序列模仿了Kleina et al.(4)先前 描述的，序列如下所示。序列旁侧是协助它克隆到pNMsupA中的EcoRI和 Pstl位点。

GAATTCGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCTTGCATCTAAAG CAAGAGGTC AGCGGTTCGATCCCGCTTAGCTCCACCACTGCAG

已知改变抑制型tRNA的水平也会改变无义抑制的水平。这样通过改变 由pDSPl(am)或pDSP62(am)合成单链二聚体的水平，相信有可能控制每个 VLP上展示的肽的平均数量，从而能在大范围内控制展示效价。虽然 pNMsupA使用的是lac启动子，但应当清楚有多种启动子可以用于控制抑制 型tRNA的合成，其中的一些(例如丙酸酯操纵子(5)的启动子)实际上能更 好地对不同浓度的相应诱导物提供有控制的渐变的反应。

III.调控展示效价.

控制MS2VLP上展示的肽数量的手段是人们希望拥有的。MS2VLP展 示的多效价性(每颗粒90拷贝的表位)使得很难将展示对抗体有内在高亲和 力的肽的VLPs与那些展示的肽的内在亲和力低，但通过参与多个弱相互 作用仍能紧密结合的VLPs区分开(即亲合力vs.亲和力)。这是众所周知的 丝状噬菌体展示存在的问题，在这种展示方法中选择高亲和力相互作用通常 要求使用低展示效价。选择亲和力最高的肽时会提高发现合适分子模拟物的 可能性。以下描述了降低展示效价，从而提高选择严紧度的方法。

调控效价。我们认为选择对给定单克隆抗体有最高亲和力的肽能够提供 天然抗原的最佳分子模拟物，而这些分子模拟物最有可能诱发相关抗体反 应。理想情况下，策略是利用多效价展示进行第一轮筛选，从而获得包含所 有对目标物有某些低亲和力的肽的相对复杂群体。然后希望在后续的轮中降 低展示效价从而提高亲和选择的严紧度。

这个策略中提供了由单一RNA产生大量野生型和少量AB环重组蛋白 的系统。构建了pDSPl(pDSPl(am))的变体，所述变体含有琥珀终止密码子 代替了通常是编码单链二聚体中下游拷贝外壳蛋白的第一个氨基酸的丙氨 酸密码子(见图3)。因此pDSPl(am)正常情况下只产生野生型外壳蛋白，自 然通常组装成VLP。此外，发明人合成并克隆了丙氨酸插入的抑制型tRNA 基因。在来自不同相容群的氯霉素抗性质粒上的lac启动子的表达调控下， 产生的抑制型tRNA量导致翻译外壳序列的核糖体有小部分通读过琥珀(终 止)密码子，产生单链二聚体。这样得到的蛋白质(和它的外来肽)与由相同 mRNA表达的野生型蛋白共组装，形成镶嵌的衣壳。由该载体制备了纯化的 VLPs，据估计每个VLP平均展示大约三个肽。SDS凝胶电泳(见图4)显示 了纯化VLPs中“通读”产物的内容。这些经检测证实亲和选择的严紧度如 预期的得以提高。琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹验证了颗粒包有相关 RNA。如果需要，可以通过降低抑制型tRNA的表达水平进一步减少效价。 事实上，通过调节抑制型tRNA合成水平是有可能在大范围内调控通读产物 的表达(和展示效价)的。实现这一点可以通过利用启动子(例如proB)引导 tRNA的表达，所述启动子的活性可以作为诱导物浓度的函数进行准确地调 整。

抗原片段库

替代的策略利用现有的已克隆的抗原基因或病原体基因组来制备随机 抗原片段文库。有多种方法可以制备这类文库。一种方法涉及对抗原基因进 行随机片段化，例如通过用DNaseI处理来产生适宜平均大小(例如～30bp) 的片段。将它们平末端连接到编码外壳多肽的基因中的合适位点(例如连接 到单链外壳蛋白二聚体的AB环中)。然后对得到的文库进行亲和选择来回收 展示抗体识别的肽的VLPs。在特定实施方案中，可以在外壳多肽的AB环 或N末端插入限制性酶切位点。

合成

RNA噬菌体VLPs通常是由质粒在活的大肠杆菌细胞中产生的，大肠杆 菌被裂解并提取VLPs。在发明人到此为止进行的和本申请其他地方描述的 试验中，MS2和PP7VLPs上的随机序列肽文库正是以这种方式产生的。但 是，在特定替代实施方案中，本发明的群体可以利用本领域已知的步骤(参 见例如美国专利7,008,651;Krarner el ah,1999.Cell-free Coupled  Transcription-translation Systems From E.coli，In Protein Expression。A  Practical Approach,Higgins and Hames(eds.),Oxford University Press)，在偶联 的体外转录/翻译系统中合成。在特定实施方案中，噬菌体T7(或相关的) RNA聚合酶被用于在系统中引导克隆到T7启动子的调控下的基因的高水平 转录，所述系统经优化能够高效地翻译这样产生的大量RNA(参见例如Kim  et al,1996,Eur J Biochem 239:881-886;Jewett et al..2004,Biotech and  Bioeng 86:19-26)。

体内产生VLPs时，大肠杆菌细胞自身提供区室化确保多拷贝给定外壳 蛋白-肽重组体特异地和它的mRNA组装。除非提供类似形式的区室化，否 则在由模板混合物(即文库)进行体外合成的过程中，特别是在本发明的群体 中，有可能不同(区别在于它们融合了不同的肽)的个体外壳多肽会相互包装 mRNAs，从而破坏了有效噬菌体展示所需要的基因型/表现型之间的联系。 而且，因为每个VLP是由多个亚基组装而成的，可能发生杂合VLPs的形成。 因此，在一个优选实施方案中，当制备本发明的群体或文库时，一或多轮转 录/翻译反应在水/油乳剂(Tawfik et al.,1998,Nat Biotechnol 16:652-6)中进 行。在这种目前已成熟的方法中，各个模板被隔离到水/油乳剂的水性区室 内。在合适的条件下，可以形成数量巨大的小水滴，每个平均含有单个DNA 模板分子和转录/翻译机制。这些区室由于被油环绕，相互之间没有沟通。 在这种液滴中合成的外壳多肽会特异地与编码它们的相同mRNAs关联，应 当会组装成只展示一个肽的VLPs。合成后，将乳剂破坏，回收VLPs进行 选择。在一个特定实施方案中，所有转录/翻译反应都是在水/油乳剂中进行 的。在一个特定实施方案中，只分离了每滴仅含一个模板的液滴(只展示一 个肽的VLPs)。在另一个实施方案中，在一或多轮转录/翻译中分离含有混合 VLPs的液滴，然后分离只展示一个肽(每个液滴一个模板)的VLPs。

VLPs和VLP群的用途

本发明的VLPs和VLP群有许多可能的用途。正如以下更详细描述的， VLPs可以作为免疫原性组合物，特别是疫苗；作为药物递送装置；作为生 物医学显像剂或者自组装的纳米装置。本发明的VLP群可以用于挑选合适 的疫苗候选物。

疫苗候选物的选择

本发明的VLP群或文库可以用于选择疫苗候选物。所述文库可以是随 机文库或抗原性文库。随机肽序列文库或者替代的来源于抗原的肽序列文库 展示在VLPs表面，然后利用抗体通过亲和选择分离特异目标表位或者可能 是模拟表位s。因为VLPs包裹着自己的mRNAs，可以通过逆转录和PCR 回收它们(以及它们的外来肽)的编码序列。随后可以将各个亲和选择到的 VLP克隆、过表达和纯化。

噬菌体展示中的亲和选择技术已经成熟，可以直接应用于本发明的VLP 展示系统。简单来说，允许抗体(或抗血清)与随机序列展示文库或抗原片段 展示文库中的VLPs上的肽形成复合体。一般抗体已用生物素进行了标记， 这样通过与包被链霉亲和素的表面、磁珠或其他合适的固定基质的结合即可 捕获到复合体。清洗后，将结合的VLPs洗脱，从亲和选择到的群中提取 RNA，进行逆转录和PCR来回收外壳编码序列，然后将所述序列再克隆， 进行更多轮的表达和亲和选择，直至获得结合最佳的变体。可以想到多种从 VLPs回收RNA的方案。一个令人感兴趣的可能是简单地将生物素 -mAb-VLP复合体捕获在包被链霉亲和素的PCR管中，然后将VLPs热变性， 直接对其RNA成分进行RT-PCR。存在许多显然的替代方法，根据诸如各 种固定基质的结合容量的一些考虑，可能需要调整。选中的序列一旦经 RT-PCR回收了，它们的克隆和向大肠杆菌中的再次引入就很简单，每个阶 段需要注意保持必要的文库多样性，当然这随着每轮筛选而逐渐减少。但选 择结束时，可以将每个克隆过表达产生VLP疫苗候选物。

为了确立在MS2VLP平台上进行的亲和选择的效率，利用单克隆抗体 靶通过以上描述的方法进行了选择，所述抗体的表位已被很好地研究过。 M2抗Flag单克隆抗体,和在pDSPl中构建的文库含有插入到氨基酸13和 16的密码子之间的十个NNS三联密码子(即13/16插入模式)。该特定文库含 有大约10个独立克隆，高效价展示外来肽。自此，利用pDSP62已构建了 更复杂的文库(见上文)，但pDSPl文库被认为足够复杂，可以提供合理的可 能性碰到Flag表位。第一轮选择是对250ng通过吸附固定在塑料孔上的抗 体进行的，估计VLPs超过抗体分子10倍。充分洗涤后，将结合的VLPs洗 脱，然后进行逆转录和PCR。PCR产物经SalI和BamUI消化，被克隆到 pDSP62中产生VLPs，用于第二轮。在这一步和所有的后续轮中，被选中的 分子的克隆产生了至少5x 10⁶个独立克隆。第二轮在和第一轮相同的条件 下进行。第二轮和第三轮的产物被克隆到pDSP62(am)中，如上所述在有琥 珀抑制序列(pNMsupA)的情况下产生VLPs，意味着在第3和4轮中肽以低 效价展示。第四轮中，抗体的量减少到50ng，这样VLPs比抗体大约多50 倍。第四轮后，估计到VLPs的过度产生和纯化，将产物克隆到pDSP62中 以便高效价展示。来自每轮的几个选中序列如图22所示。早期几轮中获得 的序列与已知的Flag表位(DYKDDDDKL)只有有限的相似性，但某些关键 元件已很明显，包括特别是YK二肽。到第三轮，所有序列显示出DYK元 件和至少一个下游的D。到第四轮，由接受序列分析的7个克隆只得到一个 序列。它与野生型Flag表位序列的相似性很明显。Flag表位之前利用传统 的丝状噬菌体展示方法进行过鉴定，结果报道于NEB Transcript,Summer 1996(NEB Transcript是噬菌体展示文库和亲和选择试剂盒的供应商New England Biolabs的出版物(其网站www.Neb.com有提供)。图22报道的序 列事实上比NEB试验中获得的序列与实际表位更吻合，这表明在通过亲和 选择进行表位鉴定方面，MS2VLP展示系统至少与丝状噬菌体展示一样有 效。

免疫原性组合物

正如以上提到的，通过本发明的筛选过程鉴定到的VLPs可以用于配制 免疫原性组合物，特别是疫苗。所述疫苗应当处于能够被给予动物的形式。 一般来说，疫苗包含常规的盐或缓冲水溶液基质，其中悬浮或者溶解有本发 明的组合物。以这种形式，本发明的组合物可以方便地用于预防、缓解或者 其他方式地处置状况或紊乱。被引入宿主后，疫苗能够激发免疫反应，包括 但不限于产生抗体和/或细胞因子和/或激活细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、 辅助T细胞、树突细胞和/或其他细胞反应。

任选地，本发明的疫苗还包含与本发明的组合物相比处于次要或主要部 分的佐剂。术语“佐剂”用于本文是指非特异性免疫反应刺激剂；或者是在 宿主中形成储库，与本发明的疫苗组合起来可以提供进一步加强的免疫反应 的物质。有多种佐剂可以使用。例子包括完全和不完全弗氏佐剂、氧化铝和 经过修饰的胞壁酰二肽。

任选地，本发明的疫苗还包含与本发明的组合物相比处于次要或主要部 分的佐剂。

靶向的药物递送

亲和选择可以用于鉴定与特异细胞受体结合的肽，从而产生能够结合并 (例如通过胞吞)进入靶细胞的颗粒。MS2VLP是内直径在20nm数量级的空 心球。在特定实施方案中，VLP包含待递送的药物(例如蛋白毒素)和任选的 与细胞型特异的受体结合的配体。这种颗粒的内部组成可以通过特异加载例 如蛋白质(比如蓖麻毒素)或者通过将它与合成的翻译操纵序列模拟物偶联来 调控。通过赋予这些颗粒外表面与细胞型特异受体结合的能力，有可能将毒 素(或其他药物)靶向递送到选定的细胞类型。在相关方面中，包含外壳多肽 二聚体的VLP可能实际上包裹着诸如细菌毒素、佐剂或免疫刺激性核酸的 异源物质。

生物医学显像剂

正如可以将药物靶向到特异细胞类型，以同样的方式也可以将磁共振成 像使用的显影剂递送到特异细胞或组织，从而可能极大地提高MRI的诊断 威力。事实上，已用钆标记MS2颗粒来大大提高MRI的显影(Anderson et al., 2006,Nano Letters 6(6),1160-1164)。因此，在特定实施方案中，通过在颗 粒表面展示合适的受体特异性肽，可以将它们靶向到特定部位。在相关方面 中，包含外壳多肽二聚体的VLP可能实际上包裹着显像剂。

自组装的纳米装置

本发明的VLPs可能包含对丝状噬菌体颗粒任一末端有亲和力的肽，其 中所述噬菌体颗粒展示金属结合蛋白。VLP对丝状噬菌体颗粒任一端有亲和 力就有可能将这些球(以及它们的任何内容)连接到丝状噬菌体纳米丝的末 端。替代地，VLPs可以展示金属(例如金和锌)结合肽，这样有可能获得具有 特别的电学和光学特性的阵列。替代地，通过展示对特定表面有亲和力的肽， 可能产生的VLPs自组装成这些阵列的能力提高，或者可能改变VLPs自身 的自缔合特性。

实验综述

描述了两个协助在噬菌体MS2的病毒样颗粒(VLPs)上构建随机序列肽 文库的质粒载体。第一个是pDSPl，构建用于将PCR产生的或者其他的双 链DNA片段方便地克隆到外壳蛋白单链二聚体下游拷贝的AB环中。第二 个称为pDSP62，是特别构建用于将肽序列通过Kunkel et al.[16]的定点突变 方法引入单链二聚体的几乎任何位点(通常是AB环)。下文中给出了质粒的 一般特征。

实施例1

pDSPl-单链二聚体的表达质粒，带有方便插入AB环的克隆位点。

质粒pDSPl(见图5a和7a)含有pET3d中的T7转录信号和pET9d中的 卡那霉素抗性基因和复制原点(关于pET3d和pET9d的信息可见New  England Biolabs的载体数据库https://www.lablife.org/ct?f＝v&a=listvecinfo)。 该质粒表达MS2单链外壳蛋白二聚体的编码序列(6)，所述序列经过改造含 有独特的SalI和KpnI限制性酶切位点。这有助于简单地将外来序列克隆到 AB环中。为了使这些位点是独特的，需要破坏掉载体和上游外壳序列中的 其他SalI和KpnI位点。

用于pDSPl的AB环插入位点附近的MS2外壳序列如下所示。注意其 中的SalI和KpnI位点。

…6  7  8  9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22…

…GlnPheValLeuValAspAsnGlyGlyThrGlyAspValThrValAlaPro…

…CAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGTACCGGCGACGTGACTGTCGCCCA…

SalI   KpnI

如下所示是pDSPl中的随机7聚体文库的例子，其中随机序列以所谓 13/16模式插入。

…6  7  8  9 10 11 12 13                            16 17 18 19 20 21 22…

…GlnPheValLeuValAspAsnGly x  x    x  x  x    x  x  GlyAspValThrValAlaPro…

…CAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGGCGACGTGACTGTCGCCCCA.

SalI

编码AB环的序列里面或者附近存在独特的限制性酶切位点，这样就可 能在外来序列旁侧有那些切割能够产生相容“粘末端”的位点时，简单地将 外来序列插入。但是，有时将PCR和图5b中显示的重组DNA方法联用可 以更方便地附着外来序列。例如，以下显示的5'-PCR引物可以与3'引物(与 BamHI位点下游的质粒载体序列退火)一起使用产生外壳蛋白编码序列的一 个片段，其中在氨基酸13和16之间插入了随机序列。N=A、C、G或T， S=G或C。片段用SalI和BamHI消化后，插入pDSPl的SalI和BamHI之 间。如下所示是可用于制备这类文库的5’引物的例子:

5'-CGCGTCGACAATGGC(NNS)7GGCGACGTGACTGTCGCCCCA-3"

利用pDSPl，随机序列肽文库通常是通过将PCR片段克隆到AB环中构 建的，其中所述PCR片段是用单体外壳蛋白序列作为模板(例如pMCT)产生 的。合成寡核苷酸5”引物经设计可以给AB环紧邻的上游位点加上SalI(或 KpnI)位点和随机密码子序列(例如6-10个拷贝的NNY)。3’引物与质粒载体 中紧邻BamHI的下游的序列退火。这样得到的PCR产物用SalI(或KpnI)和 BamHI消化，克隆到pDSPl中的相应位点。这使肽被插入AB环中，插入的 准确位点取决于5’引物的具体设计。对于多数插入，优选使用SalI位点，因 为在选择插入位点方面，它比KpnI灵活性更大。利用这些方法，可以比较 简单直接地制备含有多达10⁸-10⁹个独立成员的肽VLP文库。

为了引入一个调控肽展示效价的手段，通过在单链二聚体两部分相接处 引入无义密码子构建了pDSPl的衍生质粒(称为pDSPl(am))。在有无义抑制 型tRNA(比如pNMsupA产生的)的情况下被表达时，产生了少量的单链二 聚体(以及它的外来肽)。但是由pDSPl(am)产生的外壳蛋白中大部分被合成 为野生型的单位长度的形式。两种形式的外壳蛋白共组装成杂合颗粒，平均 只展示大约3个肽。通过改变抑制型tRNA的表达水平或者通过采用表现更 强或更弱抑制效力的抑制序列，可以上调或者下调展示效价的平均水平。

实施例2

pDSP62–适合用于利用有效的定点突变法进行文库构建的质粒

M 13复制原点的引入。

象以上描述的用pDSPl构建文库的方法很难加大规模，因为纯化必要量 的DNA限制酶切片段不方便。而且，在连接反应过程中，某些DNA不可 避免地被转化成没有用处的副产品，因此减少了所需质粒的产量。复杂文库 的构建会得益于能够有效产生比典型的连接反应产量更大的正确重组DNA 的方法。具体来说，优选使用旧的定点突变方法的变化形式，该变化形式的 方法已被其他人用于在丝状噬菌体上产生10¹¹复杂度范围的肽文库(2,6)。 该方法被应用于由含有M l3复制原点的特定类型的质粒(又称为噬粒)产生 的单链环形DNA。用M13辅助噬菌体(例如M13K07)感染含有质粒的dut^-、 ung^-菌株(例如BW313)容易地产生dUTP取代的单链DNA。在实际的突变 反应中，错配的寡核苷酸引物与单链DNA模板退火，并用DNA聚合酶(例 如T7噬菌体的)使之延伸。将DNA连接产生闭合的环形DNA，通过转化引 入ung+菌株，在这里突变链被完美地复制。制备肽-VLP文库的经验表明大 约90%的转化子含有希望的肽插入片段。引物延伸突变反应可以在较大量的 DNA(例如20ug)上进行，通过电穿孔足以容易地产生10¹¹数量级的独立重 组体。

为了协助单链DNA的产生，将M l3复制原点引入pDSPl。为此，pUC119 中存在的M 13原点经PCR扩增并克隆到pDSPl中独特的AlwNI位点中。 该质粒(称为pDSPl -IG)是pDSP62的来源。因为它只是构建pDSP62I的一 个中间体，其序列未显示。

利用合成的“密码子颠倒”外壳基因将插入片段靶向到单链二聚体的两半之一。

利用引物延伸突变来有效地构建肽文库的愿望带来了新的问题。本发明 的展示方法依赖于只向单链二聚体两个AB环中的一个特异引入外来肽的能 力。利用pDSPl中的单链二聚体序列，致突变引物会与两半的序列都退火， 造成双重插入，但已经知道发生在两个AB环的插入会导致高频率的蛋白折 叠失败。而且，即使插入被容忍了，不能只靶向单链二聚体两部分中的一个 的定点突变会造成每个VLP上展示两个不同的肽。

因为这些原因，合成了“密码子颠倒”形式的外壳蛋白，并替换了单链 二聚体中正常的上游一半。密码子颠倒的序列含有最大可能数量的沉默核苷 酸取代，因此产生具有野生型外壳蛋白氨基酸序列的多肽。但是，大量突变 的存在使得颠倒的序列不能有效地与致突变寡核苷酸退火，因此致突变引物 被特异地引导到下游AB环序列。质粒pDSP62如图6所示，图7b提供了它 的序列。

用于产生单链pDSP62的氯霉素抗性M 13辅助噬菌体。

质粒pDSP62赋予卡那霉素抗性。通常用于产生单链噬粒DNA的辅助 噬菌体(例如M13K07)也可赋予卡那霉素抗性，因此不适合与本文描述的质 粒一起使用。为此，构建了M 13K07的氯霉素抗性衍生质粒M13CM1。用 能够添加XhoI和SacI的识别序列的引物经PCR扩增pAC YC184(7)中的氯 霉素抗性基因，将片段插入M13K07，借助基本侧接卡那霉素抗性决定基因 的XhoI和SacI位点代替它的卡那霉素抗性基因。在有卡那霉素(维持pDSP62) 和氯霉素(用于选择辅助噬菌体)的情况下，细胞在感染M 13CM 1后产生 大量单链质粒DNA。利用这些单链模板和Kunkel et al.的方法(2)，容易地给 [NNS]₆、[NNS]₇、[NNS]₈和[NNS]₁₀制备了含有10¹⁰个以上独立成员的随机 序列肽文库。通过扩展规模，有可能达到显著更高的复杂度。

为了引入一个调控肽展示效价的手段，通过在单链二聚体两部分相接处 引入无义密码子构建了pDSP62的衍生质粒(称为pDSP62(am))。在有无义 抑制型tRNA(比如pNMsupA产生的)的情况下被表达时，产生了少量的单 链二聚体(以及它的外来肽)。但是由pDSP1(am)产生的外壳蛋白中大部分被 合成为野生型的单位长度的形式。两种形式的外壳蛋白共组装成杂合颗粒， 平均只展示大约3个肽。通过改变抑制型tRNA的表达水平或者通过采用表 现更强或更弱抑制效力的抑制序列，可以上调或者下调展示效价的平均水 平。

正如以上描述的，噬菌体MS2的病毒样颗粒被用于肽展示，确认MS2 外壳蛋白单链二聚体能够高度容忍肽插入，它们产生正确组装的VLPs，所 述VLPs特异地包裹着编码其合成的mRNA[2])。但是MS2只是具有相似分 子生物学的病毒大家族中的一个成员。上文描述的质粒和方法代表了对先前 描述的MS2VLP展示系统的细微改良，发明人在之前的描述中展示了MS2 外壳蛋白单链二聚体对插入的容忍和MS2VLP包裹引导其合成的mRNA的 能力[2]。下面的实施例记录了近期在PP7VLPs中获得的类似结果，特别 显示了PP7单链外壳蛋白二聚体的折叠和组装也表现出对外来肽插入的高 度容忍和这样获得的VLPs含有mRNA形式的决定其合成的遗传信息。

因此这里描述了为了肽展示，铜绿假单胞菌的噬菌体PP7的VLPs的制 造。

PP7VLPs相比MS2VLP具有几个潜在的优势和改进。首先，因为存在 起稳定作用的亚基间二硫键，颗粒在热动力学上显著地更稳定(8)。对于许多 实际应用，包括疫苗，稳定性提高是人们所希望的特点。其次，PP7VLPs 与MS2的VLPs没有免疫学上的交叉反应性(9)。这对需要连续给予VLPs 的疫苗或靶向药物递送应用可能很重要。第三，预计PP7VLP的正确折叠 和组装可能更能抵抗肽插入的失稳效应，或者可能至少对某些MS2VLPs不 能容忍的肽能够容忍。

实施例3

PP7肽展示载体的设计。

为了在大肠杆菌中合成PP7外壳蛋白，构建了两种一般质粒(见图9和 13)。第一种从lac启动子表达外壳蛋白，用于(与pRZP7组合–见下文)利用 翻译抑制序列和VLP组装分析来检验外壳蛋白对肽插入的容忍性。第二种 质粒类型从T7启动子和转录终止子表达外壳蛋白。这些质粒产生大量能够 正确组装成VLP的外壳蛋白。它们还产生带有各别5’和3’末端的外壳特异 的mRNA被包裹到VLPs中。

肽插入位点的设计。

PP7衣壳的三维结构显示它是由外壳蛋白构成的，所述外壳蛋白的三级 结构与MS2的高度相似，尽管这两个蛋白的氨基酸序列只表现出大约12% 的序列同一性(10)[17]。PP7蛋白具有一个AB环，可以按照与先前描述的 用于MS2的方案[2]类似的方案插入肽。如MS2的情况一样，开始是对PP7 外壳序列进行突变使其含有限制性核酸内切酶KpnI的位点，从而协助在称 为pP7K的质粒中插入外来序列(图9a)。这个改造导致的氨基酸取代(E11T) 如图10所示。该取代被很好地容忍，因为突变体外壳蛋白阻遏了翻译并正 确组装成VLP。同样遵循MS2的例子，假设单链二聚体形式的PP7外壳蛋 白的折叠比常规二聚体更容忍AB环插入。先前描述过它的构建(8)，但这里 第一次描述了它在肽展示中的用途。单链二聚体经过改造只在编码序列的下 游拷贝含有KpnI位点，形成p2P7K32(图9b)。在这个设计中，肽被插入到 氨基酸11，但应当指出可以使用其他特定插入位点，可能AB环中任何位点 都可以。事实上，以下检测中描述了两种替代的插入模式(图10和11)。第 一种称为11/11模式，因为第11个氨基酸出现了两次—插入肽N端一侧的 thr，和C端一侧的野生型glu 11。在所谓11/12模式中，插入的一侧邻接thr 11，另一侧邻接ala 12。

为了测试PP7外壳蛋白对AB环插入的一般容忍性，利用图11显示的 方案制备了插入到PP7外壳蛋白AB环中的随机序列肽的文库。所述随机序 列由6、8或10个拷贝的NNY序列(其中N是任意核苷酸，Y是嘧啶)构成。 这些文库含有20种可能的氨基酸中的15种，因此可能呈现极大的多样性。 但是，通过避开终止密码子可以大大地协助后续分析。

实施例4

检验随机序列肽文库中个体成员保持外壳蛋白功能的方法。

PP7外壳和MS2外壳蛋白一样是翻译阻遏物。pRZP7的构建之前已有 描述，该质粒将PP7翻译操纵序列与大肠杆菌lacZ基因融合在一起，使β- 半乳糖苷酶的合成处于外壳蛋白的翻译阻遏物活性的控制下(11)。因为该质 粒赋予对不同抗生素(氯霉素)的抗性，并且来自不同的相容群(即它使用的 是p15A复制原点)，可以容易地将它与pP7K或p2P7K32(这两个质粒赋予 对氨苄青霉素的抗性，使用colEl原点)保持在相同的大肠杆菌菌株中。两个 质粒均来源于pUCl 19，以较低的水平从lac启动子表达外壳蛋白。由pP7K 或p2P7K32表达的PP7外壳蛋白阻遏pRZP7表达的β-半乳糖苷酶的翻译。 这使得很容易确定某个给定肽插入是否会干扰外壳蛋白正确折叠的能力，因 为缺陷外壳蛋白在含有β-半乳糖苷酶产色物质(称为xgal)的平板上产生蓝色 菌落，而功能正常的外壳蛋白生成白色菌落。

对功能的维持情况更严格的检验是直接分析表达肽-外壳蛋白重组体的 细胞的裂解物中是否存在VLPs。这可以通过将超声破碎的细胞在琼脂糖凝 胶上电泳来实现。溴化乙锭染色检测含有RNA的VLP，然后用抗PP7血清 经Western印迹分析来证实VLP的存在。

然后想法是通过制备随机序列肽文库以及确定克隆中维持翻译阻遏物 功能(即产生白色菌落)并产生VLP的部分来测试PP7外壳蛋白和组装对肽 插入的容忍性。注意发明人先前已报道过关于MS2外壳蛋白单链二聚体对 肽插入容忍性的类似测试[2]。

实施例5

PP7外壳蛋白的折叠和组装能够容忍多数随机6聚体、8聚体和10聚 体肽插入。

在pP7K和p2P7K32中构建(NNY)₈文库，并通过转化导入大肠杆菌菌 株CSH41F-/pRZP7。转化子铺含有xgal的固体培养基平板。绝大多数是真 正的重组体，因为不含插入片段的对照连接反应产生少l000x的菌落。只检 验了少数几个pP7K重组体，但发现全部是蛋白折叠缺陷的，不能产生VLPs。 这证实了根据以前用MS2进行的试验[2]产生的预期，即AB环中的肽插入 通常会破坏常规二聚体的稳定性。而在p2P7K32的单链二聚体中，几乎100% 的菌落是白色的。从每个文库取24个白色菌落转移到一式两份的1ml培养 物中。由一组培养物制备粗细胞裂解物进行VLPs的琼脂糖凝胶分析。由另 一组培养物，分离质粒进行限制性酶消化和凝胶电泳，验证全部含有预期长 度的插入片段。来自少数几个蓝色菌落的质粒也进行了分离。

结果全部都含有异常连接反应造成的质粒，一般不含完整的外壳序列。 Virtually 100%的肽插入与外壳蛋白的翻译抑制功能相符。就是说，它们产生 了折叠足够正确的外壳蛋白，象野生型蛋白一样抑制翻译。所有NNY文库– 6聚体、8聚体和10聚体都得到这样的结果，无论它们是以11/11还是11/12 模式克隆的。

为了直接检验VLPs是否存在，从一式两份的培养物中的每一份制备粗 细胞裂解物，进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶用溴化乙锭染色，一个拷贝转印到 硝酸纤维素膜上并用小鼠抗PP7血清和辣根过氧化物酶标记的二抗探测。当 克隆在染色胶和Western印迹中都含有条带时，该克隆被认为是VLP合成阳 性的。结果如图13所示，表明几乎所有6聚体克隆都产生了一定水平的VLP， 尽管少数几个显示出下降的产量。11/11和11/12插入模式都是这样的。绝 大多数8聚体克隆也产生了容易识别的VLP。但是，随着插入片段长度增加 到10聚体，效率似乎有所下降，但明显多数克隆能够产生VLP。注意各个 颗粒的迁移率不同，这与预期的某些肽通过引入带电荷的氨基酸改变了VLP 的表面电荷一致。

实施例6

PP7VLP包裹外壳特异性mRNA

为了进行高水平表达和RNA衣壳化测试，将pP7K和p2P7K32中的PP7 外壳序列克隆到含有T7启动子和转录终止子的质粒中，产生的质粒称为 pETP7K和pET2P7K32。质粒在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中合成大量外壳蛋 白。按照以前的描述(11，12)，通过在Sepharose CL4B上层析将得到的VLPs 纯化。通过酚/氯仿抽提从VLPs中纯化RNA，在一式两份含有甲醛的琼脂 糖凝胶中进行电泳。一份胶用溴化乙锭染色，另一份转印到硝酸纤维素膜 (Northern印迹)，在膜上用对外壳有义链特异的带标记合成寡核苷酸检测PP7 序列。用T7RNA聚合酶体外转录pETP7K和pET2P732产生的RNAs作为 标准。每个VLP含有优势种类，其迁移率与体外转录产物的相同，并且与 PP7外壳特异探针特异地杂交。确认PP7VLPs包裹着它们的mRNAs，建立 了亲和选择所需要的基因型-表现型关联。注意发明人先前报道过关于MS2 外壳蛋白包裹其mRNA的能力的类似检验。

实施例7

PP7VLPs上展示的肽被呈递给免疫系统并且是免疫原性的。

构建了展示如图10和15显示的特定肽序列的PP7VLPs。所述肽序列 包括被称为Flag肽和来源于人16型乳头瘤(HPV16)次要衣壳蛋白L2的序 列、HIV-1gp120的V3环以及炭疽芽孢杆菌保护性抗原。为了说明这些插 入肽的确展示在VLPs的表面，通过ELISA评估了抗HPV16L2的单克隆抗 体(称为RG-1)结合PP7L2-VLPs的能力。如图16所示，RG-1与L2-VLPs 结合，但不能结合展示V3肽的PP7VLPs。为了演示VLPs的免疫原性，按 照以前的描述[2]用V3-VLPs经肌内注射免疫小鼠。如图17所示，来自小鼠 的血清经ELISA检验，显示具有高滴度IgG抗体能够与合成形式的V3肽特 异反应。注意发明人先前报道过关于MS2VLPs上展示的肽的免疫原性的类 似检验。

实施例8

质粒pET2P7K32和pDSP7是以上描述的MS2外壳蛋白产生者质粒 pDSPl和pDSP62的PP7类似物。为了控制PP7VLPs上的肽展示效价，还 构建了pET2P7K32(am)和pDSP7(am)。它们分别是pDSPl(am)和pDSP7(am) 的类似物。

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