用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法

摘要

本发明人描述了一种监测细胞状态的方法，所述方法包括，针对所选择的由所述细胞分泌的microRNA（miRNA）种类，确定（a）所述miRNA种类的前体形式（前体miRNA）与（b）所述miRNA种类的成熟形式（成熟miRNA)之间的比例，其中如此确定的所述前体miRNA与成熟miRNA之间的比例指示所述细胞的状态。本发明人还描述了一种包括如下步骤的方法：（a）提供间充质干细胞（MSC）；和（b）将癌基因引入所述间充质干细胞从而转化它，其中所述转化的间充质干细胞不将所述癌基因的基因产物分泌至其在其中生长的培养基中。

说明书

技术领域

本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉 及医学领域。

具体而言，本发明涉及监测细胞或生物体的生理或病理状态的方法。 本发明还涉及疾病（例如癌症）的诊断和治疗。

参考美国专利申请号60/713,992、12/065,549、12/065,551、60/878,222、 12/377,398、61/066,671、61/227,865和61/257,121。还参考国际专利申请 号PCT/GB2005/003206、PCT/SG2006/000233、PCT/SG2006/000232、 PCT/SG2007/000257和PCT/SG2009/000062。

前述申请、本申请和前述申请中（包括每件前述申请审查过程中）引 用或参考的每份文件（“申请和文章引用的文件”），以及在每篇前述申请 和文章中以及在任何申请和文章引用的文件中引用或提及的任何产品的 任何厂商说明书或目录，均藉此通过引用纳入本文。再者，本文中引用的 所有文件，本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文或任何文 件中引用或提及的任何产品的任何厂商说明书或目录，均藉此通过引用纳 入本文。通过引用纳入本文的文件或其中的任何教导均可用于实施本发明。 通过引用纳入本文的文件不等同于现有技术。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种监测细胞状态的方法，所述方法包括为 所选择的由所述细胞分泌的microRNA（miRNA）种类建立（a）前体形 式的所述miRNA种类（前体miRNA）与（b）成熟形式的所述miRNA 种类（成熟miRNA）的比例，其中如此建立的所述前体miRNA与成熟 miRNA的比例指示所述细胞状态。

所述细胞可以被包含在细胞块、组织、器官或生物体中，所述前体 miRNA与成熟miRNA的比例指示所述各个细胞块、组织、器官或生物 体的状态。所述miRNA种类可以被包含在所述细胞分泌的外核体中，并 且所述方法可以包括获得这类外核体并且获得来自其的前体和成熟形式 的所述miRNA种类。所述外核体可以从生物体的样品中获得。所述生物 体可以包括所述细胞。所述样品可以包括血液样品、血清样品、唾液样品 或尿样。

所述前体miRNA与成熟miRNA的比例可以通过与包含核酸序列的 阵列杂交而确立，所述核酸序列能够结合并区分前体和成熟形式的所述 miRNA种类。所述前体miRNA与成熟miRNA的比例可以通过实时多聚 酶链式反应（RT-PCR）而建立。

所述方法可以包括建立包含对于多个所选择的miRNA种类的多个前 体miRNA与成熟miRNA的比例的谱，每个均指示所述细胞状态。所述 谱可通过与包含多个探针的阵列杂交而建立，所述探针能够结合并区分前 体和成熟形式的多个所选择的miRNA种类。

所述细胞状态可以包括生理状态，例如细胞周期状态、分化状态、发 育状态、代谢状态或病理状态，例如疾病状态、人疾病状态、糖尿病状态、 免疫紊乱状态、神经退行性疾病状态、致癌状态、癌性状态或肿瘤状态。

本发明的第二方面提供了一种方法：（a）用于检测细胞状态变化，所 述方法包括检测所述细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或包含 这类比例的谱）的变化，其中种类变化指示所述细胞状态的变化。本发明 人提供了一种用于确定细胞在具体状态的方法，所述方法包括将所述细胞 的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或包含这类比例的谱）与已知处 于该具体状态的细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或包含这类 比例的谱）进行比较。本发明人提供了一种监测有机体状态的方法，所述 方法包括从该生物体获得样品或者获得该生物体的样品，对所述样品实施 前述权利要求任一项的方法，并且从因此获得的所述前体miRNA与成熟 miRNA的比例确定所述生物体的状态。本发明人提供了一种检测生物体 疾病的方法，所述方法包括从该生物体获得样品或者获得该生物体的样品， 对所述样品实施前述权利要求任一项的方法，并且将因此获得的所述前体 miRNA与成熟miRNA的比例与已知为患病生物体的样品或来自患病生 物体的样品的前体miRNA与成熟miRNA的比例进行比较。本发明人提 供了一种治疗或预防生物体的疾病的方法，所述方法包括如上文所示检测 生物体的疾病，并对所述生物体给予用于该疾病的治疗物。

所述细胞可以包括间充质干细胞（MSC）。所述细胞状态可以包括未 转化的状态和转化的状态。所述转化的状态可以包括c-myc转化状态。所 述microRNA可以包括hsa-let-7b microRNA（miRBase登录号： MI0000063）。转化状态下的所述比例可以是正常状态的2.8倍。上述的 任意组合都是可以的。

本发明的第三方面提供了一种包含多个核酸序列的阵列，所述核酸序 列能够结合并区分前体和成熟形式的多个miRNA种类。

本发明的第四方面提供了一种包括以下步骤的方法：（a）提供间充质 干细胞（MSC）；并（b）将癌基因引入所述间充质干细胞以从而转化它， 其中所述转化的间充质干细胞不将所述癌基因的基因产物分泌至其在其 中生长的培养基中。

所述癌基因可以包括c-myc。所述间充质干细胞（MSC）可以包括已 建立的细胞系例如huES9.E1。所述间充质干细胞（MSC）可以来自于脐 带。

所述转化的间充质干细胞可能能够绕过老化。与尚未被转化的间充质 干细胞相比，所述转化的间充质干细胞可以具有增高的增殖速度。与尚未 被转化的间充质干细胞相比，所述转化的间充质干细胞可以具有降低的群 体倍增时间，例如24小时。与尚未被转化的间充质干细胞相比，所述转 化的间充质干细胞可以具有增加的端粒末端转移酶活性。

本发明的第五方面提供了一种提供条件培养基的方法，所述方法包括 上文示出的步骤，然后在细胞培养基中培养所述转化的间充质干细胞或其 后代以条件化所述培养基，并从所述转化的间充质干细胞分离所述条件化 的培养基。

本发明的第六方面提供了一种提供外核体的方法，所述方法包括:（a） 通过权利要求12的方法得到间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）；（b） 浓缩所述间充质干细胞条件培养基，例如通过在>1000kDa膜上超滤；（c） 对所述浓缩的间充质干细胞条件培养基进行分子排阻色谱，例如使用 TSK Guard柱SWXL，6x40mm或TSK凝胶G4000SWXL，7.8x300 mm柱；并且（d）选择呈现动态光散射的UV吸收级分，例如在220nm 下，所述动态光散射例如通过准弹性光散射（QELS）检测，其中步骤（d） 例如包括收集以11-13分钟（例如12分钟）的保留时间洗脱出的级分。

本发明的第七方面提供了一种制备药物组合物的方法，所述方法包括 通过上文示出的方法获得间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）或外核 体，并根据情况不同将所述MSC-CM或外核体与可药用载体或稀释剂混 合。

所述转化的间充质干细胞、所述条件培养基、外核体或药物组合物可 以包括间充质干细胞的至少一种生物学性质。所述生物学性质可以包括心 脏保护作用。所述条件培养基、外核体或药物组合物可能能够减少梗塞面 积，例如，如在小鼠或猪的心肌缺血和再灌注损伤模型中测定的。所述条 件培养基、外核体或药物组合物可能能够减少氧化应激，例如，如在过氧 化氢（H₂O₂）诱导的细胞死亡的体外测定法中测定的。

本发明的第八方面提供了一种可通过上文所述方法获得的永生化的 间充质干细胞、条件培养基、外核体或药物组合物。

除非另外指出，本发明的实施将运用化学、分子生物学、微生物学、 重组DNA和免疫学的常规技术，这些是本领域普通技术人员的能力所能 及的。这些技术在文献中有说明。例如，参见J.Sambrook，E.F.Fritsch, and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second  Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M. et al.(1995 and periodic supplements;Current Protocols in Molecular Bi- ology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J. Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing：Essential  Techniques,John Wiley&Sons;J.M.Polak and James O’D.McGee, 1990,In Situ Hybridization：Principles and Practice;Oxford University  Press;M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis：A Practical  Approach,Irl Press;D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of  Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of  DNA Methods in Enzymology，Academic Press;Using Antibodies：A La- boratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，David  Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7);Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor), David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of Drug Screening,edited by Rama- krishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,New York,NY,Marcel  Dekker，ISBN 0-8247-0562-9);和Lab Ref：A Handbook of Recipes, Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane  Roskams and Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory， ISBN 0-87969-630-3。这些一般性教材的每一篇都通过引用的方式纳入本 文。

附图说明

图1A、图1B、图1C、图1D、图1E和图1F为示出了hESC-MSC 的转化的图表。

图1A.对来自myc转染的HuES9.E1MSC（E1-myc 21.1）、GFP转 染的HuES9.E1MSC（E1-GFP）和亲本MSC、HuES9.E1（E1）的细胞 DNA的PCR分析。使用分别对外显子2和外显子3特异的引物扩增DNA。 所述内源性myc基因的预计PCR片段大小为1.7kb，所述转染的myc cDNA的是0.36kb，这由来自所述myc-慢病毒的扩增片段表示。

图1B.在光学显微镜下观察到的转染的MSC的细胞形态。

图1C.在来自不同传代的E1-myc 21.1和GFP-MSC的RNA上对所 述c-myc mRNA水平进行的定量RT-PCR。将所述相对myc转录物水平 对GFP-MSC的相对myc转录物水平标准化。

图1D.相对端粒末端转移酶活性。首先通过端粒末端转移酶活性将1 μg细胞裂解蛋白质用于延伸TS引物，然后通过实时PCR对所述端粒末 端转移酶产物定量。所述Ct值代表量所述端粒末端转移酶产物的量，因 此间接与所述裂解物中端粒末端转移酶活性成比例。

图1E.通过G条纹染色法对E1-myc 16.3的核型分析。

图1F.细胞周期速率。用CFDA标记细胞，通过流式细胞术随时间 监测它们的荧光。在每个时间点上细胞荧光的损失均用于计算所述细胞发 生细胞分裂的数目，如材料和方法中所述。

图为示出了表面抗原作谱的图表。将HuES9.E1和E1-myc 16.3MSC 用与荧光染料缀合的特异性抗体染色并通过FACS分析。E1-myc 16.3的 荧光是p16或p6细胞的平均细胞荧光。通过用异构型匹配的小鼠单克隆 抗体孵育所述细胞来评估非特异性荧光。

图3A、图3B和图3C为示出了Hus9E1和E1-myc 16.3MSC的分化 的图。MSC被诱导发生（图3A）骨发生并随后用von Kossa染色剂染色； （图3B）软骨发生并随后用阿辛蓝染色；（图3C）脂肪发生，其中E1-myc 16.3和Hus9E1MSC被暴露于脂肪形成诱导培养基2天。

图4A、图4B和图4C为示出了基因表达分析的图表。将来自Hus9E1 和E1-myc 16.3MSC的RNA杂交于Sentrix HumanRef-8 Expression  BeadChip Version 3并通过Beadstudio和Genespring GX 10分析。

图4A.使用Beadstudio分析成对比较HuES9.E1和E1-myc 16.3 MSC之间的基因表达。

图4B和图4C.PANTHER分析。使用PANTHER算法分析E1-myc 16.3MSC中的161个过表达>2倍的基因和226个低表达>2倍的低表达 基因。将在每个基因集合中对每个生物过程的观察基因频率与参考频率比 较，所述参考频率在该情形下是NCBI数据库中该生物过程的基因频率。 那些观察频率以p<0.05超过参考频率的生物过程被认为是显著的。

图5A、图5B和图5C为示出了对分泌的分析的图表。

图5A.蛋白质印迹分析。将来自E1MSC或E1myc-MSC的细胞裂解 物、条件培养基（CM）和HPLC纯化外核体的蛋白在SDS-PAGE上分 离并用抗myc的抗体、抗Actin的抗体和抗CD9的抗体探测。

图5B.对来自E1myc-MSC的CM的HPLC分级分离和动态光散射。 使用BioSep S4000,7.8mm x 30cm柱在HPLC上对CM分级分离。使用 含150mM NaCl的pH 7.2的20mM磷酸缓冲液洗脱CM中的组分。洗 脱模式是等度的，运行时间是40分钟。对所述洗脱液在220nm下监测 UV吸光度。然后通过光散射分析每个洗脱峰。收集最快的洗脱峰（箭头） 用于在小鼠缺血/再灌注损伤模型中进行测试。

图5C.将0.3μgHPLC纯化的外核体静脉给予小鼠急性心肌/缺血再 灌注损伤模型，5分钟后进行再灌注。测量梗塞面积（IS），形式为在用 盐水（n=10）、来自E1myc 21.1的外核体（n=5）和来自E1myc 16.3的 外核体（n=4）处理时风险面积（AAR）的百分数。在以E1-myc 21.1外 核体或E1-myc 16.3外核体处理的小鼠中的相对梗塞面积（IS/AAR）分 别是23.4±8.2%,和22.6±4.5%，它们的相对梗塞面积显著低于盐水处理 小鼠中38.5±5.6%的相对梗塞面积（分别为p<0.001和p<0.002）。

图6为示出了hESC-MSC的转化的图。图6示出了来自myc转染 的MSC（myc-MSC）、GFP转染的MSC（GFP-MSC）和亲本MSC—— HuES9.E1（MSC）的细胞DNA的PCR分析。使用分别对外显子2 和外显子3特异性的引物扩增DNA。所述内源性myc基因的预计PCR 片段大小是1.7kb，所述转染的myc cDNA的是0.36kb。

图7示出了在来自myc-MSC或GFP-MSC的RNA上对c-myc mRNA进行定量RT-PCR。

图8示出了转染后hESC-MSC的细胞形态。将第22次传代的 HuES9.E1ESC-MSC以含有c-myc或GFP的慢病毒载体转染。在第 22次传代时的转染之后以及在随后一次传代的第23次传代在光学显 微镜下观察c-myc或GFP转染的细胞的形态。

图9示出了相对端粒末端转移酶活性。首先将1μg细胞裂解物蛋 白质利用端粒末端转移酶活性延伸TS引物，然后通过实时PCR定量 所述端粒末端转移酶产物。代表所述端粒末端转移酶产物量的Ct值因 此间接与所述裂解物中的端粒末端转移酶活性成比例。

图10为示出了细胞分泌中前体与成熟miR A的比例的图表。收获 由亲本MSC或myc-MSC条件化的培养基，提取RNA，然后测定成 熟miRNA和前体miRNA。使用对所述前体形式和成熟形式的 hsa-let-7b（miRBase登录号：MI0000063）和hsa-let-7g miRNA特异 性的引物在所述RNA上进行定量RT-PCR，并计算hsa-let-7b （miRBase登录号：MI0000063）和hsa-let-7g miRNA的前体和成熟 形式的比例。

图11为示出了为鉴定原始形式的miRNA而进行引物设计的图。

图12为示出了为鉴定前体形式的miRNA而进行引物设计的图。

图13为示出了为鉴定成熟形式的miRNA而进行引物设计的图。

具体实施方式

间充质干细胞（MSC）是这样的多能干细胞，即其具有有限但强的 分化成间充质细胞类型（例如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞）的潜能，同 时畸胎瘤形成的风险可以忽略不计。MSC移植已经被用于治疗骨骼肌损 伤，改善心血管疾病中的心脏功能以及减轻移植物抗宿主疾病的严重度 [1]。在最近几年，MSC移植已被证明在治疗不同疾病时具有治疗效果， 但背后的机制尚有争议[2,3,4,5,6,7,8,9]。一些报道已经表明MSC分泌的 因子[10]是对动脉生成[11]、肠中干细胞隐窝[12]、缺血性损伤 [9,13,14,15,16,17,18]和红细胞生成[19,20]的治疗效果的主因。作为对旁分 泌假说的支持，许多研究已经观察到MSC分泌可能潜在地主要通过心脏 和血管组织生长和再生来修复受损心脏组织的细胞因子、趋化因子和生长 因子[21,22]。该旁分泌假说可能潜在地提供一种非基于细胞的一替代方案， 用于在治疗心血管疾病中使用MSC[23]。非基于细胞的治疗与基于细胞 的治疗相比通常更易于制造并更安全，因为它们是不活的并且不引发免疫 排斥。

本发明人以前已经证明由来自人胚胎干细胞或胎儿组织的间充质干 细胞（MSC）条件化的培养基[24,25,26]能够保护心脏免遭心脏心肌缺血/ 再灌注损伤，并减少猪和小鼠的MI/R损伤模型中的梗塞面积[25,26,27]。 随后的研究证明了该心脏保护作用被外核体或直径约50-100nm的微粒 介导，这些微粒携带蛋白质和RNA负载[24,25,26,27,28]。这些外核体能 够通过在HPLC上进行尺寸排阻而被纯化为大小均匀的颗粒群[25,26]， 并在所述条件培养基剂量的约十分之一下在小鼠的MI/R损伤模型中减 少梗塞面积。

将外核体鉴定为所述MSC分泌中的治疗剂能够潜在地提供生物治疗 模式，而非基于细胞的治疗模式。不像细胞，外核体不诱发急性免疫排斥 并且不是活的且小得多。它们具有更低的安全风险，例如肿瘤或栓塞形成。 与需要保持存活性的基于细胞的治疗不同，制造和保存非存活的外核体的 复杂性更低，因此成本更低。除了作为治疗剂之外，外核体已经被提出作 为“天然”药物送递载体[29]。这些脂质囊泡能够被装载治疗剂，并被用 于以细胞类型特异的方式送递所述试剂。hESC-MSC可以是用于有效产 生外核体的理想细胞源。本发明人已经证明，这些细胞能够在外核体产生 和收获过程中被以化学上确定地方式培养，并且这些外核体能够通过 HPLC纯化以生成大小均匀的颗粒群[25,26,27]。另一优点是这些细胞来 自于hESC——一种可无限扩增细胞源。

虽然hESC-MSC在培养中也是高度可扩增的，但是与它们的亲本 hESC不同，它们仅可以发生有限次细胞分裂，然后它们的生长停止且它 们衰老。因此，需要从hESC持续分离成批的新MSC来补充所述外核体 的细胞来源，同时每次分离都需要产生用于分离、测试和确认的重复费用。 为了避免这种再次分离的需求并确保无限供应相同的MSC，用于足以在 商业上可持续地产生外核体作为治疗剂或送递载体，本发明人开发了使用 致癌转化绕过衰老。致癌转化能够潜在地改变细胞生物学并影响所述外核 体的产生或性质。以前已经报道，将v-myc基因转染进入胎儿MSC使所 述细胞永生，但不改变这些MSC的基本特性[30]。这里，本发明人将含 编码MYC蛋白的c-myc基因的慢病毒载体转染至第22和16次传代的已 经报道的huES9.E1MSC中[24]，来分别生成一个混合细胞系和三个独立 衍生的克隆细胞系。本发明人依照ISCT对MSC的最低定义标准[31]检 查了所述转化的细胞，所述标准即塑料贴附；CD29⁺、CD44⁺、CD49a⁺、 CD49e⁺、CD105⁺、CD166⁺、MHCI⁺、CD34^-、CD45^-和HLA-DRT^-的表 面抗原谱；以及分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的可能性。评估这些 细胞的分泌中外核体的存在情况，如前述在小鼠心肌缺血/再灌注损伤 （MI/R）模型中测试这些外核体的治疗效果[27]。

转化的间充质干细胞

来自人ESC来源的间充质干细胞（hESC-MSC）的外核体或分泌的 双层脂囊泡已经被证明可减少动物模型中的心肌缺血/再灌注损伤。然而， 因为hESC-MSC不是可无限扩增的，大规模产生这些外核体将需要通过 从hESC分离hESC-MSC来补充hESC-MSC，并发生用于测试和确认每 一新批次的重复成本。

在本文中，本发明人研究了hESC-MSC的c-myc无限增殖化是否将 绕过该限制，同时又不危及治疗有效的外核体的产生。Myc-转化的MSC 很大程度与亲本hESC-MSC相似，主要差异是塑料贴附降低、生长加快、 不会衰老、myc表达增加、失去体外脂肪发生潜能，这在技术上使得所述 转化的细胞为非MSC细胞。然而，来自myc-转化的MSC的外核体能够 减少小鼠的心肌缺血/再灌注损伤模型中的相对梗塞面积，表明产生治疗 性外核体的能力被保持。

因此，本发明人首先提供了一种转化的间充质干细胞。所述转化的间 充质干细胞可以获自或分离自间充质干细胞，例如通过用合适的转化剂 （例如癌基因）进行转化。本发明人还提供了这类转化的间充质干细胞的 后代、细胞培养物或者包含这类转化的间充质干细胞的后代或细胞培养物 的细胞系。这类细胞在本文件中可以称为“转化的间充质干细胞”或通过 本文件中描述的方法获得的转化的间充质干细胞。

因此，本发明人描述了一种方法，包括步骤：（a）提供间充质干细胞 （MSC）；并（b）将癌基因引入所述间充质干细胞，从而将其转化，其 中所述转化的间充质干细胞不将所述癌基因的基因产物分泌至其在其中 培养的培养基中。

所述癌基因可以包括c-myc。

所述间充质干细胞（MSC）可以包括已建立的细胞系例如huES9.E1。

所述间充质干细胞（MSC）可以来自于脐带。

与未被转化的间充质干细胞相比，所述转化的间充质干细胞能够 绕过老化。与未被转化的间充质干细胞相比，所述转化的间充质干细 胞具有增加的增殖速度。与未被转化的间充质干细胞相比，所述转化 的间充质干细胞可以具有降低的群体倍增时间例如24小时。与未被转 化的间充质干细胞相比，所述转化的间充质干细胞可以具有增加的端 粒末端转移酶活性。

本发明人描述了一种提供条件培养基的方法，所述方法包括上文 示出的步骤，然后在细胞培养基中培养所述转化的间充质干细胞或其 后代以将其条件化，并从所述转化的间充质干细胞中分离所述条件化 的细胞培养基。

本发明人还描述了一种提供外核体的方法，所述方法包括:（a） 通过上文示出的方法获得间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）；（b） 浓缩所述间充质干细胞条件培养基，例如通过在>1000kDa膜上超滤； （c）对所述浓缩的间充质干细胞条件培养基进行分子排阻色谱，例如 使用TSK Guard柱SWXL，6x40mm或TSK凝胶G4000SWXL， 7.8x300mm柱；并且（d）选择例如在220nm下呈现动态光散射的 UV吸收级分，所述动态光散射例如通过准弹性光散射（QELS）检测， 其中步骤（d）例如包括收集以11-13分钟（例如12分钟）的保留时 间洗脱的级分。

本发明人描述了一种制备药物组合物的方法，所述方法包括通过上文 示出的方法得到间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）或通过上文示出 的方法得到外核体，并根据情况不同将所述MSC-CM或所述外核体与可 药用载体或稀释剂混合。

所述条件培养基、外核体或药物组合物可以包括间充质干细胞的至少 一种生物学性质，例如间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）的生物学 活性，例如心脏保护作用。

所述条件培养基、外核体或药物组合物可以能够减少梗塞面积， 例如，如在心肌缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型中测定的；或者其 能够减少氧化应激，例如，如在过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞死亡的 体外测定中测定的。

所述条件培养基、外核体或药物组合物可以适合用于治疗选自如 下的疾病：心脏衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤和退行性疾病例如糖尿 病、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、癌症、心肌梗塞、皮肤伤口、皮 肤科疾病、皮肤科损害、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙 瘩、皮肤癌、特应性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋 巴瘤、溃疡、以诱导炎症和免疫功能失调（其导致慢性组织重塑，包 括纤维化和功能丧失）的初始损伤为特征的病理病症、肾局部缺血性 损伤、囊性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎或矫形疾病；或者可以在如下情 况用于辅助个体中的伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移植或骨髓移 植，或者（i）在调节选自如下任何一种或多种通路的通路时：Rho GTP 酶的细胞骨架调节、细胞周期、整联蛋白信号转导通路、由趋化因子 和细胞因子信号传导通路介导的炎症、FGF信号传导通路、EGF受体 信号传导通路、血管发生、血纤维蛋白溶酶原活化的级联、凝血、糖 酵解、泛素蛋白酶体通路、嘌呤的从头生物合成、TCA循环、苯丙氨 酸生物合成、血红素生物合成；（ii）在调节包括如下任何一个或多个 过程的过程时：细胞结构和运动性、细胞结构、细胞通讯、细胞运动 性、细胞粘着、胞吞作用、有丝分裂、胞吐作用、胞质分裂、细胞周 期、免疫力和防御、细胞因子/趋化因子介导的免疫力、巨噬细胞介导 的免疫力、粒细胞介导的免疫力、配体介导的信号传导、细胞因子和 趋化因子介导的信号传导通路、信号转导、细胞外基质蛋白介导的信 号传导、生长因子内稳态、受体蛋白酪氨酸激酶信号传导通路、细胞 粘着介导的信号传导、细胞表面受体介导的信号转导、JAK-STAT级 联、抗氧化和自由基清除、内稳态、应激反应、血液凝固、发育过程、 中胚层发育、骨骼发育、血管发生、肌肉发育、肌收缩、蛋白质代谢 和修饰、蛋白质酶解、蛋白质折叠、蛋白复合体装配、氨基酸活化、 细胞内蛋白质转运、其他蛋白的靶向和定位、氨基酸代谢、蛋白质生 物合成、蛋白质二硫键异构酶反应、碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖 磷酸支路、其他多糖代谢、嘌呤代谢、磷酸盐代谢的调节、维生素代 谢、氨基酸生物合成、前体mRNA加工、翻译调控、mRNA剪接；或 者（iii）在提供包括如下任何一种或多种功能的功能时：信号传导分 子、趋化因子、生长因子、细胞因子、白细胞介素、其他细胞因子、 细胞外基质、细胞外基质结构蛋白、其他细胞外基质、细胞外基质糖 蛋白、蛋白酶、金属蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制剂、金属蛋白 酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原酶、脱氢酶、过氧化物酶、 伴侣蛋白、伴侣素、Hsp 70家族伴侣蛋白、其他伴侣蛋白、合成酶、 合酶和合成酶、选择性钙结合蛋白、氨酰tRNA合成酶、裂解酶、异 构酶、其他异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、其他裂解酶、其他 酶调节物、选择性调节分子、肌动蛋白结合细胞骨架蛋白、细胞骨架 蛋白、非马达肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白、膜 联蛋白、微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合马达蛋白、中间丝、 核糖核蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其他RNA结合蛋白、组蛋白、 钙调蛋白相关蛋白、囊泡外壳蛋白。

本发明人还描述了可通过上文示出的方法得到的永生化的间充质 干细胞。

本发明人还描述了可通过上文示出的方法得到的条件培养基。

本发明人还描述了可通过上文示出的方法得到的外核体。

本发明人还描述了可通过上文示出的方法得到的药物组合物。

本发明人还描述了用于递送条件培养基、外核体或药物组合物的 递送系统，包括如上文示出的条件培养基的源、如上文示出的外核体 的源或如上文示出的药物组合物的源，以及可进行递送所述条件培养 基、外核体或药物组合物至靶的操作的分配器。

本发明人还描述了如上文示出的递送系统在递送所述条件培养基、 外核体或药物组合物至靶的方法中的用途。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以包括心脏保 护活性。所述心脏保护活性可以在急性心肌梗塞（AMI）的小鼠模型 中测定。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以通过转化以 任何方式获得的间充质干细胞得到。作为所述转化的间充质干细胞来 源的所述间充质干细胞可以包括任何合适的间充质干细胞，例如来源 自胚胎干细胞、胎儿细胞（例如尸胎细胞）或任何其他合适组织源。 所述间充质干细胞可以获自或来源自胚胎干细胞系或胎儿细胞系。类 似地，所述转化的间充质干细胞可以从间充质干细胞系建立。

例如，所述间充质干细胞可以从例如WO2007/027157或 WO2007/027156中描述的胚胎干细胞或胚胎干细胞系建立。

所述间充质干细胞还可以从出生前细胞（例如妊娠头三月或中三 月的胎儿细胞）建立。所述胎儿细胞可以包括任何合适的年龄（例如 最高至2、4、8、16或24周）的细胞。所述胎儿细胞可以包括来自任 何组织的细胞，例如肢细胞、肾细胞或肝细胞。作为所述间充质干细 胞来源的所述出生前细胞可以包括在组织中。所述组织可以来自胎儿 尸体。所述间充质干细胞可以包括哺乳动物、灵长类或人间充质干细 胞。

所述方法还可以包括在无血清培养基中培养间充质干细胞。所述 无血清培养基可以包括诸如Knockout DMEM培养基的无血清培养基。 该培养基可以补充有10%血清替代培养基。该培养基可以补充有非必 需氨基酸。该培养基可以补充有10ng/ml FGF2。该培养基可以补充有 10ng/ml重组人EGF。该培养基可以补充有55μΜβ-巯基乙醇。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以使得所述转 化的间充质干细胞呈现一种或多种如下特征。所述转化的间充质干细 胞可以呈现间充质干细胞的一种或多种形态学特征。这类特征可以包 括汇合处的指纹螺环（fingerprint whorl）。这类特征可以包括形成具 有成纤维细胞表型的附着单层。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可能能够附着于 塑料。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以显示72至 96小时的平均群体倍增时间。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物 或细胞系可以呈现包括如下一个或多个（例如所有）物质表达的表面 抗原谱：CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD 105、CD 166、MHC I。 它可以呈现如下一个或多个物质表达减少或无表达：HLA-DR、CD34 和CD45。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以是 CD29+、CD44+、CD49a+、CD49e+、CD105+、CD166+、MHC I+、 CD34^-和CD45^-。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以呈现HESX1、 POUFL5、SOX-2、UTF-1和ZFP42中一个或多个（例如所有）的表 达减少。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以呈现 OCT4、NANOG和SOX2中一个或多个（例如所有）的表达减少。所 述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以呈现不可检测的碱 性磷酸酶活性。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以在细胞培养 时维持超过10、20、30、40或更多代。当在细胞培养时保持至少10 代时，所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以具有基本 稳定的核型或染色体数目。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或 细胞系可以使得其当移植至受体动物中时基本不诱导畸胎瘤形成。所 述受体动物可以包括免疫妥协的受体动物。所述时间期限可以是3周 后，例如2-9月后。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系 可以使得其当移植至SCID小鼠中时基本不产生畸形的。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以使得其对小 鼠特异性c-mos重复序列是阴性的，对人特异性alu重复序列是阳性 的。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可能能够发生骨 发生、脂肪发生或软骨发生，例如能够分化成骨细胞、脂肪细胞或软 骨细胞。所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系从一代至另 一代时可以具有基本稳定的基因表达模式。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以使得通过所 述方法获得的任何两种或多种（例如全部）转化的间充质干细胞呈现 基本相同的基因表达谱。其可以使得通过所述方法获得的转化间充质 干细胞的任何两种或多个分离物之间的基因表达相关系数大于0.9。其 可以使得通过所述方法获得的转化间充质干细胞的任何两个或多个 （例如全部）分离物互相基本相似或相同（例如同源的）。其可以使 得通过所述方法获得的转化间充质干细胞与亲本培养物的细胞之间的 基因表达相关系数大于0.8。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以包括哺乳动 物（例如小鼠或人）的转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系。

本发明人还提供了这样的条件培养基，其包含由如上文描述的转 化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系条件化的培养基。还提供了 由上文描述的转化的间充质干细胞分泌的颗粒，其包含转化的间充质 干细胞的至少一种生物学性质（例如转化的间充质干细胞条件培养基 （MSC-CM）的生物学活性，例如心脏保护作用）。这些在下文有进 一步详述。

本发明人还提供了上文示出的转化的间充质干细胞、细胞培养物、 细胞系、条件培养基或颗粒用于治疗疾病的方法中。

所述疾病可以选自：心脏衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤和退行性 疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、癌症、与蛋白聚集 或者细胞内或细胞外损害有关的疾病；亨丁顿舞蹈症和酒精性肝病。

所述疾病可以选自：心肌梗塞、皮肤伤口、皮肤科疾病、皮肤科 损害、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮肤癌、特应 性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以诱 导炎症和免疫失调（其导致慢性组织重塑，包括纤维化和功能丧失） 的初始损伤为特征的病理病症、肾局部缺血性损伤、囊性纤维化病、 鼻窦炎和鼻炎或矫形疾病。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或 颗粒可以用于协助伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移植或骨髓移植。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或 颗粒可以用于调节或辅助选自如下的一个或多个通路的通路：Rho GTP酶的细胞骨架调节、细胞周期、整联蛋白信号传递通路、由趋化 因子和细胞因子信号传导通路介导的炎症、FGF信号传导通路、EGF 受体信号传导通路、血管发生、血纤维蛋白溶酶原活化的级联、凝血、 糖酵解、泛素蛋白酶体通路、嘌呤的从头生物合成、TCA循环、苯丙 氨酸生物合成、血红素生物合成。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或 颗粒可以用于调节包括如下的任一个或多个过程的过程：细胞结构和 运动性、细胞结构、细胞通信、细胞运动性、细胞粘着、胞吞作用、 有丝分裂、胞吐作用、胞质分裂、细胞周期、免疫力和防御、细胞因 子/趋化因子介导的免疫力、巨噬细胞介导的免疫力、粒细胞介导的免 疫力、配体介导的信号传导、细胞因子和趋化因子介导的信号传导通 路、信号转导、细胞外基质蛋白介导的信号传导、生长因子内稳态、 受体蛋白酪氨酸激酶信号传导通路、细胞附着介导的信号传导、细胞 表面受体介导的信号转导、JAK-STAT级联、抗氧化作用和自由基除 去、内稳态、应激反应、血液凝固、发育过程、中胚层发育、骨骼发 育、血管发生、肌肉发育、肌收缩、蛋白质代谢和修饰、蛋白质酶解、 蛋白质折叠、蛋白复合体组装、氨基酸活化、细胞内蛋白质转运、其 他蛋白的靶向和定位、氨基酸代谢、蛋白质生物合成、蛋白质二硫键 异构酶反应、碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代 谢、嘌呤代谢、磷酸盐代谢的调节、维生素代谢、氨基酸生物合成、 前体mRNA加工、翻译调控、mRNA剪接。

所述转化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或 颗粒可以用于提供包括如下一种或多种功能的功能：信号传导分子、 趋化因子、生长因子、细胞因子、白细胞介素、其他细胞因子、细胞 外基质、细胞外基质结构蛋白、其他细胞外基质、细胞外基质糖蛋白、 蛋白酶、金属蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制 剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原酶、脱氢酶、过氧化物酶、伴侣 蛋白、伴侣素、Hsp 70家族伴侣蛋白、其他伴侣蛋白、合成酶、合酶 和合成酶、选择性钙结合蛋白、氨酰-tRNA合成酶、裂解酶、异构酶、 其他异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、其他裂解酶、其他酶调节 物、选择性调节分子、肌动蛋白结合细胞骨架蛋白、细胞骨架蛋白、 非马达肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白、膜联蛋白、 微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合马达蛋白、中间丝、核糖核 蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其他RNA结合蛋白、组蛋白、钙调 蛋白相关蛋白、囊泡外壳蛋白。

还提供了用于递送条件培养基或颗粒的递送系统，包含上文描述 的条件培养基或颗粒的源和能够进行将所述条件培养基或颗粒递送至 靶的操作的分配器。

本发明人还提供了这类递送系统在递送条件培养基或颗粒至靶的 方法中的用途。

还提供了一种获得分化的间充质细胞的方法，所述方法包括提供 上文描述的转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系，并使所述转 化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞系分化成骨细胞、脂肪细胞或 软骨细胞。

本发明人还提供了通过这类方法获得系分化的间充质细胞。

还提供了一种药物组合物，包含上文示出的转化的间充质干细胞、 细胞培养物、细胞系、条件培养基或颗粒或者所述的条件培养基和可 药用赋形剂或载体。

本发明人还提供了一种条件化细胞培养基的方法，所述方法包括 在细胞培养基中培养所述的转化的间充质干细胞、细胞培养物或细胞 系，并任选地分离所述细胞培养基。

本发明人还提供了一种治疗疾病的方法，包括获得上文示出的转 化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或颗粒，并将 所述转化的间充质干细胞、细胞培养物、细胞系、条件培养基或颗粒 给予患者。

所述疾病可以选自上文列出的疾病。

获得转化的间充质干细胞

转化的间充质干细胞可以使用本文描述的方法和组合物从间充质 干细胞获得或来源于其，例如通过基因工程。所述基因工程可以包括 以合适的转化剂（例如癌基因）转化。

因此，本发明人描述了通过以包含至少一种转化基因的载体转染 间充质干细胞而使这类细胞系永生化或转化这类细胞系的方法。

转化基因的实例包括：（1）核癌基因例如v-myc、N-myc、T抗 原和尤因肉瘤癌基因（Fredericksen et al.（1988）Neuron 1:439-448; Bartlett,P.et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3255-3259,和 Snyder,E.Y.et al.（1992）Cell 68:33-51）、（2）细胞质癌基因例如 bcr-abl和神经纤维瘤蛋白（Solomon,E.et al.（1991）Science 254:1 153-1160）、（3）膜癌基因例如neu和ret（Aaronson,A.S.A.（1991） Science 254:1 153-1161）、（4）肿瘤抑制基因例如突变体p53和突 变体Rb（视网膜母细胞瘤）（Weinberg,R.A.（1991）Science 254:1 138-1146）和（5）其他转化基因例如Notch显性负相（Coffman,C.R. et al.（1993）Cell 23:659-671）。癌基因的实例包括v-myc和所述SV40 T抗原。

转化基因还可以包括端粒末端转移酶基因（Tert）以及癌基因例 如Akt、ras、EGF受体等。

外源（异源）核酸（例如编码转化基因的核酸）可以被引入或转 染至间充质干细胞。携带外源DNA的间充质干细胞称为基因工程细胞。 所述外源DNA可以使用多种技术引入。在一个实施方案中，外源DNA （包括编码转化基因的DNA）可以使用逆转录病毒转染技术引入间充 质干细胞。携带目的基因的重组逆转录病毒可以用于引入标记基因， 例如大肠杆菌β-半乳糖苷酶（lacZ）基因或癌基因。所述重组逆转录 病毒可以在包装细胞系中产生，以产生具有高病毒颗粒滴度（通常10⁵至10⁶pfu/ml）的培养物上清。通过将所述间充质干细胞的培养物与包 含病毒颗粒和8μg/ml聚凝胺（polybrene）的培养物孵育3小时，所 述重组病毒颗粒可用于感染所述细胞培养物。在逆转录病毒感染后， 将所述细胞冲洗并在标准培养基中培养。然后，分析所述感染的细胞 对所述外源DNA的摄取和表达。可以将所述细胞用选择性条件处理， 所述条件可选择已经吸收和表达可选择标记基因的细胞。

在另一实施方案中，所述外源DNA可以使用磷酸钙介导的转染技 术引入。包含编码目的基因（例如转化基因）的DNA的磷酸钙沉淀物 可使用Wigler et al.（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373-1376 的技术制备。所述间充质干细胞的培养物可在组织培养皿中建立。在 铺板所述细胞24小时后，加入包含大约20μg/ml所述外源DNA的 磷酸钙沉淀物。将所述细胞在室温下孵育20分钟。加入包含30μΜ氯 喹的组织培养基，并将所述细胞在37℃下孵育过夜。在转染后，分析 所述细胞对所述外源DNA的摄取和表达。可以将所述细胞用选择性条 件处理，所述条件可选择已经吸收和表达可选择标记基因的细胞。

本文使用的术语“非转化的细胞”是指这样的细胞，即所述细胞 能够在体外生长而无需通过以下方式使所述细胞永生化：引入包含癌 基因的病毒或病毒基因组的一部分，其能够因为在所述转化的细胞内 表达而病毒基因赋予所述细胞改变的生长性质。这些病毒基因一般已 经借助病毒感染或借助以包含分离的病毒基因的DNA载体转染而被 引入细胞。

本文使用的术语“基因工程细胞”是指已引入外源（即非天然出 现的）核酸（例如DNA）的细胞。所述外源核酸可以通过多种技术引 入，所述技术包括但不限于磷酸钙介导的转染、DEAE介导的转染、 微注射、逆转录病毒转化、原生质体融合和脂质转染。所述基因工程 细胞可能以短暂或长期的方式表达外源核酸。通常，短暂表达是在外 源DNA未稳定整合至所转染细胞的染色体DNA中时发生。相反，外 源DNA的长期表达是在所述外源DNA已经被稳定地整合至所转染细 胞的染色体DNA中时发生。

本文使用的“永生化的细胞”或“转化的细胞”是指由于如下原 因能够在培养时无限生长的细胞：引入永生化基因”或“转化基因”， 所述基因能够通过在所述基因工程细胞内表达所述永生化基因或转化 基因而赋予所述细胞改变的生长性质。永生化基因和转化基因可以借 助病毒感染或者借助以包含编码一个或多个癌基因的分离病毒核酸的 载体进行的转染而被引入细胞。选择这样的病毒或病毒癌基因，即其 使得细胞永生化，但优选不转化细胞。永生化的细胞可以使得它们在 培养时无限生长，但当被引入动物中时不引起肿瘤。

本文使用的术语“转化的细胞”是指具有转化基因引入其中并具 有在培养时无限生长的能力的细胞。“转化”是指产生转化的细胞。

转化的间充质干细胞培养物和细胞系

明显的是，通过本文描述的方法获得的这类转化间充质干细胞可 以作为细胞的形式得以维持或者发育成细胞培养物或细胞系。

因此，在本文件中并且如果合适，术语“转化的间充质干细胞” 应被认为还包括提及相应的细胞培养物，即转化的间充质干细胞培养 物；或相应的细胞系，即转化的间充质干细胞系。通常，所述转化的 间充质干细胞、细胞培养物或细胞系可以以相同或相似条件被保持培 养和上文描述的培养基中用于衍生。

转化的间充质干细胞条件培养基

本发明人还提供了被所述转化的间充质干细胞的培养物条件化的 培养基。这类条件培养基在本文中被称为“转化的间充质干细胞条件 培养基”，并且在下文进一步详述。

这类条件培养基可以包括由所述转化的间充质干细胞分泌、排泄、 释放或产生的分子。所述条件培养基可以包括所述转化的间充质干细 胞的一种或多种分子，例如多肽、核酸、碳水化合物或者其他复杂或 简单分子。所述条件培养基还可以包括所述转化的间充质干细胞的一 种或多种活性。所述条件培养基可以用于代替所述转化的间充质干细 胞本身，与所述转化的间充质干细胞本身一起加入，或者补充所述转 化的间充质干细胞本身。因此，对于任何转化的间充质干细胞适合用 于其中的目的，条件化的培养基可以类似地用于该目的。

这类条件培养基和其中包含的任何分子的组合（包括特别是蛋白 或多肽）可以用于补充所述转化的间充质干细胞的活性或代替所述转 化的间充质干细胞，用于例如治疗或预防疾病的目的。因此，如果陈 述了通过本文描述的方法获得的转化的间充质干细胞可以用于具体目 的，很明显，这类转化的间充质干细胞的条件化的培养基可以同样地 用于该目的。

条件培养基可以通过任何合适的方法制备。例如，它可以通过在 培养基（例如细胞培养基）中培养转化的间充质干细胞一段预定的时 长制备。可以使用任意数目的制备条件培养基的方法，包括下文列出 的“条件培养基制备方案”。

所述转化的间充质干细胞可以特别地包括由本文描述的任意方法 产生的那些。所述条件培养基将包含由所述转化的间充质干细胞分泌 的多肽，如实施例中所述。

产生条件培养基的方案的一个非限制性的具体实例如下。

用于从转化的间充质干细胞制备条件培养基的示例性方案可以包 括“条件培养基制备方案”，其如下所述：

转化的间充质干细胞条件化的培养基制备方案

如上文和实施例以及参考文献25中所述，所述分泌可以通过在化 学成分确定的无血清培养基中培养所述转化的MSC三天而制备。可以 将80%汇合的培养物以PBS洗涤三次，然后在由添加1X胰岛素-转 铁蛋白-含硒蛋白（Insulin-Transferrin-Selenoprotein）,10ng/ml重组 人FGF2、10ng/ml重组人EGF、1x谷氨酰胺-青霉素-链霉素和55μΜ β-巯基乙醇的无酚磺酞的DMEM培养基组成的化学成分确定培养基 中培养过夜。然后可以将所述培养物以PBS洗涤三次，之后可以加入 新鲜的化学成分确定培养基。所有培养基组分可以获自Invitrogen。可 以将所述培养物在该培养基中维持三天。然后，可以将该条件培养基 （CM）收集，通过离心使之澄清，使用截留分子量100kDa的正切流 动过滤（Satorius,Goettingen,Germany）浓缩50倍，并且通过过滤 通过220nm滤器灭菌。

所述条件培养基可以直接或者在一个或多个处理步骤后用于治疗。 例如，可以将所述条件培养基进行UV处理、滤器灭菌等。可以使用 一个或多个纯化步骤。具体而言，可以将所述条件培养基浓缩，例如 通过透析或超滤。例如，可以将所述培养基使用具有例如3K的标称分 子量限值（NMWL）的膜超滤浓缩。

对于本文描述的目的，例如治疗或预防疾病，可以将包含15-750 mg蛋白质/100kg体重的条件培养基剂量给予需要这类治疗的患者。

转化的间充质干细胞颗粒

本发明人描述了可来源自转化的间充质干细胞（MSC）的颗粒。 这类颗粒在本文中称为“转化的间充质干细胞颗粒”。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以通过数种方式中的任一种获自 所述转化的MSC，例如通过从所述转化的MSC分泌、出芽或扩散。 例如，所述转化的间充质干细胞颗粒可以从所述转化的MSC产生、渗 出、发出或脱落。如果所述转化的MSC在细胞培养时，那么所述转化 的间充质干细胞颗粒可以分泌至所述细胞培养基中。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以特别包含囊泡。所述转化的间 充质干细胞颗粒可以包括外核体。本文描述的转化的间充质干细胞颗 粒可以包含本文描述的外核体的任一种或多种性质。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括脂双层围成的囊泡或扁平 球。所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括40-100nm的直径。所述 转化的间充质干细胞颗粒可以通过内体膜向内出芽而形成。所述转化 的间充质干细胞颗粒可以具有约1.13-1.19g/ml的密度，可以悬浮于 蔗糖梯度上。所述转化的间充质干细胞颗粒可以富含胆固醇和鞘磷脂 以及脂质筏标记物，例如GM1、GM3、flotillin和所述src蛋白激酶 Lyn。所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括在转化的间充质干细胞或 转化的间充质干细胞条件培养基（转化的MSC-CM）中存在的一种或 多种蛋白，例如所述转化的MSC或转化的MSC-CM的特征性或特异 性的蛋白。它们可以包含RNA，例如miRNA。

本发明人提供了转化的间充质干细胞颗粒，其包含在转化的MSC 或由转化的MSC培养物条件化的培养基中存在的一个或多个基因或 基因产物。所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括由所述转化的MSC 分泌的分子。这类转化的间充质干细胞颗粒和其中包含的任何分子的 组合（包括特别是蛋白或多肽）可以用于补充所述转化的MSC或由所 述转化的MSC的培养物条件化的培养基的活性，或者代替所述转化的 MSC或由所述转化的MSC的培养物条件化的培养基，目的是例如治 疗或预防疾病。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括细胞骨架中存在的细胞溶 质蛋白，例如微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白；细胞内膜融 合物和转运物，例如整联蛋白和rab蛋白；信号转导蛋白，例如蛋白 激酶、14-3-3和异源三聚体G蛋白；代谢酶，例如过氧化物酶、丙酮 酸盐和脂质激酶；以及烯醇酶-1和四次跨膜蛋白家族，例如CD9、CD63、 CD81和CD82。特别地，所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括一种 或多种四次跨膜蛋白。所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括mRNA 和/或microRNA。

本文使用的术语“颗粒”可以被认为是指独立的实体。所述颗粒 可以是能从转化的间充质干细胞（转化的MSC）或转化的间充质干细 胞条件培养基（转化的MSC-CM）分离的物质。所述转化的间充质干 细胞颗粒可以负责所述转化的MSC或转化的MSC-CM的至少一种活 性。所述转化的间充质干细胞颗粒可以负责并实现所述转化的MSC或 转化的MSC-CM的基本大部分或全部功能。例如，所述转化的间充质 干细胞颗粒可以是所述转化的MSC或转化的MSC-CM的替代物（或 生物替代物）。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以用于所述转化的MSC或转化 的MSC-CM可以投入使用的任意治疗目的。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括转化的间充质干细胞的至 少一种性质。所述转化的间充质干细胞颗粒可以具有生物学性质，例 如生物学活性。所述转化的间充质干细胞颗粒可以具有转化的MSC的 任何生物学活性。例如，所述转化的间充质干细胞颗粒可以具有转化 的MSC的治疗或滋补活性。所述生物学活性可以包括心脏保护作用。 所述转化的间充质干细胞颗粒可能能够减少梗塞面积。梗塞减少可以 在小鼠或猪的心肌缺血和再灌注损伤模型中测定。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以能够减少氧化应激。氧化应激 的减少可以在过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞死亡的体外测定法中测定。

所述转化的间充质干细胞颗粒可包含囊泡。所述转化的间充质干 细胞颗粒可以包括外核体。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以在间充质干细胞条件培养基 （MSC-CM）或转化的间充质干细胞条件培养基（转化的MSC-CM） 中包含至少70%的蛋白。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括分子量>100kDa的复合体。 所述分子量>100kDa的复合体可以包括<100kDa的蛋白。所述颗粒 可以包括分子量>300kDa的复合体。所述分子量>300kDa的复合体 可以包括<300kDa的蛋白。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括分子量>1000kDa的复合 体。所述颗粒可以具有2nm至200nm的大小。所述转化的间充质干 细胞颗粒可以具有50ηm至150nm的大小。所述转化的间充质干细 胞颗粒可以具有50nm至100nm的大小。

所述转化的间充质干细胞颗粒的大小可以通过以0.2μΜ滤器过滤 并以10kDa的截留分子量的膜浓缩而确定。所述转化的间充质干细胞 颗粒的大小可以通过电子显微镜确定。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括小于100nm的流体力学 半径。它可以包括约30nm至约70nm的流体力学半径。其可以是约 40nm至约60nm，例如约45nm至约55nm。所述转化的间充质干细 胞颗粒可以包括约50nm的流体力学半径。所述流体力学半径可以通 过激光衍射或动态光散射确定。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括选自如下的脂质：磷脂、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂（shingomyelin）、 神经酰胺、糖脂、脑苷脂、类固醇、胆固醇。所述胆固醇磷脂比率可 以大于0.3-0.4（mol/mol）。所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括脂 质筏。

所述转化的间充质干细胞颗粒在非离子型去污剂（例如 Triton-X100）中可以是不溶的。当将所述转化的间充质干细胞颗粒以 非离子型去污剂处理时，所述转化的间充质干细胞颗粒可以使得具有 指定分子量的蛋白质基本保留在具有指定分子量的复合体中。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以对环糊精（例如20mM环糊精） 敏感。所述转化的间充质干细胞颗粒可以使得以环糊精进行的处理导 致所指定的复合物大量溶解。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括核糖核酸（RNA）。所述 颗粒可以具有1.9的吸光度比值（260:280nm）。所述转化的间充质干 细胞颗粒可以包括选自如下的表面抗原：CD9、CD109和thy-1。

本发明人还描述了一种产生如上所述转化的间充质干细胞颗粒的 方法，所述方法包括从转化的间充质干细胞条件培养基（MSC-CM） 分离所述转化的间充质干细胞颗粒。

所述方法可以包括基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性 从其他组分分离所述转化的间充质干细胞颗粒。

所述重量可以选自上文示出的重量。所述大小可以选自上文示出 的大小。所述组成可以选自上文示出的组成。所述生物学活性可以选 自上文示出的生物活性。

本发明人还描述了一种产生上文所述转化的间充质干细胞颗粒的 方法。所述方法可以包括获得转化的间充质干细胞条件培养基 （MSC-CM）。它可以包括浓缩所述转化的间充质干细胞条件培养基。 所述转化的间充质干细胞条件培养基还可以通过在>1000kDa膜上超 滤而浓缩。所述方法可以包括对所浓缩的转化的间充质干细胞条件培 养基进行分子排阻色谱。可以使用TSK Guard柱SWXL、6x40mm 或TSK凝胶G4000SWXL、7.8x300mm柱。所述方法可以包括选择 呈现动态光散射的UV吸收级分，例如在220nm下。所述动态光散射 可以通过准弹性光散射（QELS）检测器检测。所述方法可以包括收集 以11-13分钟（例如12分钟）的保留时间洗脱的级分。

本发明人还提供了一种药物组合物，包含所述的转化的间充质干 细胞颗粒和可药用赋形剂、稀释剂或载体。

本发明人还提供了这类转化的间充质干细胞颗粒或这类药物组合 物，用于治疗疾病的方法中。

本发明人还提供了这类转化的间充质干细胞颗粒用于制备治疗疾 病的药物组合物的用途。

本发明人还提供了这类转化的间充质干细胞颗粒用于治疗个体中 疾病的方法中的用途。

所述疾病可以选自：心脏衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤和退化性 疾病例如糖尿病、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和癌症。

所述疾病可以选自：心肌梗塞、皮肤伤口、皮肤科疾病、皮肤科 损害、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮肤癌、特应 性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以诱 导炎症和免疫功能失调（其导致慢性组织重塑，包括纤维化和功能丧 失）的初始损伤为特征的病理病症、肾局部缺血性损伤、囊性纤维化 病、鼻窦炎和鼻炎或矫形疾病。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以用于在个体中协助伤口愈合、 瘢痕减少、骨形成、骨移植或骨髓移植。

所述转化的间充质干细胞颗粒可以用于（i）调节选自如下的任何 一个或多个通路的通路：Rho GTP酶的细胞骨架调节、细胞周期、整 联蛋白信号传递通路、由趋化因子和细胞因子信号传导通路介导的炎 症、FGF信号传导通路、EGF受体信号传导通路、血管发生、血纤维 蛋白溶酶原活化的级联、凝血、醣酵解、泛素蛋白酶体通路、嘌呤的 从头生物合成、TCA循环、苯丙氨酸生物合成、血红素生物合成；（ii） 调节包括如下的任一个或多个过程的过程：细胞结构和运动性、细胞 结构、细胞通信、细胞运动性、细胞粘着、胞吞作用、有丝分裂、胞 吐作用、胞质分裂、细胞周期、免疫力和防御、细胞因子/趋化因子介 导的免疫力、巨噬细胞介导的免疫力、粒细胞介导的免疫力、配体介 导的信号传导、细胞因子和趋化因子介导的信号传导通路、信号转导、 细胞外基质蛋白介导的信号传导、生长因子内稳态、受体蛋白酪氨酸 激酶信号传导通路、细胞附着介导的信号传导、细胞表面受体介导的 信号转导、JAK-STAT级联、抗氧化作用和自由基除去、内稳态、应 激反应、血液凝固、发育过程、中胚层发育、骨骼发育、血管发生、 肌肉发育、肌收缩、蛋白质代谢和修饰、蛋白质酶解、蛋白质折叠、 蛋白复合体组装、氨基酸活化、细胞内蛋白质转运、其他蛋白的靶向 和定位、氨基酸代谢、蛋白质生物合成、蛋白质二硫键异构酶反应、 碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代谢、嘌呤代谢、 磷酸盐代谢的调节、维生素代谢、氨基酸生物合成、前体mRNA加工、 翻译调控、mRNA剪接；或者（iii）提供包括如下任何一种或多种功 能的功能：信号传导分子、趋化因子、生长因子、细胞因子、白细胞 介素、其他细胞因子、细胞外基质、细胞外基质结构蛋白、其他细胞 外基质、细胞外基质糖蛋白、蛋白酶、金属蛋白酶、其他蛋白酶、蛋 白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原酶、 脱氢酶、过氧化物酶、伴侣蛋白、伴侣素、Hsp 70家族伴侣蛋白、其 他伴侣蛋白、合成酶、合酶和合成酶、选择性钙结合蛋白、氨酰tRNA 合成酶、裂解酶、异构酶、其他异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、 其他裂解酶、其他酶调节物、选择性调节分子、肌动蛋白结合细胞骨 架蛋白、细胞骨架蛋白、非马达肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动 蛋白相关蛋白、膜联蛋白、微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合 马达蛋白、中间丝、核糖核蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其他RNA 结合蛋白、组蛋白、钙调蛋白相关蛋白、囊泡外壳蛋白。

本发明人还提供了用于递送转化的间充质干细胞颗粒的递送系统， 包括转化的间充质干细胞颗粒的源和能够进行将所述颗粒送递至靶的 操作的分配器。

本发明人还提供了这类递送系统在递送颗粒至靶的方法中的用途。

所述转化的间充质干细胞可以通过直径约50-100nm的所分泌的 大复合体介导心脏保护作用。这类复合体或颗粒因此还可以代替所述 细胞本身用于治疗方法，包括用于心脏保护作用。

所述转化的间充质干细胞颗粒、复合体或外核体可以用于多种目 的，例如治疗或预防心脏疾病或心脏病，例如缺血、心脏炎症或心力 衰竭。它们还可以用于修复如下灌注损伤。

被转化的MSC条件化的培养基（例如转化的间充质干细胞条件培 养基或转化的MSC-CM，如下文所述）可以包括转化的MSC的生物 学活性，能够替代所述转化的MSC本身。转化的MSC的生物学性质 或生物学活性因此可以对应于转化的间充质干细胞条件培养基的生物 学性质或活性。因此，所述转化的间充质干细胞颗粒可以包括转化的 间充质干细胞条件培养基（转化的MSC-CM）的一种或多种生物学性 质或活性。

所述条件细胞培养基（例如转化的间充质干细胞条件培养基（转 化的MSC-CM））可以通过以下方式得到：在细胞培养基中培养转化 的间充质干细胞（转化的MSC）、其后代或源自其的细胞系；分离所 述细胞培养基。所述转化的间充质干细胞可以通过以下方法产生：所 述方法包括通过分散胚胎干（ES）细胞集落获得细胞。所述细胞或其 后代在包含FGF2的无血清培养基中在无共培养物的情况下繁殖。其 他详情在本文他处提供。

分离转化的间充质干细胞颗粒

所述转化的MSC颗粒可以以多种方式产生或分离。这类方法可以 包括将所述颗粒从转化的间充质干细胞（转化的MSG）中分离。这类 方法可以包括将所述转化的MSC颗粒从转化的间充质干细胞条件培 养基（转化的MSC-CM）分离。

所述转化的MSC颗粒可以例如通过以下方式分离：基于所述转化 的MSC颗粒的任何性质与无关组分分开。例如，所述转化的MSC颗 粒可以基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性分离。

所述条件培养基可以在分离过程之中、之前或之后过滤和/或浓缩。 例如，它可以被过滤通过膜，例如具有一个大小或分子量截留的膜。 还可以对其进行正切力过滤或超滤。

例如，可以使用以具有合适分子量或大小截留的膜进行的过滤， 如本文他处的分子量测定法中所述。

可以对所述条件培养基（任选地经过滤和/或浓缩）进行进一步分 离方法，例如柱色谱法。例如，可以使用具有不同柱的高效液相色谱 （HPLC）。所述柱可以是尺寸排阻柱或结合柱。

所述转化的MSC颗粒的一种或多种性质或生物学活性可以用于 在对所述转化的间充质干细胞条件培养基（转化的MSC-CM）的分级 分离过程中示踪其活性。例如，光散射、折射率、动态光散射或UV 可见检测器可用于跟踪所述转化的MSC颗粒。例如，治疗活性（例如 心脏保护活性）可以用于在分级分离过程中示踪所述活性。

下一段将提供可以如何获得转化的MSC间充质干细胞颗粒（例如 外核体）的具体实例。

转化的间充质干细胞颗粒可以通过在培养基中培养转化的间充质 干细胞以条件化它而产生；所述转化的间充质干细胞可以包括转化的 HuES9.E1细胞。所述培养基可以包含DMEM。所述DMEM可以使 得其不包含酚磺酞。所述培养基可以补加胰岛素、转铁蛋白或含硒蛋 白质（ITS）或它们的任意组合。它可以包括FGF2。它可以包括PDGF AB。FGF2的浓度可以是约5ng/ml FGF2。PDGF AB的浓度可以是 约5ng/ml。所述培养基可以包括谷氨酰胺-青霉素-链霉素或β-巯基乙 醇或它们的任意组合。

所述细胞可以培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多 天，例如3天。所述条件培养基可以通过将所述细胞从所述培养基分 离中而得到。可以将所述条件培养基离心，例如在500g下。可以通过 过滤通过膜将它浓缩。所述膜可以包括>1000kDa膜。所述条件培养 基可以浓缩约50倍或更多。

可以对所述条件培养基进行液相色谱，例如HPLC。所述条件培 养基可以通过尺寸排阻分离。可以使用任何尺寸排阻基质例如 Sapharose。例如，可以使用TSK Guard柱SWXL,6x40mm或TSK 凝胶G4000SWXL,7.8x300mm。所述洗脱缓冲液可以包括任何生理 培养基例如盐水。它可以包括20mM磷酸盐缓冲液，其含150mM的 NaCl，pH 7.2。可以将所述色谱系统以0.5ml/分钟的流速平衡。洗脱 模式可以是等强度。220nm下的UV吸光度可以用于示踪所述洗脱过 程。可以使用准弹性光散射（QELS）检测器对检查级分的动态光散射 （DLS）。

可以将被观察到呈现动态光散射的级分留下。例如，通过如上述 的一般方法产生且以保留时间11-13分钟（例如12分钟）洗脱的级分 被观察到呈现动态光散射。该峰值中所述颗粒的r_h为约55-65nm。这 类级分包含转化的MSC间充质干细胞颗粒，例如外核体。

递送转化的MSC颗粒

可以通过任何合适的途径将本文所述转化的MSC颗粒送递至人 或动物体内。

因此，本发明人描述了用于递送本文所述转化的MSC颗粒至靶细 胞、组织、器官、动物体或人体的递送系统，和用于使用所述递送系 统来递送转化的MSC颗粒至靶的方法。

所述递送系统可以包括转化的MSC颗粒的源，例如包含所述转化 的MSC颗粒的容器。所述递送系统可以包括用于分配所述转化的MSC 颗粒至靶的分配器。

因此，本发明人提供了用于递送转化的MSC颗粒的递送系统，包 含本文所述的转化的MSC颗粒的源和能进行将所述转化的MSC颗粒 送递至靶的操作的分配器。

本发明人还提供了这类递送系统在递送转化的MSC颗粒至靶的 方法中的用途。

用于递送流体至身体的递送系统是本领域中已知的，包括注射、 外科滴注、导管（包括灌注导管），例如美国专利6,139,524中描述的 导管，例如药物送递导管（例如美国专利7,122,019中所述的药物送递 导管。

向肺或鼻道中的递送（包括鼻内递送）可以使用例如本领域中已 知的鼻腔喷雾、吹入器、吸入器等实现（例如美国设计专利D544,957 中所示）。

向肾中的递送可以使用主动脉内肾递送导管实现，例如美国专利 7,241,273中描述的那些。

明显的是，具体的递送应可构造成以合适的间隔递送所需量的转 化的MSC颗粒，目的是实现最佳治疗。

所述转化的MSC颗粒可以用于例如治疗或预防动脉粥样硬化。在 本文中，转化的MSC颗粒的灌注可以在静脉内进行，以稳定动脉粥样 硬化斑块或减少斑块中的炎症。所述转化的MSC颗粒可以用于通过静 脉灌注治疗或预防感染性休克。

所述转化的MSC颗粒可用于治疗或预防心力衰竭。这可以通过以 下方式实现：转化的MSC颗粒的慢性冠状动脉内或心肌内灌注以延缓 重塑或延缓心力衰竭。所述转化的MSC颗粒可以用于通过鼻内递送治 疗或预防肺部炎症。

所述转化的MSC颗粒可以用于治疗或预防皮肤科疾病例如银屑 病。转化的MSC颗粒的长期递送可以使用经皮微注射针施用，直至所 述病症消退。

明显的是，所述递送方法将依赖于待被给予所述转化的MSC颗粒 的具体器官，本领域技术人员将能够确定因此采用何种方式。

例如，在心脏炎症的治疗中，所述转化的MSC颗粒可以例如被通 过以下方式递送至心脏组织（即心肌膜、心包膜或心内膜）：通过透 过胸壁的直接冠状动脉内注射，或者使用基于标准经皮导管的方法在 透视导向下用于直接注射至组织（例如心肌膜）内或从植入体腔内的 支架或导管浸出抑制剂。

任何的多种冠状动脉导管或灌流导管可用于给予所述转化的 MSC颗粒。或者，所述转化的MSC颗粒可以被涂敷或浸渍在置于冠 状血管中的支架上。

获得间充质干细胞（MSC）

本文所述的转化的间充质干细胞可以从间充质干细胞分离或制备。 适合在产生转化的间充质干细胞中使用的间充质干细胞可以通过本领 域中已知的任何方法制备。

具体而言，MSC可以通过在包含FGF2的无血清培养基在不存在 共培养物的情况下增殖细胞而制备，所述细胞是通过分散胚胎干（ES） 细胞集落或其后代获得的。还例如，间充质干细胞可以来自于出生前 组织。所述出生前组织（例如胎儿组织）可以经过处理，例如通过剥 离、切碎或清洗或者它们的任意组合处理。

它们中的每一种在下文段中有更详细的描述。

来自胚胎干细胞源的间充质干细胞

从hESC获得间充质干细胞（MSC）或MSC样细胞的现有技术 方法涉及将人端粒末端转移酶逆转录酶（hTERT）基因转染至分化的 hESC（Xu et al.，2004）或与小鼠OP9细胞系共培养（Barberi et al.， 2005）。在这些衍生方案中使用外源遗传物质和小鼠细胞可引入致肿 瘤性或异生物质（xenozootic）传染剂传染的不可接受风险。

所述间充质干细胞可以通过使用临床相关且可重复方案从分化的 hESC中分离相似或相同（例如同源）MSC群来获得。通常，所述方 法包括将胚胎干（ES）细胞集落分散为细胞。然后，将所述细胞铺板 并繁殖。将所述细胞在含有成纤维细胞生长因子2（FGF2）的无血清 培养基中在不存在共培养物的情况下繁殖，目的是获得间充质干细胞 （MSC）。

因此，所述方案不需要血清、使用小鼠细胞或基因操作，并且需 要较少操作和时间，因此是可高度扩大的。所述方案可以用于从两个 不同的hESC系HuES9和H-1以及第3个Hes-3中分离MSC。通过 本文所述方法和组合物获得的来源自人ES的MSC（hESC-MSC）与 来源自骨髓的MSC（BM-MSC）非常相似。

所述胚胎干细胞培养物可以包括人胚胎干细胞（hESC）培养物。

在一个实施方案中，生成间充质干细胞（MSC）的方法包括在补 加FGF2和任选的PDGF AB的培养基中在无饲养层支持的情况下用胰 蛋白酶消化并增殖hESC，然后分选CD105+CD24-细胞。

所述方法可以包括在补加FGF2和任选的PDGF AB的培养基中无 饲养层繁殖后一周从胰蛋白酶消化的hESC中分选CD105+、CD24-细 胞，以生成这样的hESC-MSC细胞培养物，即其中至少一部分（例 如基本全部或全部）细胞彼此相似或相同（例如同源）。

以该方法产生的MSC可用于产生间充质干细胞条件培养基 （MSC-CM），从中可分离。

解聚胚胎干细胞集落

一种产生间充质干细胞的方法可以包括将胚胎干细胞集落分散或 解聚成细胞。

所述胚胎干细胞集落可以包括huES9集落（Cowan CA, Klimanskaya I,McMahon J,Atienza J,Witmyer J,et al.(2004)Deri- vation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.N Engl J  Med 350:1353-1356）或HI ESC集落（Thomson JA,Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS,Waknitz MA,Swiergiel JJ,et al.(1998)Embryonic Stem  Cell Lines Derived from Human Blastocysts.Science 282:1145-1147）。

集落中的细胞可以解聚或分散至相当大的程度，即至少成团。集 落可以解聚或分散至集落中所有细胞为单个的形式，即集落完全解聚。

解聚可以以分散剂实现。

分散剂可以为能够使集落中至少一些胚胎干细胞彼此分开的任何 物质。分散剂可以包括可破坏集落中细胞之间或细胞并且/或者底物之 间之间粘着的试剂。分散剂可以包括蛋白酶。

分散剂可以包括胰蛋白酶。以胰蛋白酶进行的处理可以在摄氏37 度下持续例如约3分钟。然后，可以将所述细胞中和、离心并再悬浮 于培养基中，然后铺板。

所述方法可以包括以胰蛋白酶分散人胚胎干细胞的汇合平板，然 后将所述细胞铺板。

解聚可以包括如下步骤顺序中的至少一些：抽吸、冲洗、胰蛋白 酶消化、孵育、取出、猝灭、再接种和取等分试样。如下的方案可以 改编自Hedrick Lab,UC San Diego （http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html）。

在抽吸步骤中，将所述培养基吸出或轻轻从容器（例如烧瓶）中 除去。在冲洗步骤中，将所述细胞以一个体积（例如5-10ml）的经缓 冲的培养基冲洗，所述经缓冲的培养基可以不含Ca²⁺和Mg²⁺。例如， 可以将所述细胞以无钙和镁的PBS冲洗。在胰蛋白酶消化步骤中，将 一个量的溶于缓冲剂中的分散剂加入容器中，并将所述容器翻滚以用 所述分散剂溶液包被所述生长表面。例如，可以将1ml溶解于Hank′s BSS中的胰蛋白酶加入烧瓶中。

在孵育步骤中，将所述细胞在维持温度下放置一段时间。例如， 可以将所述细胞在37℃下放置数分钟（例如2至5分钟）。在取出步 骤中，可用将所述细胞通过机械作用取出，例如通过刮除或通过以手 敲打所述容器的一侧。所述细胞应以片状物形式脱离并从所述表面滑 落。

在猝灭步骤中，将一个体积的培养基加入烧瓶中。所述培养基可 以包含中和剂以终止所述分散剂的作用。例如，如果所述分散剂是蛋 白酶例如胰蛋白酶,所述培养基可以包含蛋白例如血清蛋白，其将清除 所述蛋白酶的活性。在一个具体实例中，将3ml含有血清的细胞培养 基加入烧瓶中以补足至共4ml。可以以吸量管吸所述细胞以取出或分 散所述细胞。

在再接种步骤中，将所述细胞再接种至新鲜培养容器且加入新鲜 培养基。许多再接种可以以不同的平分比（split ratio）进行。例如， 所述细胞可以以1/15稀释度和1/5稀释度接种。在一个具体实例中， 可以通过以下方式再接种所述细胞：将1滴细胞加入25cm²烧瓶并将 3滴加入另一烧瓶以再接种所述培养物，然后将7-8ml培养基加入每 个烧瓶以从例如75cm²烧瓶中得到1/15稀释度和1/5稀释度。在取等 分试样的步骤中，可以将所述细胞取等分试样至新皿中，或者至所需 平分比，并加入培养基。

在具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：首先以非粘着的 方式将人ES细胞悬浮培养，以形成胚状体（EB）。然后对5-10日龄 EB进行胰蛋白酶消化，之后作为粘着细胞铺板于明胶涂敷的组织培养 板上。

维持为细胞培养物

所述细胞（例如所述解聚的细胞或所述间充质干细胞）可以铺板 并保持为细胞培养物。

所述细胞可以铺板至培养瓶或底物例如涂胶的板上。十分重要地， 所述细胞在不存在共培养物的情况下培养和繁殖，例如不存在饲养细 胞的情况下。

可以将所述细胞培养物中的细胞在无血清培养基中培养。所述培 养基可以补充一种或多种生长因子例如表皮生长因子（EGF）、成纤 维细胞生长因子2（FGF2）和任选的血小板衍生生长因子AB（PDGF AB），例如以5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml或 30ng/ml。所述细胞培养物中的细胞在汇合时可用分开或继代培养。可 以将它们以任何合适的方式分开，例如以胰蛋白酶处理、洗涤和再铺 板。平分比可以包括例如1:4。

所述间充质干细胞可以保持为细胞系。

无共培养物

在一些实施方案中，本发明人的方法涉及在不存在共培养物的情 况下培养细胞。

术语“共培养物”是指在一块培养的两种或多种不同类型的细胞 的混合物，例如间质饲养细胞。

因此，在典型的ES细胞培养物中，所述培养皿的内表面通常涂敷 有已经被处理使得它们不分裂的小鼠胚胎皮肤细胞的饲养层。所述饲 养层提供了一个粘着表面，以使所述ES细胞能够粘着和生长。另外， 所述饲养细胞可以将ES细胞生长需要的营养物释放至所述培养基中。 在本文描述的方法和组合物中，可以将ES和MSC细胞在不存在共培 养物的情况下培养。

所述细胞可以培养为单层或者在不存在饲养细胞的情况下培养。 可以将所述胚胎干细胞在不存在饲养细胞下培养以建立间充质干细胞 （MSC）。可以将所述MSC本身在不存在饲养细胞的情况下培养。

可以将分离的或解聚的胚胎干细胞直接置于培养底物上。可以将 所述间充质干细胞在培养底物上培养。所述培养底物可以包括组织培 养容器，例如培养皿。所述容器可以是经预处理的。可以将所述细胞 置于胶化的组织培养皿上并在其上培养。

以下是对皿进行明胶涂敷的示例性方案。制备溶于蒸馏水中的 0.1%明胶溶液并高压灭菌。可以将其在室温下保存。将组织培养皿的 底部以所述明胶溶液覆盖并孵育5-15分钟。除去明胶，将所述皿备用。 应在加入细胞之前加入培养基以防止低张溶胞。

无血清培养基

可以将分离的或解聚的胚胎干细胞在培养基中培养，所述培养基 可以包括无血清培养基。可以将所述间充质干细胞在培养基中培养， 所述培养基可以包括无血清培养基。

术语“无血清培养基”可以包括不含血清蛋白（例如胎牛血清） 的细胞培养基。无血清培养基是本领域中公知的，例如描述于美国专 利5,631,159和5,661,034中。无血清培养基可从例如Gibco-BRL （Invitrogen）市购。

无血清培养基可以不含蛋白，因为它可以缺乏蛋白、水解产物和 未知组合物的组分。无血清培养基可以包括其中所有组分具有已知化 学结构的化学成分确定的培养基。化学成分确定的无血清培养基是优 选的，因为它可提供完全确定的系统，所述系统可消除变异性，允许 改良的可重现性和更一致的性能并且可降低偶然物质污染的可能性。

无血清培养基可以包括敲除DMEM培养基（Invitrogen-Gibco, Grand Island,New York）。

无血清培养基可以补加一种或多种组分，例如，具有例如5%、10%、 15%等的浓度的血清替代培养基。无血清培养基可以包括或补加有来 自Invitrogen-Gibco（Grand Island,New York）的10%血清替代培 养基。

生长因子

分离的或解聚的胚胎干细胞可在其中培养的无血清培养基可以包 括一种或多种生长因子。间充质干细胞在其中培养的无血清培养基可 以包括一种或多种生长因子。现有技术中已知许多生长因子，包括 PDGF、EGF、TGF-a、FGF、NGF、红细胞生成素、TGF-b、IGF-I 和IGF-II。

所述生长因子可以包括成纤维细胞生长因子2（FGF2）。所述培 养基还可以包含其他生长因子，例如血小板衍生生长因子AB（PDGF  AB）。这两种生长因子都是现有技术中已知的。所述方法可以包括在 包含FGF2和PDGF AB的培养基中培养细胞。

替代地或者另外地，所述培养基可以包含或还包含表皮生长因子 （EGF）。使用EGF可以增强MSC的生长。EGF可以以任何合适的 浓度使用，例如5-10ng/ml EGF。EGF可以用于代替PDGF。EGF是 本领域中公知的蛋白，被表示为符号EGF，别名符号URG、Entrez 1950、 HUGO 3229、OMIM 131530、RefSeq NM_001963、UniProt P01133。

因此，本发明人公开了包含（i）FGF2、（ii）FGF2和PDGF以 及（iii）FGF2和EGF以及其他组合的培养基的用途。

FGF2是一种广谱的促有丝分裂的、血管原性的和神经营养的因子， 在许多组织和细胞类型中以低水平表达，并在脑和脑下垂体中达到高 浓度。FGF2已经涉及许多生理和病理过程，包括肢发育、血管发生、 伤口愈合和肿瘤生长。FGF2可以市购获得，例如从Invitrogen-Gibco （Grand Island,New York）。

血小板衍生生长因子（PDGF）是一种用于较宽范围细胞类型（包 括成纤维细胞、平滑肌和结缔组织）的强丝裂原。PDGF由被称为A 链和B链的两条链的二聚体组成，其可以作为AA或BB同型二聚体 存在，或者作为AB异型二聚体存在。人PDGF-AB是由13.3kDa A 链和12.2B链组成的25.5kDa同型二聚体蛋白。PDGF AB可以市购 获得，例如从Peprotech（Rocky Hill,New Jersey）。

表皮生长因子或EGF是通过结合于其受体EGFR而在细胞生长、 增值和分化的调节中起重要作用的生长因子。人EGF是6045-Da蛋白， 有53个氨基酸残基和3个分子内二硫键。EGF通过以高亲和力结合于 细胞表面上的表皮生长因子受体（EGFR）并刺激所述受体的内在蛋白 酪氨酸激酶活性而发挥作用。酪氨酸激酶活性反过来可引发信号转导 级联，所述信号转导级联可导致细胞内多种生物化学变化——细胞内 钙水平升高、醣酵解和蛋白合成增加、某些基因（包括EGFR的基因） 表达增加，所述变化最终可导致DNA合成和细胞增殖。EGF可以从 许多制造商市购获得。

生长因子（例如FGF2和任选的PDGF AB）可以以如下浓度存在 于所述培养基中：约100pg/ml，例如约500pg/ml，例如约1ng/ml， 例如约2ng/ml，例如约3ng/ml，例如约4ng/ml，例如约5ng/ml。在 一些实施方案中，所述培养基包含约5ng/ml的FGF2。所述培养基还 可以包含PDGF AB，例如以约5ng/ml。

分开细胞

培养中的细胞通常持续生长至汇合，这时接触抑制导致细胞分裂 和生长停止。然后，可以将这样的细胞从底物或烧瓶中分离，并通过 稀释至组织培养基并再铺板而“分开（split）”、继代培养或传代。

因此，本文描述的方法和组合物可以包括在培养过程中传代或分 开。所述细胞培养物中的细胞可以以1:2或更大（例如1:3，例如1:4， 1:5或更大）的比例分开。术语“传代”是指包括这样的过程，即取细 胞系的汇合培养物的等分试样，接种于新鲜培养基中，并培养所述细 胞系至达到汇合或饱和。

选择、筛选或分选步骤

所述方法还包括选择或分选步骤，以进一步分离或选择间充质干 细胞。

所述选择或分选步骤可以包括借助一种或多种表面抗原标记物从 所述细胞培养物中选择间充质干细胞（MSC）。使用选择或分选步骤 还可增强MSC的分选和选择特异性的严格性，此外有可能降低来自原 材料的胚胎干细胞（例如hESC）和其他hESC衍生物的可能污染。然 后，这将进一步降低畸胎瘤形成的风险，并进一步增加本发明人描述 的方案的临床相关性。

已知许多方法可用于基于抗原表达的选择或分选，这些方法的任 一种均可以用于本文描述的选择或分选步骤。所述选择或分选可以借 助荧光活化的细胞分选（FACS）完成。因此，如本领域中已知的，FACS 涉及将细胞暴露于报告物，例如经标记的抗体，所述经标记的抗体可 结合并标记所述细胞表达的抗原。产生抗体并标记其以形成报告物的 方法是本领域中已知的，例如记载于Harlow和Lane中。然后，使所 述细胞通过FACS机器，其可基于所述标记将所述细胞彼此分选开。 替代地或另外地，可以将磁性细胞分选（MACS）用于分选所述细胞。

本发明人已经意识到，虽然大量候选表面抗原已知与MSC相关， 例如CD105、CD73、ANPEP、ITGA4（CD49d）、PDGFRA，但所 述MSC相关表面抗原中的一些（例如CD29和CD49e）还在ES细胞 （例如hESC）中高表达，它们的表达可通过FACS分析验证。表面抗 原与MSC的关联可能不足以使所述抗原具有作为从ES细胞（例如 hESC）分离MSC的可选择标记物的资格。因此，所述选择或分选步 骤可以应用MSC和ES细胞之间差异表达的抗原。

本发明人的方法的选择或分选步骤可以基于所述抗原的表达正向 地选择间充质干细胞。这类抗原可以通过例如比较hESC和hESCMSC 的基因表达谱鉴定。在具体实施方案中，所述选择和分选可以特异地 利用如下表E1A和E1B中所示抗原的任一种。

本发明人的方法的选择或分选步骤可以基于抗原的表达正向地选 择间充质干细胞，所述抗原被鉴定在MSC上表达但不在ES细胞（例 如hESC）上表达。

CD73在MSC上高度表达，而在hESC上不高度表达。相对于hESC， CD73和CD 105二者是MSC中的高度表达表面抗原，并且排在 hESC-MSC中前20位高度表达表面抗原内，使用CD73或CD 105（或 二者）作为推定MSC的可选择标记物在分选由分化hESC生成的推定 MSC时将是等效的。

替代地或者另外地，所述选择或分选步骤可以基于表面抗原逆向 地针对抗原进行选择，所述表面抗原在胚胎干细胞（ES细胞）例如 hESC上作为高度表达的表面抗原，但在间充质干细胞例如hESC-MSC 上不作为高度表达的表面抗原。选择或分选可以基于已知或已经鉴定 的hESC特异性表面抗原例如MIBP、ITGB1BP3和PODXL以及CD24。

FACS分析确认了CD24在hESC上表达，但不在hESC-MSC上 表达。因此，CD24可以用作逆向选择或分选标记物，以其自身使用或 者与作为正向选择标记物的CD 105结合用于从分化hESC培养物中分 离推定MSC。

来自出生前源的间充质干细胞

从中可以制备所述转化的间充质干细胞的间充质干细胞可以来自 于出生前组织。所述出生前组织（例如胎儿组织）可以经过处理，例 如通过剥离、切碎或清洗或者它们的任意组合处理。

所述间充质干细胞可以基于任何合适的性质（例如优先粘着）来 自于这类出生前组织。例如，所述间充质干细胞可以基于其粘着底物 的能力而被选择。所述底物可以包括例如塑料。因此，所述间充质干 细胞可以通过以下方式来自于出生前组织：使所述出生前组织块中的 间充质干细胞粘着于塑料。为此目的，可以将所述组织置于具有一个 或多个塑料表面的容器中。这类容器可以包括培养容器，例如组织培 养皿。所述容器可以被胶化。可以使所述间充质干细胞移动出所述组 织块。可以使它们粘着于所述容器的表面。可以将剩余的出生前组织 除去，例如通过洗掉。因此，然后可以洗掉成块的组织片，剩下同源 的细胞培养物。

可以将所述组织培养在任何合适的培养基中，例如达尔伯克改良 的伊格尔培养基。所述培养基可以补加有任何合适的补充物，例如血 清替代培养基、EGF、FGF2等。如果存在所述血清替代培养基，可以 具有任何合适的浓度，例如10%。如果存在EGF，可以具有任何合适 的浓度，例如5、10、15或20ng/ml。如果存在EGF2，可以具有任何 合适的浓度，例如5、10、15或20ng/ml。

可用于产生出生前间充质干细胞的具体方案可以包括如下。所述 培养物可以培养在无血清或有血清培养基中。当汇合时，可以将所述 培养物传代，例如通过胰蛋白酶消化，然后以例如1:4分开于胶化的 组织培养皿上。无血清培养基可以由补加10%血清替代培养基、非必 需氨基酸、10ng/ml FGF2、10ng/ml重组人EGF和55μΜβ-巯基乙 醇的敲除DMEM培养基制成。含血清的培养基可以由补加青霉素-链 霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10%胎牛血清的不含谷氨酰胺的 高葡萄糖DMEM制成。可以使用PDGF代替EGF或者与EGF一起 使用。

所述培养物可以不包含共培养物例如饲养细胞，或者在不存在共 培养物（例如不存在饲养细胞）的情况下建立。为此目的，可以将所 述间充质干细胞在不存在饲养细胞层的情况下培养。这一点在下文进 一步详述。

所述间充质干细胞可以通过以下方式产生：基于细胞表面标记物 的表达任选地从其他细胞中选择间充质干细胞，如下文中进一步详述 的。因此，所述细胞任选地可通过检测例如CD 105（登记号NM 000118.1）或CD73（登记号NM 002526.1）或者二者的表达升高进 行选择。所述细胞还可任选地通过检测CD24（登记号NM 013230.1） 的表达降低进行选择。因此，所述间充质干细胞可以通过选择CD 105+ CD24-的细胞而获得。所述间充质干细胞可以通过以抗合适表面抗原的 抗体标记所述细胞进行选择，并且可以通过荧光活化细胞分选（FACS） 或磁性细胞分选（MACS）进行选择。

转化的间充质干细胞的特征

通过本文描述的方法和组合物获得的转化的间充质干细胞可以呈 现间充质干细胞的一种或多种性质或特征。

它们可以满足通常用于鉴定间充质干细胞的任一种或多种形态学、 表型和功能标准⁹，如本领域中已知的。所述性质或特征可以由 International Society for Cellular Therapy定义。具体而言，它们可以 呈现Dominici et al（2006）中列出的一种或多种特征。

形态学

通过本文所述的方法和组合物获得的转化的间充质干细胞可以呈 现间充质干细胞的一种或多种形态学特征。

通过本文所述的方法获得的转化的间充质干细胞可以在汇合处显 示典型的指纹螺环。

所获得的转化的间充质干细胞可以形成具有成纤维细胞表型的粘 着单层。所述转化的间充质干细胞可以能够粘着于塑料。

它们可以具有72至96小时的平均群体倍增时间。最佳培养可以 是25%至85%汇合，或者每cm²15-50,000个细胞。

抗原谱

此外，所获得的转化的间充质干细胞可以显示与间充质干细胞相 似或相同的表面抗原谱。

通过本文描述的方法获得的转化的间充质干细胞可能缺少一种或 多种多能性标记物（例如Oct-4、SSEA-4和TRal-60）的表达或显示 其表达降低，例如在多肽水平。它们可以显示OCT4和SOX2中一种 或两种的转录表达，但与胚胎干细胞（例如hES3人ESC）相比水平 降低。表达水平可以是胚胎干细胞的二分之一、五分之一或十分之一 或者更低。

所获得的转化的间充质干细胞可以显示“典型的”MSC样表面抗 原谱。例如，它们还可以显示与间充质干细胞相关的一种或多种标记 物的表达。这些可以包括如下的任一种或多种的表达：CD29、CD44、 CD49a、CD49e、CD105、CD166、MHC I。例如，所述转化的间充质 干细胞可以显示其无表达与间充质干细胞相关的任一种或多种标记物 的表达减少或缺失。因此，所述转化的间充质干细胞可以显示HLA-DR、 CD34和CD45中的任一个或多个的表达减少或缺失。所述转化的间充 质干细胞特别可以包括CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、 CD166+、MHC I+、CD34^-和CD45^-细胞。

所述转化的间充质干细胞可以是对小鼠特异性c-mos重复序列呈 阴性的并且是对人特异性alu重复序列呈阳性的。它可能能够进行骨 发生、脂肪发生或软骨发生中的任一种或多种，特别是它可能能够分 化成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞中的任一种或多种。

分化潜能

使用本领域中已知和下文所述的方法，所获得的转化的间充质干 细胞可以分化成任何间充质谱系。因此，通过本文所述方法和组合物 获得的转化的间充质干细胞可以显示包括脂肪发生、软骨发生和骨发 生的分化潜能⁹。

增殖能力

如所述获得的转化的间充质干细胞可以具有很大的体外增殖能力。 在一些实施方案中，所获得的转化的间充质干细胞可以进行至少10次 群体倍增，同时保持正常二倍体核型。所述转化的间充质干细胞可能 能够进行至少20-30次群体倍增，同时保持正常二倍体核型。在一些 实施方案中，所述转化的间充质干细胞在整个该时间中显示稳定的基 因表达和表面抗原谱。

所获得的转化的间充质干细胞可以使得它们不显示任何缺点，例 如染色体畸变和/或基因表达改变。在一些实施方案中，这类缺陷直到 10代后（例如13代后，例如15代后）仍不明显。

同质性

所获得的转化的间充质干细胞可以显示高度的一致性。换句话说， 从不同源获得的转化的间充质干细胞可以显示彼此共有的同样或不同 特征中的一个或多个，例如数个。

它们可以显示与其他间充质干细胞（例如人胚胎干细胞源的间充 质干细胞（hESC-MSC）——如例如WO2007/027157或 WO2007/027156中所述）共有的同样或不同特征中的一个或多个，例 如数个。

由本文所述的方法产生的转化的间充质干细胞在性质上可以相似 或相同（例如同源）。也就是说，通过所述方案分离的转化的间充质 干细胞克隆彼此可以显示高度的相似性或同一性，不管是在表型上或 其他方面。

相似性或同一性可以通过多种方式度量，并由一种或多种特征测 量。例如，所述克隆可以在基因表达上相似或相同。例如，所述转化 的间充质干细胞可以使得由所述方法产生的转化的间充质干细胞中的 任两种或多种（例如全部）呈现基本相似或相同的基因表达谱，也就 是说，所表达的基因类型和它们所表达的水平的组合。

通过所述方法获得的转化的间充质干细胞的两个或多个隔离群 （isolate）之间的基因表达相关系数可以大于0.8，例如大于0.85或0.9。 通过所述方法获得的转化的间充质干细胞的任何两个或多个不同传代 （例如连续传代）之间的基因表达相关系数可以大于0.8，例如大于0.85 或0.9。由所述方法获得的转化的间充质干细胞和hESC-MSC（例如 WO2007/027157或WO2007/027156中所述的）之间的基因表达相关系 数可以大于0.8，例如大于0.85或0.9。

基因表达的同质性可以通过多种方法测量。基因组规模的基因作 谱可以使用例如实施例中所述的对提取的RNA的阵列杂交进行。可以 提取总RNA并转换成cDNA，cDNA可杂交于包含来自相关基因组的 多个基因序列的阵列芯片。所述阵列可以包含NCBI Reference Se- quence（RefSeq）基因，这些基因是由National Center for Biotech- nology Information（NCBI）人员和合作者基于现行标准验证、注释并 整理的得到很好表征的基因。

然后，可以将样品之间的基因表达使用分析软件进行比较。在一 个实施方案中，基因表达的相似性或同一性可以表示为“相关系数”。 在这类测量中，两个样品之间的高相关系数表示所述两个样品的基因 表达模式之间的高相似度。相反，两个样品之间的低相关系数表示所 述两个样品的基因表达模式之间的低相似度。可以进行归一化以在数 据分析前除去系统变异或偏差（包括强度偏差、空间偏差、板偏差和 背景偏差）。

相关性检验是本领域中公知的，包括T检验和皮尔森检验，如例 如Hill,T.&Lewicki,P.（2006）.Statistics:Methods和Applications. StatSoft,Tulsa,OK,ISBN:1884233597（also StatSoft,Inc.（2006）. Electronic Statistics Textbook.Tulsa,OK:StatSoft.WEB: http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html）中所述。参考 Khoj asteh et al.,2005,A stepwise framework for the normalization of  array CGH data,BMC Bioinformatics 2005,6:274。还可以进行组内相 关系数（ICC），如上文Khojasteh et al中所述。

例如，可以进行皮尔森检验以生成皮尔森相关系数。1.0的相关系 数表示相同的基因表达模式。

为了这类目的，可以将cDNA与Sentrix HumanRef-8Expression BeadChip杂交，并使用Illumina BeadStation 500x扫描。可以将数据 使用Illumina BeadStudio（Illumina,Inc,San Diego,CA,USA）提取、 归一化并分析。然而，对读者来说明显的是，任何合适的芯片以及扫 描硬件和软件（其可输出相关性测量值）均可以用于测定基因表达谱 的相似性。

任意两个隔离群之间的基因表达相关系数（如例如通过上述方式 测量的）可以为0.65或更大。所述基因表达相关系数可以为0.70或更 大，例如0.80或更大，例如0.85或更大，例如0.90或更大。所述系数 可以为0.91或更大、0.92或更大、0.93或更大、0.94或更大、0.95或 更大、0.96或更大、0.97或更大、0.98或更大、0.99或更大或1.0。

在一些实施方案中，本文描述的方法可生成转化的间充质干细胞， 如此得到的转化的间充质干细胞的任两个或多个隔离群之间的基因表 达相关系数与一段时间间隔（例如1个月间隔）进行的相同RNA样品 的技术重复物之间的相关系数在同一个数量级或比其稍微小。例如， 转化的间充质干细胞的任两个或多个隔离群之间的基因表达相关系数 可以为0.70或更大，例如0.80或更大，例如0.85或更大，例如0.90 或更大.所述系数可以为0.91或更大、0.92或更大、0.93或更大、0.94 或更大、0.95或更大、0.96或更大、0.97或更大、0.98或更大、0.99 或更大或1.0。

对于已经进行上文所述的衍生、选择或分选步骤的细胞，所述基 因表达相关系数可以在这类区间内。大多数隔离群（例如所有隔离群） 之间的基因表达相关系数可以在这类区间内。

因此，本发明人提供了一种生成彼此基本相似或相同（例如同源） 的转化的间充质干细胞的方法。所述隔离群可以显示几乎相同的基因 表达谱。

除了上文所述的“内部”同质性（即来自所述方法的转化的间充 质干细胞的隔离群之间的同质性）外，还可以在这类隔离群和其他细 胞或细胞类型之间评估同质性。具体而言，可以与来自其他方法的间 充质干细胞例如人ESC-MSC培养物（例如WO2007/027157或 WO2007/027156中所述）进行比较。因此，在一些实施方案中，通过 本文所述方法和组合物获得的转化的间充质干细胞显示与这类人 ESC-MSC培养物相似、同源或相同的基因表达谱。因此，所获得的转 化的间充质干细胞可以显示与这类人ESC-MSC培养物（例如 WO2007/027157或WO2007/027156中所述的）之间大于0.5（例如大 于0.6，例如大于0.7，例如大于0.8，例如大于0.9）的基因表达相关 系数。

端粒末端转移酶活性

如此得到的转化的间充质干细胞可以包括端粒末端转移酶活性。 所述端粒末端转移酶活性与对照细胞（例如非间充质干细胞的细胞） 相比可以增加或上调。例如，所述对照细胞可以包括分化细胞，例如 间质谱系中的分化细胞，例如骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

端粒末端转移酶活性可以通过本领域中已知的方式确定，例如使 用TRAP活性测定法（Kim et al.,Science 266:2011,1997），使用市购 试剂盒（TRAPeze.RTM.XK Telomerase Detection Kit,Cat.s7707; Intergen Co.,Purchase N.Y.;or TeloTAGGG.TM.Telomerase PCR  ELISA plus,Cat.2,013,89;Roche Diagnostics,Indianapolis）。hTERT 表达还可以通过RT-PCR在mRNA水平评估。可市购LightCycler  TeloTAGGG.TM.hTERT定量试剂盒（Cat.3,012,344;Roche Diag- nostics）用于研究目的。

例如，相对端粒末端转移酶活性可以通过实时定量端粒重复扩增 法测量。该基于qPCR的测定法可定量由所述样品中存在的端粒末端 转移酶活性在体外生成的产物。所述相对端粒末端转移酶活性与端粒 末端转移酶产物的量直接成比例，并且可以通过1μg蛋白细胞裂解物 的阈值循环数（或Ct值）测定。Hues9.E1是指以前记载的hESC-MSC 系，HEK是人胚肾细胞系。每个胎儿MSC的Ct值可以取多个传代（例 如2、3、4个传代等）的平均值。传代可以包括例如3个传代，例如 P16、P18和P20。对于对照细胞例如Hues9.E1，所述平均值可以是对 2个传代，例如P20和P22。所述测定可以进行多次，例如对每个传代 进行3次。

端粒末端转移酶检测方法的具体实例在实施例中提供。

来自本文所述方法的所述间充质干细胞可以具有25或更大，例如 26或更大或27或更大的Ct值（通过这类方法测定的）。所述Ct值 可以为例如28或更大、29或更大、30或更大、31或更大或32或更大。

维持自我更新

所述转化的间充质干细胞可能能够保持自我更新。

所述转化的间充质干细胞和细胞系（来源自它们的分化细胞）可 以使得它们不显示胚胎干细胞的一种或多种特征。这类特征可以包括 表达OCT4基因、SSEA-4基因、Tra1-60基因以及碱性磷酸酶活性。 所述间充质干细胞可以呈现一种或多种特征性多能标记物的表达减少。 这类多能标记物可以包括Nanog、BMP4、FGF5、Oct4、Sox-2和Utf1 等。

由本文所述方法制备的转化的间充质干细胞可以是非致瘤和/或非 致畸形的。

因此，所述转化的间充质干细胞可以使得当它们被移植至受体动 物时基本不诱导畸胎瘤的形成。所述转化的间充质干细胞可以使得当 其被植入免疫妥协或免疫缺陷宿主动物中时不导致肿瘤。

所述受体动物可以包括免疫妥协的受体动物。免疫妥协或免疫缺 陷宿主动物可以包括SCID小鼠或Rag1-/-小鼠。所述细胞可以使得 转化的间充质干细胞被转化至其中的受体动物在植入后合适的时间期 间（例如3周或2-9个月）不显示畸胎瘤形成。所述转化的间充质干 细胞可以使得在植入较长时期（例如大于2周，例如大于2个月，例 如大于9个月，）后不形成肿瘤。

致肿瘤性测试的详细方案如下。

将1×10⁶个胚胎干细胞皮下移植至SCID小鼠中。在3周时当胚 胎干细胞来源的肿瘤直径约1cm时，使用Qtracker细胞标记试剂盒 （Quantum Dot Corp,Hay ward,CA）将以Qdot纳米晶体（655nm 发射）标记的转化的间充质干细胞注射至所述胚胎干细胞来源的畸胎 瘤中。

3天后，将所述小鼠用超剂量的麻醉剂安乐处死，并取出肿瘤。将 所述肿瘤在4%的低聚甲醛中固定并以20μm的厚度冷冻切片。通过 以下方式测定所述切片的pecam-1免疫反应性：使用大鼠抗pecam1 的抗体（Pharmingen,San Diego,California），然后是FITC-缀合的 兔抗大鼠的抗体（Chemicon,Temecula,California），并且以DAPI 复染。通过共聚焦显微镜分析所述切片。

由本文所述的方法制备的转化的间充质干细胞还可以显示一种或 多种如下特性。所述转化的间充质干细胞可以维持在细胞培养物中较 长的期间，例如大于40个世代。它们可以具有由染色体数目评估的基 本稳定的核型，当在细胞培养物中维持至少10个世代时如此。它们还 可以显示世代与世代之间基本稳定的基因表达模式。对于这一点，本 发明人是指所选择的基因集合中的一个或多个（例如基本全部）的表 达水平在一个世代的转化的间充质干细胞和下一个世代的转化的间充 质干细胞之间没有显著变化。

所述基因集合可以包括如下中的一个或多个、亚集或全部： cerberus（GenBank登录号：NM 009887,AF031896,AF035579）、 FABP（GenBank登录号：NM_007980,M65034,AY523818, AY523819）、Foxa2（GenBank登录号：NM_01-0446,X74937,L10409）、 Gata-1（GenBank登录号：NM 008089,X15763,BC052653）、Gata-4 （GenBank登录号：NM_008092,AF179424,U85046,M98339, AB075549）、Hesx1（GenBank登录号：NM 010420,X80040,U40720, AK082831）、HNF4a（GenBank登录号：NM_008261,D29015, BC039220）、c-kit（GenBank登录号：NM_021099,Y00864,AY536430, BC075716,AK047010,BC026713,BC052457,AK046795）、PDGFRa （NM_01 1058,M57683,M84607,BC053036）、Oct4（GenBank登录 号：NM 013633,X52437,M34381,BC068268）、Runx1（GenBank登 录号：NM 009821,D26532,BC069929,AK051758）、Sox17（GenBank 登录号：NM_011441,D49474,L29085,AK004781）、Sox2（GenBank 登录号：NM 011443,U31967,AB108673）、Brachyury（NM_009309, X51683）、TDGF1（GenBank登录号：NM_011562,M87321）和Tie-2 （GenBank登录号：NM 013690,X67553,X71426,D13738, BC050824）。

本文描述的方法使得能够产生转化的间充质干细胞以及分化细胞， 所述分化细胞包含转化的间充质干细胞的无性后代。术语细胞的“无 性后代”是指基本没有发生任何转化处理或遗传改变的所述细胞的后 代。未发生实质性基因组变化的这类无性后代与亲代细胞或祖先（例 如所述转化的间充质干细胞）在遗传上基本相同。术语“转化的间充 质干细胞”应被认为包括来源自转化的间充质干细胞的细胞系，即转 化的间充质干细胞系，反之亦然。

长期保持培养

可以将所述转化的间充质干细胞或其后代培养多于一个世代。

例如，可以将所述细胞培养多于5、多于10、多于15、多于20、 多于25、多于50、多于40、多于45、多于50、多于100、多于200、 多于500或多于800个世代。具体地，可以将所述细胞系保持1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、 45、50、75、100、200、500或更多个世代。

培养中的细胞通常将持续生长至汇合，这时接触抑制导致细胞分 裂和生长停止。然后，可以将这样的细胞从底物或烧瓶上分离，并通 过稀释至组织培养基并再铺板来“分开”或传代。因此，所述培养的 细胞在培养过程中传代或分开。它们可以以1:2或更大（例如1:3或 1:4，1:5或更大）的比率分开。术语“传代”是指包括这样的过程， 即取细胞系的汇合培养物的等分试样，接种于新鲜培养基中，并培养 所述细胞系直至达到汇合或饱和。

然而，根据本文描述的方法获得的转化的间充质干细胞可以保持 许多世代。另一方面，已经确定的是，直接来自生物体的“正常”细 胞（即未转化的体细胞）不是永生的。换言之，这类体细胞在培养时 具有有限寿命（它们是非永生的）。它们将不持续无限生长，而是在 某一数目的世代后将最终失去增殖或分裂的能力。在达到“关键期” 时，这类细胞在约50个世代后死亡。因此，这类体细胞仅可以传代有 限次。

根据本文描述的方法，转化的间充质干细胞可以繁殖多于50个世 代。在一些实施方案中，所述转化的间充质干细胞可以作为转化的间 充质干细胞系无限繁殖。所述转化的间充质干细胞和转化的间充质干 细胞可以是谱系限制性的。具体而言，它们可以是使得它们不能产生 所有三个胚层。在一些实施方案中，所述转化的间充质干细胞系可以 是非多能性的。

本发明人还提供了包含多个细胞的组合物，其中大多数所述细胞 为间充质干细胞。例如，至少60%的所述细胞可以包括间充质干细胞。 另外，本发明人提供了分离的间充质干细胞。术语细胞系可以被认为 指可以在培养时被维持并培养，并且显示永生或无限寿命的细胞。

心脏保护能力

如此得到的转化的间充质干细胞或由这类细胞条件化的培养基可 以包括心脏保护能力，如实施例中所述。所述心脏保护作用可以包括 在缺血和/或再灌注过程中恢复或维持心脏功能。

心脏保护作用可以在任何合适的模型系统（例如急性心肌梗塞 （AMI）的小鼠模型）中测定。在这类测定中，AMI是通过永久结扎 冠状动脉左前降支而在小鼠中诱导，如Salto-Tellez M,Yung Lim S, El-Oakley RM,Tang TP,ZA AL,et al.(2004)Myocardial infarction in  the C57BL/6J mouse:a quantifiable and highly reproducible experi- mental model.Cardiovasc Pathol 13:91-97中所述。

然后，将100μl如上文所述制备的10X浓缩的条件培养基或非条 件培养基（对照）经置于颈静脉处的渗透泵在72小时内给予小鼠。这 个小鼠中的心脏功能在3周后通过MRI评估。

心脏保护作用还可以在心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤的猪/小鼠 模型中测定（Timmers L,Lim S-K,Arslan F,et al.Reduction of my- ocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned  medium.Stem Cell Research.2008;1:129-137）。在该测定中，损伤 是通过暂时阻塞猪冠状动脉左旋支或小鼠LAD而诱导，然后除去阻塞 以开始再灌注。

上文描述的心脏保护作用测定法还可以用于测试心脏保护作用， 尤其在慢性缺血中。该MI/R损伤模型和其他MI/R损伤模型本质上评 估在不同临床适应症中的心脏保护作用。

如此得到的转化的间充质干细胞或由这类细胞条件化的培养基或 者从它们分离的颗粒可能能够减轻再灌注损伤。这可以使用如 WO2008/020815中所述的猪缺血-再灌注模型测定。

如下是用于测定间充质干细胞（包括转化的间充质干细胞）条件 培养基的心脏保护能力的简单方案。MI可以是通过用缝线结扎动脉阻 塞左冠状动脉（LCA）30分钟来诱导。后面的再灌注可以通过释放所 述缝线开始。再灌注之前5分钟，经尾静脉给小鼠静脉输注200μl盐 水稀释的条件培养基（包含来自Hues9.E1（hESC-MSC）CM的3μg 蛋白或胎儿MSC CM的150μg蛋白）。对照动物被输注200200μl盐 水。在24小时的再灌注后，作为风险面积（AAR）百分比的梗塞面积 （IS）可以使用以前在参考文献26中描述的伊凡斯蓝染料（Evans’blue  dye）注射和TTC染色进行评估。

简而言之，仅在切除心脏用于分析之前，如在诱导缺血时那样再 结扎LCA，伊凡斯蓝染料可以被注入主动脉，AAR可以确定为不被伊 凡斯蓝染色的区域。然后，可以将心脏切下，并且以TTC染色心脏的 横切面。活心肌膜被TTC染色为红色，而死心肌膜不被染色。相对梗 塞面积可以被测量为不被TTC染色的死心肌膜面积与不被伊凡斯蓝染 料染色的面积确定的AAR风险的比。

梗塞面积

所得到的转化的间充质干细胞或由这类细胞条件化的培养基可以 具有减少梗塞面积的能力。与以非条件培养基或盐水处理的动物相比， 所述梗塞面积可以减少10%或更多、20%或更多、30%或更多、40% 或更多、50%或更多、60%或更多或者70%或更多。

测定梗塞面积

梗塞面积例如可以使用如下的方法测定。

就在切除心脏之前，将LCxCA（猪）或LCA（小鼠）在与用于 诱导MI的位置完全相同的位置处再结扎。将伊凡斯蓝染料注入整个 冠状动脉系统以描述出风险面积（AAR）。

然后将心脏切除，将LV分离并从顶部至基部切成5片。将所述 切片以溶于37℃缓冲液（13.6g/L KH₂PO₄+17.8g/L Na₂HPO₄·2H₂O,pH 7.4）中的1%氯化三苯四唑（TTC,Sigma-Aldrich  Chemicals,Zwijndrecht,the Netherlands）孵育15分钟，以区分梗塞 组织与活心肌膜。

对所有切片均扫描两面，在每一面，通过使用数字面积法软件 （Image J）将梗塞面积与风险面积和总面积比较。在对所述切片重量 校正后，梗塞面积被计算为AAR和LV的百分数。

氧化应激

通过本文描述的方法产生的转化的间充质干细胞可能能够减少氧 化应激。

与以非条件培养基或盐水处理的动物相比，所述氧化应激可以减 少10%或更多、20%或更多、25%或更多、30%或更多、40%或更多、 50%或更多、60%或功能更多或者70%或更多。

氧化应激的减少可以以过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞死亡的体外 测定法进行测定。

测定氧化应激

氧化应激的减少例如可以使用在过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞死 亡的体外测定法进行测定。总之，过氧化氢（H₂O₂）介导的氧化应激 在人白血病CEM细胞中被诱导，并且通过台盼蓝排除法监测细胞生活 力。将人白血病CEM细胞与条件培养基或转化的间充质干细胞（以盐 水作为对照）孵育，并以50μΜH₂O₂处理以诱导氧化应激。细胞生存 力是在H₂O₂处理后12、24、36和48小时使用台盼蓝排除法进行评估。

氧化应激的减少还可以使用DNA氧化的体内测定法进行测定。体 内氧化应激还可以如下进行测定。将猪以所述颗粒、条件培养基或转 化的间充质干细胞（以盐水作为对照）处理。获得猪心脏的组织切片。 通过对氧化的DNA的8-OhdG免疫染色来定量处理的和未处理的猪的 组织切片中的核氧化应激。对组织切片测定指示DNA氧化和氧化应激 的强核染色。

用途

根据本文描述的方法制备的转化的间充质干细胞和分化细胞可以 用于多种商业上重要的研究、诊断和治疗目的。这些用途是本领域中 公知的，但将在本文中简单描述。

间充质干细胞和分化细胞群可以用于再生性疗法。间充质干细胞 （例如转化的间充质干细胞和从其制备的分化细胞）可以通过离体扩 增制备或者直接给予患者。它们还可以用于在创伤后受损组织的再增 殖。

因此，脂肪细胞或来自其的脂肪组织可以用于在重建或整形手术 过程中填充腔或凹陷。软骨细胞可以用于软骨修复，而骨细胞可以用 于骨修复。由本文描述的方法和组合物制备的转化的间充质干细胞可 以分化成任何的这些细胞类型，并且可以用于所述目的。

本文描述的方法和组合物可以用于产生分化细胞，用于治疗如下 任一种疾病或制备用于治疗如下一种疾病的药物组合物：可通过再生 疗法治疗的疾病、心力衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤、退行性疾病例 如糖尿病、阿尔茨默病、帕金森病和癌症。

由本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细胞 可以用于治疗疾病或者用于制备治疗疾病的药物组合物。这类疾病可 以包括可通过再生疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓病、皮肤病、 烧伤、退行性疾病例如糖尿病、阿尔茨默病、帕金森病等和癌症。

例如，干细胞可以用作间充质干细胞和分化细胞的源，用于癌症 的免疫疗法的NK或树状细胞，其中所述间充质干细胞和分化细胞可 以通过本文描述的方法和组合物制备。

明显的是，本文所述方法和组合物使得能够产生转化的间充质干 细胞，其理所当然可以使用本领域中已知的方法进行分化。因此，分 化细胞的任何用途将同样地隶属于作为它们来源的这些转化的间充质 干细胞。

分化细胞

分化细胞（例如终末分化细胞）可以来自于根据所述方法制备的 转化的间充质干细胞或细胞系。因此，本发明人公开了用于生成分化 细胞的方法，所述方法包括生成所述的转化的间充质干细胞或细胞系， 并从它们得到分化细胞。由本文所述方法和组合物制备的转化的间充 质干细胞可以分化成任何这些细胞类型，并用于所述目的。

可以根据本文所述方法制备的分化细胞可以包括如下的任意或全 部：

i）脂肪细胞：脂肪或脂肪组织的功能性细胞类型，出现在整个 身体，特别是在皮肤下。脂肪细胞储存并合成脂肪用于能量、热调节 和抗机械冲击的缓冲

ii）心肌细胞：使心脏持续并有节律跳动的心脏的功能性肌肉细 胞类型

iii）软骨细胞：制备关节、耳道、气管、会厌、喉、椎骨之间椎 间盘和肋末端的软骨的功能性细胞类型

iv）成纤维细胞：出现在身体大多数组织中的结缔组织细胞或支 持细胞。成纤维细胞可提供指导性的支持骨架，以帮助具体器官的功 能性细胞类型正确发挥功能。

v）肝细胞：制备用于解毒代谢废物、破坏红细胞并回收其组分 以及合成血浆蛋白的酶的肝的功能性细胞类型

vi）造血细胞：制备血液的功能性细胞类型。造血细胞存在于成 年骨髓中。在胎儿中，造血细胞存在于肝、脾、骨髓以及子宫中胎儿 周围的支持组织中。

vii）肌细胞：肌肉的功能性细胞类型

viii）神经元：专门传导冲动的脑的功性能细胞类型

ix）成骨细胞：负责制造骨的功能性细胞类型

x）胰岛细胞：负责分泌胰岛素、胰高血糖素、促胃液素和促生 长素抑制素的胰的功能性细胞。总之，这些分子可调节包括碳水化合 物和脂肪代谢、血糖水平和至胃中的酸分泌的多个过程。

转化的间充质干细胞和分化细胞的用途

根据本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细 胞可以用于多种商业上重要的研究、诊断和治疗目的。

例如，分化细胞的群可以用于制备对所述分化表型特异性的抗体 和cDNA文库。用于提高、纯化和修饰抗体的常用技术以及它们在免 疫测定和免疫分离方法中的用途记载于Handbook of Experimental  Immunology（Weir&Blackwell,eds.）;Current Protocols in Immu- nology（Coligan et al.,eds.）;和Methods of Immunological Analysis （Masseyeff et al.，eds.,Weinheim:VCH Verlags GmbH）。制备mRNA 和cDNA文库中涉及的常用技术记载于RNA Methodologies:A La- boratory Guide for Isolation and Characterization（R.E.Farrell, Academic Press,1998）;cDNA Library Protocols（Cowell&Austin, eds.,Humana Press）;和Functional Genomics（Hunt&Livesey,eds., 2000）。相对同源的细胞群特别适合用于药物筛选和治疗应用。

转化的间充质干细胞和分化细胞的这些用途和其他用途更详细记 载于下文和本文他处。所述转化的间充质干细胞和分化细胞可以特别 用于制备用于治疗疾病的药物组合物。这类疾病可以包括可通过再生 疗法治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓病、皮肤病、烧伤、退行性疾 病例如糖尿病、阿尔茨默病、帕金森病等和癌症。

由本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞具有与来源 自人胚胎干细胞的间充质干细胞（hESC-MSC）（例如WO2007/027157 或WO2007/027156中所述的）相似或相同的性质。因此，所述转化的 间充质干细胞和从其制备的任何分化细胞可以用于任何这样的应用， 即已知使用间充质干细胞（例如hESC-间充质干细胞）的应用或者可 能使用它们的应用。

药物筛选

根据本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细 胞还可以用于筛查影响转化的间充质干细胞或分化细胞的特征的因子 （例如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸等）或环境条件（例如培养 条件或操作）。

在一些应用中，转化的间充质干细胞和分化细胞可用于筛查在长 期培养中促进这类细胞成熟或者促进这类细胞的增殖和维持的因子。 例如，候选成熟因子或生长因子通过以下方式进行测试：将它们加入 不同孔的转化的间充质干细胞或分化细胞中，然后根据用于进一步培 养和使用所述细胞的所需标准确定这导致的任何表型变化。

此外，转化的间充质干细胞和分化细胞的基因表达谱可以用于鉴 定这些细胞中特异的或高度表达的受体、转录因子和信号传导分子。 所述受体、转录因子和信号传导分子的特异性配体、小分子抑制剂或 激活剂可以用于调节转化的间充质干细胞和分化细胞的分化和性质。

具体的筛查应用涉及药物研究中测试药物化合物。除了本文他处 关于药物筛选的一般性描述之外，读者通常可参考标准教科书′In vitro  Methods in Pharmaceutical Research′,Academic Press,1997和U.S. Pat.No.5,030,015。评估候选药物化合物的活性一般涉及将所述分化细 胞与所述候选化合物相结合，确定所述化合物造成的所述细胞的形态 学、标记物表型或代谢活性的任何变化（与未处理的细胞或以惰性化 合物处理的细胞相比），然后将所述化合物的效应与观察到的变化相 关联。

可以进行所述筛选，例如因为所述化合物被设计成对某些细胞类 型具有药理效应，或者因为被设计成在别处具有效应的化合物可能具 有不想要的副作用。两种或多种药物可以组合测试（通过同时或相继 与所述细胞相结合），以检测可能的药物-药物相互效应。在一些应用 中，最初筛选化合物的潜在毒性（Castell et al.,pp.375-410in′In vitro  Methods in Pharmaceutical Research,′Academic Press,1997）。细胞 毒性在第一情况中可以通过对细胞生存力、存活率、形态学以及某些 标记物、受体或酶的表达或释放的效应而确定。药物对染色体DNA的 效应可以通过测量DNA合成或修复进行确定。[³H]胸苷或BrdU整合 （特别是在细胞周期中不定时间或者高于细胞复制所需的水平时）与 药物效应一致。不利效应还可以包括不常见的姐妹染色单体互换率， 这通过细胞分裂中期涂片确定。读者可以参考A.Vickers（PP 375-410 in′In vitro Methods in Pharmaceutical Research,′Academic Press, 1997）获得更详细描述。

组织再生

根据本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细 胞还可以用于在需要它的人患者中进行组织重建或再生。将所述细胞 以使它们能够移植至目标组织部位并重建或再生所述功能缺陷区域的 方式给予。

例如，本文所述方法和组合物可以用于调节干细胞的分化。转化 的间充质干细胞和分化细胞可以用于组织工程，例如用于生成皮肤移 植物。对干细胞分化的调节可以用于人造器官或组织的生物工程，或 者用于修复学例如支架。

癌症

由本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细胞 可以用于治疗癌症。

术语“癌症”和“癌性的”是指或者描述一般以不受控细胞生长 为特征的哺乳动物中的生理病症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋 巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。

这类癌症的更具体的实例包括鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非 小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞肿瘤例如成胶质细胞瘤和 神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、 结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾脏癌、前列 腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤和多种类型的头颈癌。进一步的实 例是实体瘤癌，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌；造血系统恶 性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤、霍奇金病、再生障碍性贫血、皮肤癌 和常见的腺瘤性息肉病。进一步的实例包括脑肿瘤、结肠直肠肿瘤、 乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、眼肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿 瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、睾丸肿瘤、肿瘤、骨肿瘤、滋养层肿瘤、 输卵管肿瘤、直肠肿瘤、结肠肿瘤、肾肿瘤、胃肿瘤和副甲状腺肿瘤。 还包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、恶性黑色素 瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和胆管癌。

根据本文所述方法和组合物制备的转化的间充质干细胞和分化细 胞还可以与抗癌剂（例如内皮他丁和血管他丁）或细胞毒剂或化学治 疗剂结合使用。例如，药物，例如阿霉素、道诺霉素、顺铂、依托泊 苷、紫杉醇、多西紫杉醇；以及生物碱类，例如长春新碱；以及抗代 谢物，例如甲氨蝶呤。本文使用的术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止 细胞功能并/或造成细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素（例 如I、Y、Pr）、化学治疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物源 的酶活性毒素或其片段。

同时，该术语包括癌基因产物/酪氨酸激酶抑制剂，例如WO 94/22867中所公开的双环安沙霉素类；EP 600832中公开的1,2-双(芳 基氨基)苯甲酸衍生物；EP 600831中公开的6,7-二氨基-酞嗪-1-酮衍生 物；EP 516598中公开的4,5-双(芳基氨基)-酞酰亚胺衍生物；或抑制酪 氨酸激酶结合于含SH2的底物蛋白的肽（例如，参见WO 94/07913）。 “化学治疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括阿 霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶（5-FU）、胞嘧啶阿糖胞苷、（Ara-C）、 环磷酰胺、塞替派、白消安、Cytoxin、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美 法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米 托蒽醌、长春新碱、VP-16、长春瑞滨、卡铂、替尼泊甙、道诺霉素、 洋红霉素、氨基蝶呤、更生霉素、丝裂霉素、烟酰胺、埃斯培拉霉素 （Esperamicins）（参见美国专利No.4,675,187）、美法仑和其他相关 氮芥和内分泌治疗物（例如己烯雌酚（DES）、他莫昔芬、LHRH拮 抗药物、黄体酮、抗孕激素等）。

可治疗的疾病

可以对通过本文所述方法获得的转化的间充质干细胞进行分析。

如此获得的转化的间充质干细胞可以具有与间充质干细胞（例如 WO2007/027157或WO2007/027156中描述的hESC-MSC）类似的表 达谱。因此，由本发明人的方法得到的转化的间充质干细胞可以具有 与其对应物明显的生物相似性，例如在它们分泌旁分泌因子的能力方 面。

因此，本文描述的转化的间充质干细胞可以用于hESC-MSC（例 如WO2007/027157或WO2007/027156中描述的那些）适合的任何目 的

所述转化的间充质干细胞可以用于治疗代谢、防御反应以及组织 分化（包括血管生成、造血作用和骨骼发育）的疾病，或者其修复或 治疗涉及任一个或多个这些生物过程的疾病。类似地，由所述转化的 间充质干细胞表达（例如分泌）的蛋白可以单独地或结合地（例如以 条件培养基的形式）用于补充所述转化的间充质干细胞的活性或者替 代所述转化的间充质干细胞，用于例如治疗或预防这类疾病的目的。

所述转化的间充质干细胞可以用于在心血管生物学、骨发育和造 血作用中活化信号传导通路，例如Jak-STAT、MAPK、Toll样受体、 TGF-β信号传导和mTOR信号传导通路。因此，所述转化的间充质干 细胞、其表达的蛋白等可以用于预防或治疗这样的疾病，即其中涉及 这些信号传导通路中的任一种或其病因涉及这些信号传递通路的任一 种或多种中的一种或多种缺陷。

因此，转化的间充质干细胞可以用于治疗心力衰竭、骨髓病、皮 肤病、烧伤和退行性疾病例如糖尿病、阿耳茨海默病、帕金森病和癌 症。

转化的间充质干细胞可以用于治疗心肌梗塞、皮肤伤口、皮肤科 疾病、皮肤损害、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮 肤癌、特应性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、 溃疡、以诱导炎症和免疫功能失调（其导致慢性组织重塑，包括纤维 化和功能丧失）的初始损伤为特征的病理病症、肾局部缺血性损伤、 囊性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎或矫形疾病。

它们可以用于协助个体中的伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移 植或骨髓移植。

本发明人提供了本文获得的转化的间充质干细胞或由这类转化的 间充质干细胞条件化的培养基在调节包括如下任一种或多种通路的通 路中的用途：Rho GTP酶的细胞骨架调节、细胞周期、整联蛋白信号 传导通路、由趋化因子和细胞因子信号传导通路介导的炎症、FGF信 号传导通路、EGF受体信号传导通路、血管发生、血纤维蛋白溶酶原 活化的级联、凝血、醣酵解、泛素蛋白酶体通路、嘌呤的从头生物合 成、TCA循环、苯丙氨酸生物合成、血红素生物合成。

本发明人还提供了本文获得的转化的间充质干细胞或由这类转化 的间充质干细胞条件化的培养基在调节包括如下任一种或多种过程的 过程中的用途：细胞结构和运动性、细胞结构、细胞通讯、细胞运动 性、细胞粘着、胞吞作用、有丝分裂、胞吐作用、胞质分裂、细胞周 期、免疫力和防御、细胞因子/趋化因子介导的免疫力、巨噬细胞介导 的免疫力、粒细胞介导的免疫力、配体介导的信号传导、细胞因子和 趋化因子介导的信号传导通路、信号转导、细胞外基质蛋白介导的信 号传导、生长因子内稳态、受体蛋白酪氨酸激酶信号传导通路、细胞 粘着介导的信号传导、细胞表面受体介导的信号传导、JAK-STAT级 联、抗氧化和自由基清除、内稳态、应激反应、血液凝固、发育过程、 中胚层发育、骨骼发育、血管发生、肌肉发育、肌收缩、蛋白质代谢 和修饰、蛋白质酶解、蛋白质折叠、蛋白复合体装配、氨基酸活化、 细胞内蛋白质转运、其他蛋白的靶向和定位、氨基酸代谢、蛋白质生 物合成、蛋白质二硫键异构酶反应、碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖 磷酸支路、其他多糖代谢、嘌呤代谢、磷酸盐代谢的调节、维生素代 谢、氨基酸生物合成、前体mRNA加工、翻译调控、mRNA剪接。

本发明人还提供了本文获得的转化的间充质干细胞或由这类转化 的间充质干细胞条件化的培养基在提供包括如下任一种或多种功能的 功能中的用途：信号传导分子、趋化因子、生长因子、细胞因子、白 细胞介素、其他细胞因子、细胞外基质、细胞外基质结构蛋白、其他 细胞外基质、细胞外基质糖蛋白、蛋白酶、金属蛋白酶、其他蛋白酶、 蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原 酶、脱氢酶、过氧化物酶、伴侣蛋白、伴侣素、Hsp 70家族伴侣蛋白、 其他伴侣蛋白、合成酶、合酶和合成酶、选择性钙结合蛋白、氨酰tRNA 合成酶、裂解酶、异构酶、其他异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、 其他裂解酶、其他酶调节物、选择性调节分子、肌动蛋白结合细胞骨 架蛋白、细胞骨架蛋白、非马达肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动 蛋白相关蛋白、膜联蛋白、微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合 马达蛋白、中间丝、核糖核蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其他RNA 结合蛋白、组蛋白、钙调蛋白相关蛋白、囊泡外壳蛋白。

再者，本文获得的转化的间充质干细胞或由这类转化的间充质干 细胞条件化的培养基可以用于治疗这样的疾病，即这些功能可能在其 中发挥作用或者其修复或治疗涉及任一个或多个这些生物过程。类似 地，由所述转化的间充质干细胞表达的蛋白可以单独地或结合地（例 如以条件培养基的形式）用于补充所述转化的间充质干细胞的活性或 者替代所述转化的间充质干细胞，用于例如治疗或预防这类疾病的目 的。

由本文获得的所述转化的间充质干细胞表达的基因产物可以用于 活化心血管生物学、骨发育和造血作用中的重要信号传导通路，例如 Jak-STAT、MAPK、Toll样受体、TGF-β信号传导和mTOR信号传 导通路。因此，所述hESC-MSC、其表达的蛋白等可以用于预防或治 疗这样的疾病，即其中涉及这些信号传递通路任一种或其病因涉及这 些信号传递通路的任一种或多种中一种或多种缺陷。

因此，这类条件培养基可以用于治疗心力衰竭、骨髓病、皮肤病、 烧伤和退行性疾病例如糖尿病、阿耳茨海默病、帕金森病和癌症。

这类条件培养基还可以用于治疗心肌梗塞、皮肤伤口、皮肤科疾 病、皮肤损害、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮肤 癌、特应性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃 疡、以诱导炎症和免疫功能失调（其导致慢性组织重塑，包括纤维化 和功能丧失）的初始损伤为特征的病理病症、肾局部缺血性损伤、囊 性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎或矫形疾病。

所述条件培养基可以用于协助个体中的伤口愈合、瘢痕减少、骨 形成、骨移植或骨髓移植。

特别地，所述条件培养基可以用于调节涉及血管形成、血液学（特 异性免疫过程）或肌肉骨骼发育等的过程。

这样的组合物可以用于任何可以使用所述条件培养基的目的。除 非上下文另外指出，术语“条件培养基”应被认为不仅包括暴露于MSC 的细胞培养基，而且包括这样的组合物，即其包含存在于所述条件培 养基中的一种或多种（例如基本全部）多肽。

此外，由本文描述的转化的间充质干细胞（包括条件培养基的形 式）分泌的任一种或多种蛋白可以用于与WO2007/027157或 WO2007/027156中描述的hESC-MSC相同的目的。

所述转化的间充质干细胞还可以用作由它们分泌或表达的任一蛋 白的源。因此，本发明人提供了一种产生多肽的方法，包括如所述获 得转化的间充质干细胞，培养所述转化的间充质干细胞，并从所述转 化的间充质干细胞中分离所述多肽，例如从所述转化的间充质干细胞 在其中生长的培养基中。

皮肤科疾病

由通过本文中所述方法获得的转化的间充质干细胞条件化的培养 基可以用于治疗皮肤科疾病。

因此，将这类条件培养基局部应用于皮肤伤口或皮肤科损害或疾 病（例如皮炎或银屑病）可改善愈合并减少瘢痕形成。还应保持内稳 态。所述条件培养基可以在基于脂质体的乳剂、凝胶或者乳膏制剂和 标准伤口敷料的一部分。所述条件培养基还可以被用作化妆护肤产物 中的补充物，以促进皮肤修复和愈合。

测试这类条件培养基对皮肤疾病的效力的合适动物模型有小鼠皮 炎模型。小鼠真皮致敏如早前的描述进行[A72,A73]。简而言之，将溶 于100μIPBS中50μg的Blo t 5或仅PBS应用于1cm²线网（gauze） 并以透明敷料（Smith Nephew）贴于所述皮肤。经50天的时长重复该 步骤两次。然后，将CM和NCM应用于1cm²线网并如上所述贴于所 述皮肤，持续不同的时长。

为了对皮肤炎症进行组织检查，从所述贴片的皮肤获得样本并立 即在10%缓冲的中性福尔马林中固定。

哮喘和变态反应

由通过本文中所述方法获得的转化的间充质干细胞条件化的培养 基可以用于治疗哮喘和变态反应。

哮喘是具有等同复杂的病因学的复杂疾病，由表征很少的一组遗 传和环境因子引起。所导致的病状是导致气道的慢性炎症和上皮下纤 维化的免疫失调，以平滑肌量增加和细胞外基质蛋白沉积增加以及随 后肺功能降低为特征。

现在的治疗包括调整多个因子或信号传导通路，例如所述ECM、 整联蛋白和间充质细胞功能[A74]、toll样受体[A75]、生长因子例如 TGF-β和EGF[A76,A77]和所述IL6通路[A78]。hESC-MSC的CM 已经被预测对这些靶区域具有生物学效应，本发明人预测所述CM可 帮助恢复哮喘肺中的免疫调节，并促进组织修复并使肺组织瘢痕形成 最小化。

为了研究这类条件培养基（CM）和所述非条件培养基（NCM） 对慢性气道炎症和气道的效应，如上文所述进行小鼠的皮内致敏[A72, A73]。在50天后，将所述贴片的小鼠麻醉，并连续三天使之接受以50 μg的Blo t 5进行的鼻内激发。最后一剂后24小时，使用侵入性BUXCO [A79]进行测量气道高反应性（AHR）。将所述小鼠麻醉，并连续三天 经鼻内给予条件培养基或非条件培养基。最后一剂后24小时，测量气 道高反应性（AHR）。再过24小时后收集BAL流体。在进行支气管 肺泡灌洗收集后，将肺以10%的中性福尔马林固定。

为了研究CM和所述NCM对急性气道炎症和气道的效应。

分泌高水平IL-4、IL-5、IL-13并具有不可检测水平的IFN-γ的 Blot t 5特异性Th2细胞系可以用于建立小鼠变态反应模型。简而言之， 将对首次接受试验的小鼠（mice）的致敏是通过在每只小鼠中经 静脉过继转移2.5x10⁶Blo t 5特异性Th2细胞进行。将这些小鼠麻醉， 并连续三天以50μg的Blo t 5进行鼻内（IN）激发。最后一次IN激 发后24小时，使用侵入性BUXCO[A79]进行测量气道高反应性（AHR）。 然后，将所述小鼠麻醉，并连续三天鼻内给予CM或NCM。在最后一 次Blo t 5激发后48小时收集BAL流体。在进行支气管肺泡灌洗收集 后，将肺以10%的中性福尔马林固定用于组织病理学分析。

在临床实践中，使用CM来治疗肺病时可以使用标准气溶胶疗法 [A80-86]有效地给予。

其他疾病

由通过本文所述方法获得的转化的间充质干细胞条件化的培养基 可以用于治疗其他疾病。

通常，本发明人预计，这类条件培养基可用于在这样的病理病症 中恢复体内稳态并促进组织修复，所述病理病症即其中初始损伤的诱 导炎症和免疫功能失调可导致慢性组织重塑，包括纤维化和功能丧失。 其他疾病包括肾局部缺血性损伤、囊性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎。

矫形外科

由通过本文所述方法获得的转化的间充质干细胞条件化的培养基 可以用于治疗矫形病症。

现行用于修复肌肉骨骼组织的治疗策略经常包括使用生物材料 （陶瓷或聚合物），以不仅提供机械支持而且作为支架来促进细胞迁 移、细胞粘着、增殖和分化以起始血管生成和最终新骨形成[A87-90]。 基于对这类条件培养基的计算分析，将CM整合进入所述支架设计可 以增强所述支架的细胞迁移、增殖、粘着、骨骼分化和血管生成。

为了测试CM对将另外导致萎缩性不愈合的缺陷中骨再生的效应， 使New Zealand白兔在一个半径接受15-mm临界大小的缺陷[A91]， 其充以合适的基质例如被CM或NCM涂覆的胶原绵状物或水凝胶。 每3周获得放射照片。在6或12周后，将动物杀死。通过microCT 扫描测量新骨，并且通过使用抗CD31的抗体染色在所述植入物中的 内皮细胞来测量维管状态。至少在初期（at least initially）应存在增加 的维管状态，并且增加的新骨形成。

为了测试CM对软骨修复的效应，使用了兔的骨软骨损伤模型 [A92]。将CM涂覆于合适的支架上例如胶原和水凝胶，并植入3-mm 的骨软骨膝缺陷[A93]。对于临床应用，可以通过将所述CM整合进入 已有支架或骨移植物中而使用CM[A94]。

骨髓移植

MSC已被证明可增强骨髓移植[A95]，减轻移植物抗宿主疾病。 MSC的移植已被证明通过促进造血的移植物移入[A96]并限制GVHD [A97,A98]改善同种异体移植的结果。现在认为，MSC通过增强所述 造血干细胞环境[A99]和诱导耐受介导这些效应，并降低GVHD、同种 异体组织移植排斥和炎症调节[A98]，有可能通过分泌可溶性因子[A 100]。

MSC的这类条件培养基的可能临床应用：通过在培养基中添加 CM在体外或者通过在移植过程中注入具有造血干细胞的CM在体内 而扩增造血干细胞群，通过静脉注入CM减轻GVHD，或者通过静脉 注入CM作为移植治疗前和后的一部分诱导对所移植的细胞或组织的 免疫耐受。

心脏病

本文描述的转化的间充质干细胞可以用于治疗或预防心脏病。

心脏病是影响心脏的多种不同疾病的总括性术语。到2007年为止， 它是美国、英格兰、加拿大和威尔士的第一死亡原因，仅在美国就34 秒死亡一人。心脏病包括如下的任一种。

冠心病

冠状动脉疾病是动脉粥样化斑在供应心肌膜的动脉壁中积聚引起 的动脉疾病。心绞痛（胸痛）和心肌梗塞（心脏病发作）是冠心病引 起的症状和病症。每年有超过459,000名美国人死于冠心病。在英国， 每年有101,000死亡病例是由于冠心病。

心肌病

心肌病是由任何原因引起的心肌膜（即实际的心肌）的功能衰退。 患有心肌病的人经常有心律失常和/或突然心源性死亡的风险。其中主 病理学在心肌膜本身以外的外部心肌病-心肌病包括大部分的心肌病。 到目前为止，心肌病的最常见诱因是缺血。

世界卫生组织包括具体的心肌病：酗酒心肌病、冠心病、先天性 心脏病、影响心脏的营养病、缺血性（或缺血）心肌病、高血压心肌 病、心瓣膜心肌病、炎症性心肌病。

还包括：

继发于全身代谢病的心肌病

内在心肌病（并非由于可识别的外部原因引起的心脏的肌肉虚弱）

扩张性心肌病（DCM，最常见形式，心脏移植的主要指征之一。 在DCM中，心脏（特别是左心室）扩大并且泵功能减小）

肥大性心肌病（HCM或HOCM，由编码肌节蛋白的基因中的多 种突变导致的遗传病。在HCM中，心肌增厚，这可能阻塞血流并阻 碍心脏正常发挥功能），

致心律失常性右心室心肌病（ARVC，其起因于对其中心肌被纤 维性疤组织替代的心脏的电干扰。右心室通常受影响最大）

限制性心肌病（RCM，其是最少见心肌病。心室的壁僵硬，但可 能不增厚，阻止正常的心脏充血）。

致密化不全心肌病-从出生开始左心室就不能正常生长，在超声 心动图中观察到其具有海绵状表象。

心血管疾病

心血管疾病是影响心脏本身和/或血管系统（特别是通向心脏和从 心脏伸出的静脉和动脉）的许多具体疾病之一。对疾病二态性的研究 表明，患心血管疾病的女性通常具有影响血管的形式，而男性通常具 有影响心肌本身的形式。心血管疾病的已知或相关原因包括糖尿病、 高血压、高同型半胱氨酸血症和血胆脂醇过多。

心血管疾病的类型包括动脉粥样硬化。

缺血性心脏病

缺血性心脏病是心脏本身的疾病，以向器官的血液供应减少为特 征。这出现在供应氧和营养物的动脉停下来时，心脏将得不到足够的 氧和营养物并将最终停止跳动。

心力衰竭

心力衰竭也称为充血性心力衰竭（或CHF）和充血性心脏衰竭 （CCF），是一种可能由损害心脏充盈或泵送足够量的血液至全身的 能力的任何结构或功能性心脏疾病引起的病症。肺源性心脏病是心脏 右侧的衰竭。

高血压心脏病

高血压心脏病是由高血压（特别是局部高血压）引起的心脏病。 可由高血压心脏病导致的病症包括：左心室肥大、冠心病、（充血性） 心力衰竭、高血压心肌病、心律失常、炎性心脏病等。

炎性心脏病涉及心肌和/或其周围组织的炎症。心内膜炎包括心脏 内层——心内膜——的炎症。所涉及的最常见结构为心脏瓣膜。炎性 心脏扩大症。心肌炎包括心肌膜——心脏的肌肉部分——的炎症。

瓣膜性心脏病

瓣膜性心脏病是影响一个或多个心脏瓣膜的疾病过程。心脏右侧 的瓣膜是三尖瓣和肺动脉瓣。心脏左侧的瓣膜是二尖瓣和主动脉瓣。 包括主动脉瓣狭窄、二尖瓣脱垂和瓣膜性心肌病。

[上述文字修改自Heart disease.（2009,February 3）.In Wik- ipedia,the Free Encyclopedia.Retrieved 06:33,February 20,2009, from http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Heart_disease&oldid=26829 0924]

前体miRNA/成熟miRNA的比例

在实施例中，本发明人还证明前体与成熟miRNA的比例变化取决 于所述细胞状态。因此，本发明人命名为“前体miRNA/成熟miRNA 的比例”的该比例可以用作监测细胞状态的标记物。

所述实施例通过使用定量RT-PCR（qRT-PCR）分析显示，由来 源自人胚胎干细胞（hESC）的间充质干细胞（MSC）分泌的外核体包 含miRNA。这类miRNA主要以前体（前）-miRNA的形式存在，同 时不具有可检测的原始（原）miRNA的水平。因此，外核体中hsa-let-7b （miRBase登录号：MI0000063）和hsa-let-7g（miRBase登录号： MI0000433）的前体miRNA与成熟miRNA的比例分别是所述细胞中 的169倍和1078倍。

在实施例中，本发明人证明，以c-myc基因转化的MSC不衰老， 持续增殖并保持高水平的端粒末端转移酶活性。本发明人使用实时 RT-PCR分析证明，相对于亲本MSC的分泌物，hsa-let-7b miRNA （miRBase登录号：MI0000063）的myc-转化的MSC分泌物中前体 miRNA与成熟miRNA的比例增加至2.8倍。在另一方面，hsa-let-7g miRNA的前体miRNA与成熟miRNA的比例不因转化而变化。

hsa-let-7b在本文他处有详述。

因此，以癌基因转化MSC可导致所述细胞显示致癌状态；在这类 致癌状态下，相对于未转化细胞中前体与成熟hsa-let-7b miRNA （miRBase登录号：MI0000063）的比例，前体与成熟hsa-let-7b miRNA 的比例增加。因此，前体与成熟hsa-let-7b miRNA miRNA的比例可以 用于监测细胞的致癌状态。

还观察到其他miRNA种类的前体与成熟miRNA的比例因为转化 而变化。因此，可以使用这些其他miRNA种类的前体miRNA与成熟 miRNA的比例替代hsa-let-7b miRNA的前体miRNA与成熟miRNA 的比例或者与其共同使用，作为致癌转化的标记物。

本发明人发现，一些miRNA种类的前体与成熟miRNA的比例随 细胞状态的变化而变化，所述细胞状态的变化例如生理状态的变化或 病理状态的变化或者在生理状态与病理状态之间转换。

因此，细胞状态的变化可以通过监测这些miRNA的前体miRNA 与成熟miRNA的比例进行监测。

本发明人描述了一种监测细胞状态的方法，所述方法包括对由所 述细胞分泌的所选microRNA（miRNA）种类建立：（a）所述miRNA 种类的前体形式（前体miRNA）；与（b）所述miRNA种类的成熟形 式（成熟miRNA）的比例，其中如此建立的前体miRNA与成熟miRNA 的比例指示所述细胞的状态。

所述细胞可以包括在细胞块、组织、器官或生物体中。所述前体 miRNA与成熟miRNA的比例可以指示所述各个细胞块、组织、器官 或生物体的状态。

所述miRNA种类可以包括在由所述细胞分泌的外核体中。所述方 法可以包括获得这类外核体，并获得来自这类外核体的前体和成熟形 式的miRNA种类。

所述前体miRNA与成熟miRNA的比例可以通过杂交于包含核酸 序列的阵列建立，所述核酸序列能够结合并区分前体和成熟形式的 miRNA种类。

所述前体miRNA与成熟miRNA的比例可以通过实时聚合酶链式 反应（RT-PCR）建立。

所述方法可以包括建立包含多个所选择的miRNA种类的多个前 体miRNA与成熟miRNA的比例的谱，每个均指示所述细胞的状态。

所述方法可以包括建立包含多个所选择的miRNA种类的多个前 体miRNA与成熟miRNA的比例的谱，所述谱是通过杂交于包含多个 探针的阵列建立，所述探针能够结合并区分前体和成熟形式的所选 miRNA种类。

所述外核体可以从生物体样品获得，所述生物体包括细胞。所述 样品可以包括血液样品、血清样品、唾液样品或尿液样品。

所述细胞状态可以包括生理状态，例如细胞周期状态、分化状态、 发育状态或代谢状态。

所述细胞状态可以包括病理状态，例如疾病状态、人疾病状态、 糖尿病状态、免疫疾病状态、神经变性疾病状态、致癌状态、癌性状 态或肿瘤状态。

本发明人还描述了一种上文示出用于检测细胞状态变化的方法， 所述方法包括检测所述细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例的变 化（或包含这类比例的谱）,其中这类变化指示所述细胞状态的变化。

本发明人还描述了一种上文示出用于确立细胞处于具体状态的方 法，所述方法包括将所述细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或 包含这类比例的谱）与已知处于该具体状态的细胞的前体miRNA与成 熟miRNA的比例（或包含这类比例的谱）进行比较。

本发明人还描述了一种监测生物体的状态的方法，所述方法包括 从所述生物体获得样品，对所述样品进行上文示出的方法，根据如此 获得的前体miRNA与成熟miRNA的比例确立所述生物体的状态。

本发明人还描述了一种检测生物体的疾病的方法，所述方法包括 从该生物体获得样品或获得该生物体的样品，对所述样品进行上文示 出的方法，并且将如此获得的前体miRNA与成熟miRNA的比例与疾 病生物体的已知样品或来自疾病生物体的已知样品的前体miRNA与 成熟miRNA的比例进行比较。

本发明人还描述了一种治疗或预防生物体的疾病的方法，所述方 法包括检测权利要求14的生物体的疾病，并将用于该疾病的治疗给予 所述生物体。

所述细胞可以包括间充质干细胞（MSC）。所述细胞状态可以包 括未转化的状态和转化的状态，例如c-myc转化的状态。

所述microRNA可以包括hsa-let-7b microRNA。转化的状态的比 值与正常状态相比可以高2.8。上述的任意组合都是可能的。

本发明人还描述了包含多个核酸序列的阵列，所述核酸序列能够 结合并区分前体和成熟形式的多个miRNA种类。

HSA-LET-7B

hsa-let-7b具有miRBASE登记号MI0000063。前体hsa-let-7b具 有如下序列：

＞hsa-let-7b MI0000063

CGGGGUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUUCAGGGCAGUGAUGUUGCCCCUCGGAAGAUAACUAU

ACAACCUACUGCCUUCCCUG

前体hsa-let-7b具有如下结构：

成熟hsa-let-7b具有miRBase登记号MIMAT0000063和如下序列：

＞hsa-let-7b MIMAT0000063

UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU

hsa-let-7b详细记载于如下出版物中：

″Identification of novel  genes coding for small expressed RNAs″Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，Tuschl  T.Science.294：853-858(2001)；″Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal  neoplasia″Michael MZ，O′Connor SM，van Holst Pellekaan NG，Young GP，James RJ.Mol  Cancer Res.1：882-891(2003)；″Altered expression profiles of microRNAs during TPA- induced differentiation of HL-60cells″Kasashima K，Nakamura Y，Kozu T.Biochem  Biophys Res Commun.322：403-410(2004)；″A mammalian microRNA expression atlas based  on small RNA library sequencing″Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，Sewer A，Iovino N， Aravin A，Pfeffer S，Rice A，Kamphorst AO，Landthaler M，Lin C，Socci ND，Hermida L， Fulci V，Chiaretti S，Foa R，Schliwka J，Fuchs U，Novosel A，Muller RU，Schermer B，Bissels  U，Inman J，Phan Q，Chien M.Cell.129：1401-1414(2007)and″Patterns of known and novel  small RNAs in human cervical cancer″Lui WO，Pourmand N，Patterson BK，Fire A.Cancer  Res.67：6031-6043(2007).

细胞状态的变化

根据本文所述方法和组合物，所述前体miRNA与成熟miRNA的 比例可以用于监测多种细胞状态的变化。

这类细胞状态的变化可以包括生理状态(例如细胞周期状态)的 变化。因此，监测miRNA种类的前体miRNA与成熟miRNA的比例 可以用于监测细胞的G1状态、M状态、G2状态或S状态。

所述生理状态可以包括分化状态；换句话说，miRNA种类的前体 miRNA与成熟miRNA的比例可以用于确定细胞是分化的或未分化的。 这可以用于例如检测细胞的多能性。例如，这可以用于检测细胞是否 是干细胞，或者细胞是否是分化细胞或者细胞是否是终末分化的。

所述生理状态可以包括发育状态或发育阶段。因此，miRNA种类 的前体miRNA与成熟miRNA的比例可以用于确定细胞是否是胚胎状 态或阶段、胎儿状态或阶段、新生儿状态或阶段、婴儿状态或阶段、 幼年状态或阶段、学步期状态或阶段、青春期状态或阶段、成年状态 或阶段等。

监测病理状态

所述细胞状态可以包括病理状态，例如疾病状态。因此，miRNA 种类的前体miRNA与成熟miRNA的比例可以用于监测细胞的病理状 态或者正常状态向病理状态的改变。

所述前体miRNA与成熟miRNA的比例可以用于检测细胞是处于 正常（未患病）状态或患病状态。这可以用于监测细胞从正常未患病 状态向患病状态的发展。这可以用于监测所述细胞的疾病状态。所述 疾病可以包括生物体患有或可能患有的多种疾病的任一种。

通常，所述疾病状态可以包括肥大性心肌病、细菌性心内膜炎、 无脑回、肌萎缩侧索硬化、头晕、法洛四联症、心肌炎、酒精中毒、 贫血、臂丛神经病变、痔疮、先天性心脏缺损、斑秃、镰状细胞贫血、 二尖瓣脱垂、植物神经系统疾病、异常、阿尔茨海默病、心绞痛、直 肠疾病或致心律失常性右室发育异常的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括心室发育异常、痤疮酒渣鼻、弱视、强直 性脊柱炎、房颤、心脏压塞、获得性免疫缺陷综合征、淀粉样变、食 欲缺乏、焦虑、孤独症、脑肿瘤、中央神经系统疾病、色觉缺陷、动 脉硬化、背痛、乳腺疾病、中枢神经系统感染、结肠直肠肿瘤、关节 炎、白塞氏综合征、乳腺肿瘤、大脑性瘫痪、感冒、哮喘、双相型障 碍、烧伤或宫颈肿瘤的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括沟通障碍、动脉粥样硬化、失明、念珠菌 病、腓骨肌萎缩病（charcot-marie disease）、克罗恩病、注意力缺陷 障碍、脑损伤、白内障、溃疡性结肠炎、累积性创伤失调、囊性纤维 化病、发育残疾、进食障碍、丹毒、纤维肌痛、褥疮、糖尿病、肺气 肿、大肠杆菌感染、毛囊炎、吞咽障碍、糖尿病足或脑炎的任一种或 多种。

所述疾病状态可以包括食管疾病、食物超敏反应、痴呆、唐氏综 合征、日本脑炎、眼肿瘤、食物中毒、登革热、诵读困难、子宫内膜 异位症、法布里病、胃肠炎、抑郁症、张力失常、癫痫、慢性疲乏综 合征、胃食管反流、高歇氏病、血液病、希尔施普龙病、脑积水、甲 状腺功能亢进症、龈炎、血友病、组织细胞增生症、多汗症、低血糖、 青光眼、肝炎和hiv感染的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括高草酸尿、甲状腺功能减退症、糖原累积 病、肝豆状核变性、霍奇金病、超敏感性、免疫缺陷综合症、头痛、 疝、心手综合征、高血压、阳痿、充血性心力衰竭、生殖器疱疹、亨 廷顿氏病、肺动脉高压、失禁、不育、白血球过多症、系统性红斑狼 疮、足分支菌病、智力低下、炎症、肝肿瘤、莱姆病、疟疾或先天性 代谢缺陷的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括炎性肠病、长QT综合征、淋巴管肌瘤病、 麻疹、偏头痛、流行性感冒、腰背痛、淋巴水肿、黑色素瘤、口腔异 常、乳胶变态反应、阻塞性肺病、淋巴瘤、脑膜炎、粘多糖贮积症或 麻风病的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括肺肿瘤、黄斑变性、绝经期、多发性硬化、 肌肉萎缩症、肌筋膜疼痛综合征、骨性关节炎、胰腺肿瘤、消化性溃 疡、重症肌无力、恶心、骨质疏松症、恐慌症、波斯湾综合征、骨髓 瘤、听神经瘤、中耳炎、截瘫、苯丙酮尿症、骨髓增生病、眼震、卵 巢肿瘤或帕金森病的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括嗜铬细胞瘤、心肌病、机会性感染、疼痛、 扁平部睫状体炎、恐怖障碍、心肌梗塞、遗传性视神经萎缩、胰腺疾 病、虱病、鼠疫、毒漆藤皮炎、朊病毒疾病、反射性交感神经营养不 良症、精神分裂症、羞怯、脊髓灰质炎、前列腺病、呼吸道病、硬皮 病、干燥综合征或风湿性多肌痛的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括前列腺肿瘤、多动腿、脊柱侧凸、皮肤病、 脊髓灰质炎后综合征、银屑病、视网膜疾病、坏血病、皮肤肿瘤、癌 前病症、狂犬病、视网膜母细胞瘤、性功能障碍、睡眠障碍、妊娠、 罕见疾病、结节病、性传播疾病、痉挛性斜颈或脊髓损伤的任一种或 多种。

所述疾病状态可以包括口吃、睾丸肿瘤、拔毛狂、尿路感染、脊 柱裂病、物质相关性障碍、地中海贫血症、三叉神经痛、泌尿生殖器 疾病、脊髓小脑变性、婴儿猝死、血栓形成、结核病、血管疾病、斜 视、自杀、耳鸣、结节性硬化症、病毒病、创伤后应激障碍、脊髓空 洞症、抽动秽语综合征（tourette syndrome）、特纳氏综合征(turner’s  syndrome)或视力障碍的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括心理应激、颞下颌关节功能障碍综合征、 沙眼、尿失禁、呕吐、冯维勒布兰德的病、肾性骨营养不良症、细菌 感染、消化系统肿瘤、骨肿瘤、外阴病、异位妊娠、蜱传疾病、马方 综合征、老化、威廉斯综合征、血管发生因子、荨麻疹、败血症、吸 收不良综合征或伤口和损伤的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括脑血管意外、多个化学敏感性、头晕、肾积 水、黄热病、神经性关节病、肝细胞癌、多形性腺瘤、法特壶腹、麦 克尔憩室（Meckel′s diverticulum）、圆锥角膜、皮肤瘰粒、有害建筑 综合征、泌尿系统疾病、缺血性视神经病变、胆总管结石、耳鼻喉病、 上腔静脉综合征、鼻窦炎、桡骨骨折、畸形性骨炎、滋养层肿瘤、软 骨肉瘤或阅读和颈动脉狭窄的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括静脉曲张、克罗伊茨费尔特-雅各布病、胆 囊疾病、关节替换、白癜风、鼻疾病、环境病、巨结肠、肺炎、前庭 病、隐球菌病、带状疱疹、输卵管肿瘤、感染、心律失常、葡萄糖耐 受不良、神经内分泌肿瘤、疥疮的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括酒精性肝炎、寄生虫病、输卵管炎、隐球 菌性脑膜炎、颅内动脉瘤、悲伤、结石、色素痣、直肠肿瘤、真菌病、 血管瘤、结肠肿瘤、维生素A过多症、肾钙沉着症、肾肿瘤、维生素、 类癌肿瘤、乳糜泻、脑下垂体病、脑死亡、胆道病或前列腺炎的任一 种或多种。

所述疾病状态可以包括医源性疾病、胃肠出血、腺癌、中毒性巨 结肠、截肢者、脂溢性角化病、骨髓炎、巴雷特食管、出血、胃肿瘤、 水痘、胆囊炎或软骨瘤的任一种或多种。

所述疾病状态可以包括细菌感染和真菌病、甲状旁腺肿瘤、精索 扭转、腺瘤、扁平苔藓、肛腺肿瘤、脂肪瘤、足癣、酒精性肝病、神 经纤维瘤病、淋巴疾病、老人虐待、湿疹、憩室炎、癌、胰腺炎、阿 米巴病、妊娠并发症、肾盂肾炎、传染性单核细胞增多症或动脉瘤的 任一种或多种。

具体而言，所述疾病状态可以包括疾病：例如糖尿病、免疫病症、 神经变性病症或者癌症或肿瘤。因此，所述前体miRNA与成熟miRNA 的比例可以用于监测患有或者倾向于患有上文所列任一疾病的生物体 的细胞的细胞状态。

应了解，细胞可以包括在组织、组织块、器官或生物体中。在该 情形下，所述前体与成熟miRNA的比例除了可以用于确定细胞状态外， 还可以用于确定其中包含所述细胞的组织、组织块、器官或生物体的 状态。

外核体

外核体是直径30-100ηm的分泌的微粒，最初发现由网状细胞 释放（1A）。它们实质上是包含蛋白和RNA的磷脂囊泡。

现在已知外核体由许多细胞类型分泌，包括血液来源的细胞类型 （B细胞、树突细胞、肥大细胞、T细胞和血小板）和非血血液来源 的细胞类型（肠上皮细胞、Schwann细胞、神经元细胞、肿瘤细胞、 肿瘤细胞系（它们包括鼠小神经胶质细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细 胞、卵巢癌细胞））以及精子（（2A）综述）。然而，对它们的功能 仍然知道的很少。最近的研究已表明，它们可能在健康和疾病（例如 肿瘤转移）中、在抗原呈递中以及在传染剂传送中发挥作用（3A,4A）。

外核体的生物发生是通过多种高度调节的细胞过程进行，包括通 过良好表征的ESCRT（转运需要的内体分选复合体）-介导的对货物 的侧分离和内体膜的向内出芽（5A）在内体多泡体（MVB）中形成管 腔内囊泡。

由于这样的高度调节的细胞过程通常对细胞的生理或病理状态变 化敏感，因此可以想象外核体的生物发生还将连带受到影响，并且这 些影响将表现在所述外核体的数量或组成上。

通常认为，我们身体中细胞分泌的至少部分外核体会释放至循环 系统中。实际上，在容易获得的体液（例如血液和尿液）中的外核体 已经被发现起源于许多细胞类型（2A），并且已经证明，肿瘤患者中 循环系统的外核体和肿瘤来源的microRNA是类似的（6A）。总之， 这些特征使得循环系统的外核体是鉴定生物标记物的理想靶（7A）。

由于外核体携带蛋白质和RNA负载，体液（例如尿液和血液）中 的外核体蛋白和RNA都被评估为疾病的生物标记物（7A）。尿的外 核体的蛋白组学已经对可能的生物标记物作谱（8A-11A）。外核体胎 球蛋白A已经被鉴定为用于检测急性肾损伤的新型尿生物标记物 （12A）。

生物样品

本文所述方法和组合物涉及细胞分泌的前体与成熟miRNA的比 例，目的是监测其状态。方便地，所述比例可以通过取包含所述细胞 的分泌物的生物样品进行确定。

如果所述细胞包括在生物体中，则所述样品可以包括任何数目的 物质，包括但不限于基本上任何生物体的体液（包括但不限于血液、 鼻咽分泌物、尿液、血清、淋巴、唾液、直肠和阴道分泌物、汗液和 精液）。

制备外核体

外核体可以使用本领域技术人员已知的多种方法制备。通常，可 以将包含细胞分泌物的培养基在1000rpm下离心。然后，将上清液相 对1000kDa截留分子量的超滤膜浓缩。

替代地或者另外地，美国专利6,899,863描述了一种使用柱色谱法 制备膜载体（例如外核体）的方法。

外核体还可以使用Sze et al（17A）中所述的技术制备。

该方案可以简单地总结如下：为了收获MSC分泌物，将80%的 汇合的HuES9.E1培养物以磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，转移至化 学成分确定的无血清培养基进行过夜孵育，以PBS洗涤并在新鲜配制 的化学成分确定无血清培养基中培养三天。

收集包含MSC分泌物的所述条件培养基，通过离心澄清，使用 100-kDa MW截留的超滤膜（Satorius）浓缩50倍并通过过滤通过 220-nm滤器灭菌。

对用于分离和制备外核体的方法的更详细描述在本文他处给出。

制备miRNA

miRNA可以通过本领域技术人员已知的多种方式的任一种从由 细胞分泌物收集的外核体制备。制备miRNA的示例性方案如下：

通过将三倍体积的Trizol LS（Invitrogen）加入到一倍体积的条 件培养基并依照制造商的方案完成提取，从条件培养基分离RNA。

总RNA和小RNA分别使用Trizol（Invitrogen）和mirVana  miRNA Isolation Kit（AppliedBiosystems）纯化。

RNA是使用Quant-iTTM RiboGreen RNA Assay Kit（Invitrogen） 纯化并在含8%乙二醛或15%Novex Tris-borate-EDTA（TBE）-脲凝 胶（Invitrogen）的1.5%琼脂糖凝胶上分离。

在所述凝胶中的分离RNA是通过溴化乙啶（EB）染色来显示。

替代地或者另外地，将条件培养基以等体积的PBS、细胞裂解缓 冲液（Biovision）、40mM环糊精（Sigma-Aldrich）或4000U/ml 磷酸酯酶A2（Sigma-Aldrich）在37℃下预孵育30分钟，然后加入十 分之一体积的1-mg/ml RNase A（Roche）。然后，将这些混合物在37 ℃下再孵育5分钟。以Trizol LS提取RNA，并在TBE-脲凝胶上分离， 然后进行EB染色。

前体miRNA和成熟miRNA的定量

实施例详细描述了制备和分离miRNA的方案，所述miRNA可以 与本文所述方法和组合物的一块使用。用于本文所述方法和组合物的 miRNA还可以使用本领域技术人员已知的大量方法制备。

例如，可以使用测序、RNA印迹杂交、改良的Invader测定法、 实时PCR、环状引物RT-PCR和阵列杂交等检测和定量microRNA。 这些技术在下文有更详细描述。

可以对样品中microRNA进行测序，以鉴定并定量地解码样品中 全部的microRNA。这类服务由例如LC Sciences（www.lcsciences.com） 提供。

RNA印迹杂交已经被用于检测和定量miRNA，如L.et al.2003. Genes&Development 17:991-1008中所述。或者，RNA酶保护可以用 于该目的。用于RNA酶保护和RNA印迹杂交的探针可以通过本领域 技术人员已知的常规方式制备。试剂盒例如mirVana^TM miRNA Probe  Construction KitAM1550（Catalogue number AM1550,Ambion,Ap- plied Biosystems,Austin,Texas,USA）可用于该目的。

Allawi,H.T.et al.2004.RNA 10:1 153-1 161所述的改良的 Invader测定法还可以用于检测和定量miRNA。所述改良的Invader 测定法是定量、敏感且快速的miRNA测定法，可以成功用于分析 miRNA，使用少至50-100ng的总细胞RNA或少至1,000个裂解细胞。 该测定法能够区分具有单核苷酸差异的miRNA以及前体和成熟 miRNA。可以在未分级分离的洗涤剂裂解物中进行的Invader miRNA 测定法在微量滴定板中使用荧光检测，并且仅需要2-3小时的孵育时 间，使得可以在高通量筛查分析中平行分析多个样品。

对前体miRNA和成熟miRNA的检测和定量还可以通过本领域中 已知的多种方法（例如美国专利7,601,495（Chen）中描述的方法）实 现。再者，实施例详细描述了用于检测和定量成熟和前体miRNA的方 案，其可以与本文描述的方法和组合物一块使用。美国专利7,601,495 （Chen）的方法适合用于成熟miRNA。

用于检测和定量前体和成熟miRNA的大量试剂盒是可以市购的， 也可以使用这些试剂盒。这类试剂盒的实例有mirPremier^TM mi- croRNA Isolation Kit（Catalogue numbers SNC10和SNC50,Sigma- Aldrich,St.Louis,Missouri,USA）。可以用于分离和制备miRNA的 另一试剂盒是RNAqueous-Micro Kit（Catalogue No AM 1931,Am- bion,Applied Biosystems,Austin,Texas,USA）。

例如，miRNA检测和定量可以使用miRCURY LNA^TM Universal  RT microRNA PCR（Exiqon）进行。它包括即用型板，包含在384孔 PCR板中的预先分成等分的microRNA PCR引物组。加入cDNA并将 PCR主混合物加入所述孔，可以实现最高至730个microRNA的实时 PCR作谱。可以使用microRNA Ready-to-Use PCR,Human panel I+II, VI.M（Catalogue number 203601,Exiqon A/S,Vedbaek,Denmark） 或microRNA Ready-to-Use PCR,Human panel I+II,V 1.R（Catalogue  number 203602,Exiqon A/S,Vedbaek,Denmark），取决于检测装置。

作为替代，可以使用mirVana^TM qRT-PCR miRNA Detection Kit （Catalogue No AM 1558,Ambion,Applied Biosystems,Austin,Texas, USA）来检测和定量miRNA。

环状引物RT-PCR

例如，被称为环状引物RT-PCR的实时定量方法可以用于准确且 敏感地检测成熟miRNA。该测定法能够区分差异少至单核苷酸的两个 miRNA，以及成熟miRNA和其前体。

简而言之，使用mirVana miRNA Isolation Kit（Catalogue  number AMI 560或AMI 561,Ambion,Applied Biosystems,Austin, Texas,USA）从培养的细胞中纯化miRNA。

然后进行实时聚合酶链式反应。所述测定法包括两个步骤：反转 录和聚合酶链式反应。反转录步骤包括茎环反转录，其中茎环RT引 物退火至miRNA靶并在存在逆转录酶的情况下延伸。将包含RNA样 品、环状引物、1X缓冲液、逆转录酶和RNase抑制剂的RT反应物 各在16℃和42℃下孵育30分钟。

在聚合酶链式反应步骤中，进行实时PCR。microRNA特异性正 向引物、TaqMan探针和反向引物被用于PCR反应。实时PCR在 Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System上进行。对于数据 分析，基于合成lin-4miRNA的标准曲线估计每个细胞的拷贝数。 miRNA的定量是基于测量的CT值进行估计。

还可以进行RNA印迹分析。可以使用mirVanaTM miRNA De- tection Kit（Catalogue number AMI 552,Ambion,Applied Biosystems, Austin,Texas,USA）进行基于溶液杂交的RNA印迹分析。

图解该方法的简图如图13所示。

微阵列分析

miRNA检测和定量还可以通过微阵列杂交进行。可以使用的示例 性方案如下：

将RNA以Cy5或Cy3标记，并与预载的探针杂交。

使用标准数据分析对每个实验中的数据进行分析，包括确定可检 测信号、计算信号强度和计算差分率。首先，减去背景。使用基于回 归的背景作图方法确定背景。回归在排除空白点的最低强度数据点的 5-25%上进行。

然后，从原始数据矩阵减去背景矩阵。

背景减除后，使用LOWESS（局部加权回归）方法在减去背景的 数据上进行Cy3/Cy5通道归一化。

归一化可除去系统相关偏差，例如样品量差异、不同标记染料和 扫描仪的信号增益差异，使得生物学上的变异可以忠实地显示。

如果转录物符合至少两个条件，那么它被列为可检测的：信号强 度高于3(背景SD)和点CV＜0.5。CV通过(SD)/(信号强度)计 算。

当阵列上有重复探针时，仅当来自至少50％的重复探针的信号高 于检测水平时，转录物被列为可检测的。

微阵列杂交服务可以由商业化的提供商进行，例如LC Sciences (www.lcsciences.com)。该服务是使用μParaflo技术和专有引物设 计的全基因组microRNA(miRNA)表达作谱服务，这使得能够高敏 感且特异性地直接检测miRNA。可以使用用于在最新版本的Sanger miRBase数据库(Release 14.0)中可获得的所有物种的成熟miRNA 的标准阵列。

micro RNA

micro RNA(miRNA)可以选自：has-miR-424 (miRBase Accession Number：MI0001446)，hsa-miR-424^*(miRBase Accession Number： MI0001446)，hsa-miR-425(miRBase Accession Number：MI0001448)，hsa-miR-425^*(miRBase Accession Number：MI0001448)，hsa-miR-454(miRBase Accession Number： MI0003820)，hsa-miR-455-3p(miRBase Accession Number：MI0003513)，hsa-miR-483-5p (miRBase Accession Number：MI0002467)，hsa-miR-484(miRBase Accession Number： MI0002468)，hsa-miR-491-5p(miRBase Accession Number：MI0003126)，hsa-miR-503 (miRBase Accession Number：MI0003188)，hsa-miR-505^*(miRBase Accession Number： MI0003190)，hsa-miR-532-5p(miRBase Accession Number：MI0003205)，hsa-miR-574-15- 3p(miRBase Accession Number：MI0003581)，hsa-miR-584(miRBase Accession Number： MI0003591)，hsa-miR-612(miRBase Accession Number：MI0003625)，hsa-miR-625 (miRBase Accession Number：MI0003639)，hsa-miR-629(miRBase Accession Number： MI0003643)，hsa-miR-708(miRBase Accession Number：MI0005543)，hsa-miR-744 (miRBase Accession Number：MI0005559)，hsa-mir-766(miRBase Accession Number： MI0003836)，hsa-miR-768-3p(miRBase Accession Number：MI0005117)，hsa-miR-768-5p (miRBase Accession Number：MI0005117)，hsa-miR-769-5p(miRBase Accession Number： MI0003834)，hsa-miR-877(miRBase Accession Number：MI0005561)，hsa-miR-92，hsa-mir- 92a-1(miRBase Accession Number：MI0000093)，hsa-mir-92a-2(miRBase Accession  Number：MI0000094)，hsa-miR-92b(miRBase Accession Number：MI0003560)，hsa-miR-93 (miRBase Accession Number：MI0000095)，hsa-miR-98(miRBase Accession Number： MI0000100)，hsa-miR-99a(miRBase Accession Number：MI0000101)，hsa-miR-99b (miRBase Accession Number：MI0000746)，hsa-let-7a,hsa-let-7a-1(miRBase Accession  Number：MI0000060)，hsa-let-7a-2(miRBase Accession Number：MI0000061)，hsa-let-7a-3 (miRBase Accession Number：MI0000062)，hsa-miR-151-3p(miRBase Accession Number： MI0000809),hsa-miR-23a(miRBase Accession Number：MI0000079),hsa-let-7b(miRBase  Accession Number：MI0000063)，hsa-miR-151-5p(miRBase Accession Number： MI0000809)，hsa-miR-23a^*(miRBase Accession Number：MI0000079)，hsa-let-7b^*(miRBase Accession Number：MI0000063)，hsa-miR-152(miRBase Accession Number： MI0000462)，hsa-mir-23b(miRBase Accession Number：MI0000439)，hsa-let-7c(miRBase  Accession Number：MI0000064)，hsa-miR-155(miRBase Accession Number：MI0000681)， hsa-miR-24，hsa-mir-24-1(miRBase Accession Number：MI0000080)，hsa-let-7d(miRBase  Accession Number：MI0000065)，hsa-miR-15a(miRBase Accession Number：MI0000069)， hsa-miR-24-2^*(miRBase Accession Number：MI0000081)，hsa-20，let-7d^*，hsa-let-7d (miRBase Accession Number：MI0000065)，hsa-miR-15b(miRBase Accession Number： MI0000438)，hsa-miR-25(miRBase Accession Number：MI0000082)，hsa-let-7e(miRBase  Accession Number：MI0000066)，hsa-miR-16，hsa-mir-16-1(miRBase Accession Number： MI0000070)，hsa-mir-16-2(miRBase Accession Number：MI0000115)，hsa-miR-26a，hsa- mir-26a-1(miRBase Accession Number：MI0000083)，hsa-mir-26a-2(miRBase Accession  Number：MI0000750)，hsa-let-7f,hsa-let-7f-1(miRBase Accession Number：MI0000067)， hsa-let-7f-2(miRBase Accession Number：MI0000068)，hsa-miR-17(miRBase Accession  Number：MI0000071)，hsa-miR-26b(miRBase Accession Number：MI0000084)，hsa-let-7g (miRBase Accession Number：MI0000433)，hsa-miR-181a，hsa-mir-181a-2(miRBase  Accession Number：MI0000269)，hsa-miR-27a(miRBase Accession Number：MI0000085)， hsa-let-7i(miRBase Accession Number：MI0000434)，hsa-miR-181a^*，hsa-mir-181a-1 (miRBase Accession Number：MI0000289)，has-miR-27b(miRBase Accession Number： MI0000440)，hsa-miR-100(miRBase Accession Number：MI0000102)，hsa-miR-181a-2^*(miRBase Accession Number：MI0000269)，hsa-miR-27b^*(miRBase Accession Number： MI0000440)，hsa-miR-103，hsa-mir-103-2(miRBase Accession Number：MI0000108)，hsa- mir-103-1(miRBase Accession Number：MI0000109)，hsa-mir-103-1-as 3(miRBase  Accession Number：MI0007261)，hsa-mir-103-2-as(miRBase Accession Number： MI0007261)，hsa-miR-181b，hsa-mir-181b-1(miRBase Accession Number：MI0000270)，hsa- mir-181b-2(miRBase Accession Number：MI0000683)，hsa-miR-28-3p(miRBase Accession  Number：MI0000086)，hsa-miR-106a(miRBase Accession Number：MI0000113)，hsa-miR- 181c(miRBase Accession Number：MI0000271)，hsa-miR-28-5p(miRBase Accession  Number：MI0000086),hsa-miR-572(miRBase Accession Number：MI0003579)，hsa-miR- 106b(miRBase Accession Number：MI0000734)，hsa-miR-181d(miRBase Accession  Number：MI0003139)，hsa-miR-296-5p(miRBase Accession Number：MI0000747)，hsa-miR- 107(miRBase Accession Number：MI0000114)，hsa-miR-185(miRBase Accession Number： MI0000482)，hsa-miR-29a(miRBase Accession Number：MI0000087)，hsa-miR-574-5p (miRBase Accession Number：MI0003581)，hsa-25miR-10a,hsa-miR-186(miRBase  Accession Number：MI0000483)，hsa-miR-29c(miRBase Accession Number：MI0000735)， hsa-miR-575(miRBase Accession Number：MI0003582)，hsa-miR-122(miRBase Accession  Number：MI0000442)，hsa-miR-187^*(miRBase Accession Number：MI0000274)，hsa-miR- 30a(miRBase Accession Number：MI0000088)，hsa-miR-1224-5p(miRBase Accession  Number：MI0003764)，hsa-miR-18a(miRBase Accession Number：MI0000072)，hsa-miR- 30a^*(miRBase Accession Number：MI0000088)，hsa-miR-1228(miRBase Accession  Number：MI0006318)，hsa-miR-18b(miRBase Accession Number：MI0001518)，hsa-miR- 30b(miRBase Accession Number：MI0000441)，hsa-miR-1234(miRBase Accession Number： MI0006324)，hsa-miR-191(miRBase Accession Number：MI0000465)，hsa-miR-30c，hsa- mir-30c-2(miRBase Accession Number：MI0000254)，hsa-mir-30c-1(miRBase Accession  Number：MI0000736)，hsa-miR-1237(miRBase Accession Number：MI0006327)，hsa-miR- 191^*(miRBase Accession Number：MI0000465)，hsa-miR-30d(miRBase Accession Number： MI0000255)，hsa-miR-638(miRBase Accession Number：MI0003653)，hsa-miR-1238 (miRBase Accession Number：MI0006328)，hsa-miR-192(miRBase Accession Number： MI0000234)，hsa-miR-30e(miRBase Accession Number：MI0000749)，hsa-miR-663 (miRBase Accession Number：MI0003672)，hsa-miR-124，hsa-mir-124-1(miRBase  Accession Number：MI0000443)，hsa-mir-124-2(miRBase Accession Number：MI0000444)， hsa-mir-124-3(miRBase Accession Number：MI0000445)，hsa-mir-124b(miRBase  Accession Number：MI0000260)，hsa-miR-193a-5p(miRBase Accession Number： MI0000487)，hsa-miR-30e^*(miRBase Accession Number：MI0000749)，hsa-miR-671-5p (miRBase Accession Number：MI0003760)，hsa-miR-125a-3p(miRBase Accession Number： MI0000469)，hsa-miR-195(miRBase Accession Number：MI0000489)，hsa-miR-31 (miRBase Accession Number：MI0000089)，hsa-miR-30，hsa-mir-30c-2(miRBase Accession  Number：MI0000254)，hsa-mir-30c-1(miRBase Accession Number：MI0000736)，hsa-miR- 125a-5p(miRBase Accession Number：MI0000469)，hsa-miR-197(miRBase Accession  Number：MI0000239)，hsa-miR-31^*(miRBase Accession Number：MI0000089)，hsa-miR- 125b，hsa-mir-125b-1(miRBase Accession Number：MI0000446)，hsa-mir-125b-2(miRBase  Accession Number：MI0000470)，hsa-miR-198(miRBase Accession Number：MI0000240)， hsa-miR-320，hsa-mir-320a(miRBase Accession Number：MI0000542)，hsa-mir-320b-1 (miRBase Accession Number：MI0003776)，hsa-mir-320c-1(miRBase Accession Number： MI0003778)，hsa-mir-320b-2(miRBase Accession Number：MI0003839)，hsa-mir-320d-1 (miRBase Accession Number：MI0008190)，hsa-mir-320c-2(miRBase Accession Number： MI0008191),hsa-mir-320d-2(miRBase Accession Number：MI0008192)，hsa-mir-320e (miRBase Accession Number：MI0014234)，hsa-miR-765(miRBase Accession Number： MI0005116)，hsa-miR-126(miRBase Accession Number：MI0000471)，hsa-miR-199a-3p， hsa-miR-199a-3p(miRBase Accession Number：MI0000242),hsa-mir-199a-2(miRBase  Accession Number：MI0000281)，hsa-miR-324-5p(miRBase Accession Number： MI0000813)，hsa-miR-128，hsa-mir-128-1(miRBase Accession Number：MI0000447)，hsa- mir-128-2(miRBase Accession Number：MI0000727)，hsa-miR-199a875p，hsa-miR-328 (miRBase Accession Number：MI0000804)，hsa-miR-130a(miRBase Accession Number： MI0000448)，hsa-miR-199b-5p(miRBase Accession Number：MI0000282)，hsa-miR-330-3p (miRBase Accession Number：MI0000803),hsa-miR-130b(miRBase Accession Number： MI0000748)，hsa-miR-19b,hsa-mir-19b-1(miRBase Accession Number：MI0000074)，hsa- mir-19b-2(miRBase Accession Number：MI0000075)，hsa-miR-331-3p(miRBase Accession  Number：MI0000812)，hsa-miR-132(miRBase Accession Number：MI0000449)，hsa-miR- 20a(miRBase Accession Number：MI0000076)，hsa-miR-335(miRBase Accession Number： MI0000816)，hsa-miR-137(miRBase Accession Number：MI0000454)，hsa-miR-20b (miRBase Accession Number：MI0001519)，hsa-miR-342-3p(miRBase Accession Number： MI0000805)，hsa-miR-923(miRBase Accession Number：MI0005715)，hsa-miR-140-3p (miRBase Accession Number：MI0000456)，hsa-miR-21(miRBase Accession Number： MI0000077)，hsa-miR-345(miRBase Accession Number：MI0000825)，hsa-miR-143 (miRBase Accession Number：MI0000459)，hsa-miR-210(miRBase Accession Number： MI0000286)，hsa-miR-34a(miRBase Accession Number：MI0000268)，hsa-miR-145 (miRBase Accession Number：MI0000461)，hsa-miR-212(miRBase Accession Number： MI0000288)，hsa-miR-34a^*(miRBase Accession Number：MI0000268)，hsa-miR-145^*(miRBase Accession Number：MI0000461)，hsa-miR-214(miRBase Accession Number： MI0000290)，hsa-miR-361-5p(miRBase Accession Number：MI0000760)，hsa-miR-933 (miRBase Accession Number：MI0005755)，hsa-miR-146a(miRBase Accession Number： MI0000477)，hsa-miR-22(miRBase Accession Number：MI0000078)，hsa-miR-362-3p，5， hsa-miR-940(miRBase Accession Number：MI0005762)，hsa-miR-146b-5p(miRBase  Accession Number：MI0003129)，hsa-miR-22^*(miRBase Accession Number：MI0000078)， hsa-miR-362-5p(miRBase Accession Number：MI0000762)，hsa-miR-148b(miRBase  Accession Number：MI0000811)，hsa-miR-221(miRBase Accession Number：MI0000298)， hsa-miR-365，hsa-mir-365-1(miRBase Accession Number：MI0000767)，hsa-mir-365-2 (miRBase Accession Number：MI0000769)，hsa-miR-149(miRBase Accession Number： MI0000478)，hsa-miR-221^*(miRBase Accession Number：MI0000298)，hsa-miR-374b (miRBase Accession Number：MI0005566)，hsa-miR-149^*(miRBase Accession Number： MI0000478)，hsa-miR-222(miRBase Accession Number：MI0000299)，hsa-miR-421 (miRBase Accession Number：MI0003685)，hsa-miR-150^*(miRBase Accession Number： MI0000479)，hsa-miR-222^*and hsa-miR-423-5p(miRBase Accession Number：MI0001445).

在上文中：Accession Number为登录号。

所述miRBase数据库是已发表的miRNA序列和注释的可检索数 据库，可以通过http://www.mirbase.org进入。miRBase记载于以下论 文中：miRBase：microRNA sequences，targets and gene nomenclature. Griffiths-Jones S，Grocock RJ，van Dongen S，Bateman A，Enright AJ. NAR，2006，34，Database Issue，D140-D144；The microRNA Registry. Griffiths-Jones S.NAR，2004，32，Database Issue，D109-D111。如下出 版物提供了miRNA注释的指导原则：A uniform system for microRNA  annotation.Ambros V，Bartel B，Bartel DP，Burge CB，Carrington JC， Chen X，Dreyfuss G，Eddy SR，Griffiths-Jones S，Marshall M，Matzke  M，Ruvkun G，Tuschl T.RNA，2003，9(3)，277-279。

微阵列

本发明人描述了包含核酸序列的集合，所述核酸序列能够特异性 结合并区分上文所列每一miRNA的前体和成熟形式之。

所述核酸序列的集合可以方便地以有序方式排列。它们可以被连 接在基质上。例如，可以提供包含这类核酸集合的微阵列。

微阵列可以包括能够杂交于并检测前体形式的所述microRNA的 引物或探针集合，以及能够杂交于并检测成熟形式的所述microRNA 的引物或探针集合。

构建这类微阵列可以使用Sanger miRBase Release 10.1中列出的 miRNA转录物表。

前体miRNA与成熟miRNA的比例

前体miRNA与成熟miRNA的比例可以简单地计算为前体形式的 miRNA种类与成熟形式的miRNA种类的量的比例。

替代地或者另外地，已知不随细胞状态变化而改变的前体形式与 成熟形式的miRNA种类的比例可以用作内部对照。

因此，第一比例与第二比例的比例可以替代监测miRNA种类的前 体miRNA与成熟miRNA的比例或者与之一起，用于监测目的。在此， 所述第一比例是已知随细胞状态变化而改变的前体形式与成熟形式的 miRNA种类的比例，所述第二比值是已知不随细胞状态变化而改变的 前体形式与成熟形式的miRNA种类的比例。

前体miRNA与成熟miRNA的比例谱

还可以建立包含多个选择的miRNA种类的多个前体miRNA与成 熟miRNA的比例的谱来替代确定单个miRNA种类的前体与成熟 miRNA的比或者与其结合使用，所述谱中每个比例均指示细胞状态。 可以监测这类谱的变化，作为一种监测细胞状态的手段。所述谱可以 通过本领域中已知的任何方式建立，例如通过杂交于包含多个探针的 阵列，所述探针能够结合并区分前体和成熟形式的多个所选择的 miRNA种类。

其他用途

本发明人描述了一种检测细胞状态变化的方法。所述方法包括检 测所述细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或包含这类比例的 谱）的变化，其中这类变化指示细胞状态变化。

本发明人描述了一种确定细胞处于具体状态的方法。所述方法包 括将所述细胞的前体miRNA与成熟miRNA的比例（或包含这类比例 的谱）与已知处于该具体状态的细胞的前体miRNA与成熟miRNA的 比例（或包含这类比例的谱）进行比较。

本发明人描述了一种监测生物体状态的方法。所述方法包括从该 生物体获得样品或获得该生物体的样品，建立所述样品中miRNA种类 的前体mi-RNA与成熟mi-RNA的比例，从如此获得的前体miRNA 与成熟miRNA的比例建立所述生物体的状态。

本发明人描述了一种检测生物体状态的方法。所述方法包括从该 生物体获得样品或获得该生物体的样品，建立所述样品中miRNA种类 的前体mi-RNA与成熟mi-RNA的比例，并将如此获得的前体miRNA 与成熟miRNA的比例与已知患病生物体的或来自患病生物体的样品 的前体miRNA与成熟miRNA的比例进行比较。

本发明人描述了一种治疗或预防生物体疾病的方法。所述方法包 括如上文所述检测生物体的疾病，并将该疾病的治疗给予所述生物体。

实施例

实施例1至15描述了间充质干细胞的致癌转化。实施例16至25 描述了前/成熟miRNA的比例用作标记物来监测细胞状态的用途。

实施例1.材料和方法-huES9.E1MSC的致癌转化

将以前描述的来源自人ESC的huES9.E1MSC在第21代或p16 以携带c-myc基因或GFP基因的慢病毒感染，以生成两种类型的转染 细胞，分别是cmyc-MSC和GFP-MSC。使用引物PTDmyc（5′GAA TTC GAA TGC CCC TCA ACG TTA GC 3′）和PTDmyca（5′CTC GAG CGC ACA AGA GTT CCG TAG C 3′）从pMXs-hc-MYC[32] 扩增c-myc cDNA。将所扩增的片段插入pDrive载体并测序。将c-myc 片段消化并作为Xho1（filled）/EcoR1片段克隆至具有匹配末端的 Sma1/EcoR1消化的pLVX-puro载体中（Clontech, www.clontech.com）。慢病毒颗粒依照制造商的方案使用Lenti-X HT Packaging System（Clontech,www.clontech.com）产生。病毒效价使 用Lenti-X^TM qRT-PCR滴定试剂盒（Clontech,www.clontech.com）确 定。将在第21代感染的HuES9.E1hESC-MSC[24]以每10cm皿10⁶细 胞铺板，并在存在4μg/ml聚凝胺的情况下以MOI=5的病毒感染过夜。 第二天，将培养基替换为新鲜培养基。在感染后48小时通过将培养基 替换为包含嘌呤霉素（2μg/ml）的培养基开始选择。在选择3天后， 将细胞按照来源自人ESC的huES9.E1MSC进行扩增并将这些细胞合 并以生成E1-myc 21.1系。对于在第16代被感染的HuES9.E1 hESC-MSC[24]，将细胞铺板于6孔板的3个孔中。如上述对每个孔 进行病毒感染和随后的药物选择。通过有限稀释得到来自所述三个独 立感染的细胞培养物的每一个的克隆系。当所克隆的细胞扩增至10⁷个细胞（或汇合15cm培养皿），将所述细胞命名为p1。生成3个克 隆系，分别命名为E1-myc 16.1、E1-myc 16.2和E1-myc 16.3系。c-myc 或GFP转基因的整合是通过使用分别对c-myc的外显子2和外显子3 特异性的引物扩增基因组DNA进行确认：5′-GCCCCTGGTGCTCC ATGAGGAGACACC′-3′和5′-ACATTCTCCTCGGTGTCCG AGG-3′，使用如下的PCR条件：1个循环：94，2分钟；32个循环： 94℃，15秒；60℃，30秒，72℃，90秒；以及1个循环：72℃，5分 钟。将PCR产物在1%琼脂糖胶上分离。

myc-MSC向脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的分化是分别依照制造 商说明书使用脂肪发生、软骨形成和骨形成hMSC Differentiation  BulletKits,respectively（Lonza,Walkersville,MD）进行。由G带显 带进行的核型分析由Cytogenetics Laboratory,KKH进行。

实施例2.材料和方法-端粒末端转移酶活性

使用改良的Wege H.et al[33]描述的方法，通过SYBRGreen实 时定量端粒扩增方案测定测量相对端粒末端转移酶活性。简而言之， 收获3百万细胞并使用市售的哺乳动物细胞提取试剂盒（Cat K269-500-1,BioVision,www.biovision.com）制备细胞裂解物。用于 PCR扩增的试剂的组合物为1μg的蛋白细胞裂解物、10μl的2X SYBR Green Super Mix（Cat 170-8880,BioRad,Singapore），含0.1μg 的TS引物（5′-AATCCGTCGAGCAGACTT-3′）、0.1μg的ACX 引物（5′-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3′）和10mM EGTA，总体 积25μl。首先将所述反应物在25℃下孵育20分钟，以使所述细胞裂 解物中的端粒末端转移酶延长TS引物，然后在95℃下孵育2分钟以 失活端粒末端转移酶活性并变性所述引物。通过40个循环的95℃，30 秒；60℃，90秒的PCR扩增所述端粒末端转移酶产物。使用1μg蛋 白细胞裂解物的阈值循环数（或Ct值），相对于HEK293细胞评估所 述相对端粒末端转移酶活性。

实施例3.材料和方法-细胞周期速率

为了评估细胞周期速率，将2×10⁷个细胞以2ml的10μΜCFDA （Molecular Probe,Eugene,Or）的PBS溶液在37℃下预标记15分钟， 孵育24小时，然后以每孔5×10⁴个细胞重新铺板于涂敷有明胶的6 孔板中。在0、24、48和72小时，将细胞从两个平行孔中收获，在2% 低聚甲醛中固定，并在FACSplus（Becton Dickinson;San Jose,CA） 上进行分析。假定细胞荧光每次减半代表一次细胞分裂，每24小时计 算细胞周期数目。因此，每24小时的细胞周期数目（n）计算为n=lg （F-Fn）/lg2，其中F是初始平均细胞荧光，Fn是24小时后的平均细 胞荧光。然后，将细胞周期数目相对于时间作图，以推导每个细胞周 期的平均时间。

实施例4.材料和方法-表面抗原分析

Hus9E1和E1myc MSC上细胞表面抗原的表达是使用流式细胞术 进行分析。对所述细胞以胰蛋白酶处理5分钟，离心，再悬浮于培养 基中，并在37℃、5%CO₂的培养箱中于细菌培养皿中孵育1小时。 然后，将所述细胞收集、离心、在2%FBS中洗涤。然后，将2.5×10⁵个细胞在冰上与如下每一种缀合的单克隆抗体孵育60分钟：CD29-PE、 CD44-FITC、CD49a-PE、CD49e-PE、CD105-FITC、CD166-PE、 CD73-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、HLADR-PE和MHC1-PE （PharMingen,San Diego,CA）。在孵育后，将细胞洗涤并再悬浮于 2%FBS中。通过将类似的细胞等分试样与同种型匹配的小鼠单克隆抗 体（PharMingen,San Diego,CA）孵育来确定非特异性荧光。通过使 用CELLQuest软件在BD FACSCalibur^TM Flow Cytometer（BD Bio- sciences,San Jose,CA）装置上收集20,000个事件来进行数据分析。

实施例5.材料和方法-通过qRT-PCR分析RNA

使用qRT-PCR确定细胞的相对myc转录物水平。使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI,USA）将来自 GFP-MSC（p17）和E1myc-MSC（p24,p27,p29）的20ηg RNA转 换成cDNA。然后在StepOnePlus Real-Time PCR系统（Applied Bi- osystems,www.appliedbiosystems.com.sg）上以对myc或肌动蛋白特 异性的引物组通过以下方式扩增所述cDNA：1个循环：94，10分钟； 40个循环：94℃，15秒；60℃，60秒；以及1个循环：95℃，15秒， 60℃60秒，95℃，15秒。myc特异性引物组是 5′-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3′和5′-AGAAGGGTGTG ACCGC AACGTAG3′。

实施例6.材料和方法-Illumina基因芯片分析

从myc-MSC的不同传代制备总RNA，在技术上重复三次。使用 IlluminaTotalPrep RNA Amplification Kit，从p4、p7和p8的E1-myc 16.3细胞制备RNA，从p 15和p 16的亲本HuES9-E 1MSC制备RNA。 使用Illumina RNA Amplification Kit（Ambion,Inc.,Austin,TX）依 照制造商的说明书将500ηg RNA转换成生物素化的cRNA。依照所 述Illumina BeadStation 500x手册，将750ng的生物素化的cRNA杂 交于Sentrix HumanRef-8Expression BeadChip Version 3（Illumina, Inc.,San Diego,CA）并进行洗涤和扫描。使用Genespring GX 10分 析数据。通过移位至第75百分位数进行分位数归一化，并将所述归一 化的数据基线转化至所有样品的中位数。

实施例7.材料和方法-蛋白质印迹杂交

将蛋白在4-12%SDS-丙烯酰胺凝胶上分离，电转移至硝酸纤维素 膜上，封闭，以抗人CD9、ACTIN的一抗（Cruz Biotechnology,Santa  Cruz,CA,USA）和MYC（Abeam,Cambridge,MA）孵育。然后，将 所述印迹以辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG的抗体（Santa Cruz  Biotechnology,Santa Cruz,CA）孵育，随后以HRP增强的化学发光 底物（Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham,MA）孵育，然后暴露 于X射线胶片。

实施例8.材料和方法-HPLC纯化微粒

所述装置设置由以下设备组成：由来自Shimadzu Corporation （Kyoto,Japan）的Class VP软件操作的带有二元泵、自动注入器、 恒温柱箱和UV可见检测器的液相色谱系统。所使用的色谱柱是来自 Tosoh Corporation（Tokyo,Japan）的TSK Guard柱SWXL,6x40 mm和TSK凝胶G4000SWXL,7.8x300mm。如下检测器在所述UV 可见检测器后串联连接：Dawn 8（光散射）,Optilab（折射率）和QELS （动态光散射）。最后三个检测器来自Wyatt Technology Corporation （California,USA），并通过ASTRA软件进行操作。所述样品的组分 通过尺寸排阻进行分离，即大分子将先于较小分子洗脱。所使用的洗 脱缓冲液是含150mM的NaCl、pH 7.2的20mM磷酸缓冲液。将 该缓冲液过滤通过0.1μm的孔径并除气15分钟，然后使用。将所述 色谱系统以0.5ml/min的流速平衡，直至Dawn 8中的信号稳定在大约 0.3个检测器电压单位。将所述UV可见检测器设定在220ηm，将所 述柱箱平衡至25℃。洗脱模式是等度的，运行时间是40分钟。所注入 的样品体积是50至100μl。流体力学半径Rh是通过QELS和Dawn 8检测器进行计算。将在峰值下的最高读数速率（Hz）作为Rh。将在 220nm下出现的分离组分的峰收集，作为进一步表征研究的级分。

实施例9.材料和方法-测试分泌物的心脏保护

如以前所述[34]，通过在化学成分确定的无血清培养基中培养所述 转化的MSC三天，制备分泌物。简而言之，首先将p12的细胞在如上 述的包含血清的培养基中扩大。在p15，将80%汇合的细胞培养物以 PBS洗涤三次，然后在如下的化学成分确定的培养基中孵育过夜：由 无酚磺酞的DMEM（Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA）组成并 补加胰岛素、转铁蛋白和含硒蛋白（ITS）（Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA）、5ng/ml FGF2（Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA）、 5ng/ml PDGF AB（Peprotech,Rocky Hill,NJ）、谷氨酰胺-青霉素- 链霉素和β-巯基乙醇。然后，将所述细胞培养物以PBS洗涤，更换新 鲜的化学成分确定的培养基，继续3天，以产生条件培养基。将该CM 收集，通过在500x g下离心澄清。通过使用100kDa的膜截留分子量 正切流动过滤系统（Satorius,Goettingen,Germany）将所述澄清的CM 的体积减小到50分之一将它浓缩50倍。使用100kDa的膜截留分子 量可使MW小于100kDa的分子通过所述过滤器，导致小于100kDa 的分子优先丧失。然后，通过过滤通过220nm过滤器将所述浓缩的 CM灭菌。

在小鼠的缺血和再灌注损伤模型中测试所述CM。通过30分钟的 左冠状动脉（LCA）闭塞和随后再灌注诱导MI。在再灌注前5分钟， 对小鼠静脉输注从myc-MSC条件培养基纯化的0.3μg外核体蛋白的 200μl盐水溶液。对对照动物输注200μl盐水。在再灌注24小时后， 使用以前描述的伊凡斯蓝染料注射和TTC染色[27]评估风险面积 （AAR）的百分数作为梗塞面积（IS）。

实施例10.材料和方法-统计分析

将双尾ANOVA和事后Dunnett用于检验组之间梗塞面积的差异。 每一阵列组的相关系数使用皮尔森相关性检验进行评估。

实施例11.结果-转化huES9.E1MSC培养物

将第21代的HuES9.E1MSC以含GFP或含myc的慢病毒感染。 将所述感染的培养物在嘌呤霉素选择下放置三天。将存活细胞合并。 基因组DNA的PCR扩增证明，myc转基因成功地整合在基因组中（图 1A）。与被合并形成E1-myc 21.1系的myc转染的细胞不同，GFP 转染的细胞向老化发展，增殖速度减小并获得非常平的、宽大的形态 （图1B），不能繁殖超过p26。GFP转染的细胞（GFP-MSC）相比， myc-转化的细胞表达c-myc转录物水平增加至100倍（图1C），并表 达更高的端粒末端转移酶活性（图1D）。为了生成独立的克隆系，将 p16的三个HuES9.E1MSC培养物单独感染并置于嘌呤霉素药物选择 下。将存活的细胞培养物通过有限稀释克隆以生成3个谱系，分别是 E1-myc 16.1、E1-myc 16.2和E1-myc 16.3谱系。将所述谱系通过G 带显带确定核型。所有三个细胞系的细胞形态类似于E1-myc 21.1系 的细胞形态。仅E1-myc 16.3系具有46XX的亲本核型——在20/20 分裂中期中[24]在p11和q13之间有染色体9的臂间倒位，因此被用于 所有后续实验中（图1E）。与它们的亲本细胞不同，myc-转化的细胞 增殖更快速，有13小时的群体倍增时间，与之相对的未转化MSC的 群体倍增时间为19小时。通过使用以前所述的CFDA细胞标记[35]， 平均细胞周期时间从19小时减少到11小时（图1F）。所述转化的细 胞有效绕过衰老并继续保持它们的增殖速率至少再20个传代。转化的 细胞形状更小且更圆，具有突起的细胞核。这些细胞还失去接触抑制， 导致形成细胞簇（图1C）。与增殖的增加相一致，所述细胞与GFP 转染的或未转染的细胞相比具有更高水平的端粒末端转移酶活性（图 1E）。

实施例12.结果-评估myc-MSC

依照确定人MSC的ISCT最低标准评估myc-MSC培养物[31]。 如先前观察到的结果（图1C），所述培养物不附着于塑料培养皿以及 它们的未转化MSC，特别是在汇合时，这时所述细胞开始形成簇，而 不是以单层附着于所述塑料皿。myc-转化的细胞的表面抗原谱与它们 的亲本细胞十分相似，不同之处是它们阴性表达MHC I。所述细胞是 CD29⁺、CD44⁺、CD49a⁺、CD49e⁺、CD73⁺CD 105⁺、CD166⁺、MHC I^-、HLA-DR^-、CD34^-和CD45^-（图2）。接着检查多克隆E1-myc 21.1 和单克隆E1-myc 16.3细胞系的体外分化潜力（图3）。两个细胞系都 容易地分化成了软骨细胞和骨细胞（图3A、图3B），但未分化成脂 肪细胞。在MSC中诱导脂肪发生需要4个循环的6天治疗方案，由3 天暴露于诱导培养基和3天暴露于保持培养基组成。本发明人观察到， 暴露于诱导培养基诱导了myc-转化的细胞死亡，但不诱导未转化的亲 本细胞死亡（图3C）。这些结果表明，myc-转化的细胞不能发生成脂 分化。总之，这些结果证明，与其中myc转化被观察到不改变MSC 的功能特征的在先报道不同[29]，本发明人在本文中观察到c-myc转化 影响MSC的一种明确的性质，即进行脂肪发生的潜力。

实施例13.结果-基因表达谱

通过微阵列杂交对myc-转化的MSC和其亲本MSC进行基因组范 围的基因表达作谱，以评估所述细胞类型之间的亲缘关系。通过使用 来自p4、p7和p8的E1-myc 16.3MSC以及p15和p16的亲本 HuES9-E 1MSC的RNA，在Sentrix Human Ref-8Expression Bead- Chip version 3（Illumina,Inc.,San Diego,CA）上重复两次进行微阵 列杂交。不同传代的E1-myc 16.3MSC之间或不同传代的亲本 HuES9-E1 MSC之间的基因表达谱高度相似，相关值大于0.98。E1-myc 16.1MSC和亲本HuES9-E1MSC之间的相关系数r2也相对较高，为 0.92（图4A）。在E1-myc 16.1MSC中总共161基因上调至少2倍， 226基因下调至少2倍，表明myc转化后基因表达有变化。将这些差 异表达的基因通过PANTHER（Protein ANalysis THrough Evolu- tionary Relationships）[36,37]进行功能聚类，其中将在每个基因集合 中对每个生物过程观察的基因频率与参考频率相比较，所述参考频率 在该情形下是NCBI数据库中该生物过程的基因频率。对于161个上 调基因有11个过表达的生物过程，即代谢过程；核碱基、核苷、核苷 酸和核酸代谢过程；初级代谢过程；氨基酸转运；硫代谢过程；细胞 器组织；线粒体组织；过氧化物酶体转运；细胞氨基酸和衍生物代谢 过程；多聚磷酸盐分解代谢过程；以及蛋白质代谢过程。有4个低表 达过程：囊泡介导的转运、胞吐作用、细胞表面受体相关信号转导和 免疫系统进程（图4B）。在226个下调的基因中，有37个过表达生 物过程和1个低表达生物过程（图4C）。

对于上调基因，所述相关过表达过程中的许多对于增加用于细胞 分裂的细胞体积或合成代谢活性通常是重要的，并且与观察到的细胞 增殖活性增加是一致的。低表达过程，即囊泡介导的转运、胞吞作用， 表明外核体产生可能不受影响。对于下调的基因，所述37个过表达的 过程可能大致地分类成与粘着、分化、通信、免疫应答、细胞死亡和 代谢的过程。这些过程还与本发明人对myc转导的MSC的一些观察 结果一致，即对塑料的粘着降低、脂肪发生能力丧失和MHC I表达丧 失。

实施例14.结果-分泌物的心脏保护活性

myc-转化的MSC中的脂肪发生能力丧失表明，来源自ESC的 MSC的其他方面特征（例如产生治疗性外核体）也可以受到转化的损 害。本发明人以前已证明，由来源自ESC的MSC分泌的外核体在小 鼠的心肌缺血和再灌注损伤模型中是保护性的[27]。为了测试该方面是 否受到损害，将所述转化的细胞在化学成分确定的培养基中培养，收 获条件培养基（CM），并如以前所述[34,38]纯化外核体。虽然在所述 转化的细胞中c-myc转录物和蛋白水平增加，但是在所述CM和纯化 的外核体中未检测到c-myc蛋白（图5A）。所述CM的HPLC蛋白 质谱类似于来自未转化的MSC的CM[38]（图5B），最快洗脱级分 具有约12分钟的保留时间。对该峰的动态光散射分析显示存在流体力 学半径区间为50-65nm的颗粒。在常规运行中，本发明人常规地纯化 了约1.5mg的外核体/升条件培养基。将来自E1-myc 21.1或E1-myc 16.3的HPLC纯化的外核体分别以每只小鼠0.3或0.4μg的剂量给予 小鼠的心肌缺血-再灌注损伤模型（图5C）。风险面积（AAR）—— E1-myc 21.1外核体、E1-myc 16.3外核体或盐水处理的对照组中左心 室（LV）面积的百分数——是类似的，分别为39.1±3.4%、41.7±4.7% 和40.8±11.8%。以E1-myc 21.1外核体或E1-myc 16.3外核体处理的 小鼠中的相对梗塞面积（IS/AAR）分别是23.4±8.2%和22.6±4.5%， 它们的相对梗塞面积显著低于盐水处理小鼠中38.5±5.6%的相对梗塞 面积（分别p<0.001和p<0.002）。

实施例15.讨论

该报道描述了由过表达的c-myc基因转化来源自人ESC的MSC。 该转化使得所述细胞能够绕过衰老，增加端粒末端转移酶活性并增强 增殖。通常，所述转化的细胞与它们的亲本细胞之间的基因组范围的 基因表达是保守的，有0.92的相关系数。所述转化的细胞还具有特征 的表面抗原谱：CD29⁺、CD44⁺、CD49a⁺CD49e⁺、CD105⁺、CD166⁺、 MHC I^-、HLA-DR^-、CD34^-和CD45^-。虽然所述转化的细胞满足了对 人MSC的定义的ISCT最低标准[31]中的大部分基本要求，然而它们 具有改变的MSC表型。它们表现出对塑料粘着降低和不能发生脂肪发 生，作为强烈对比脂肪发生被报道是来源自人ESC的MSC的三种基 本MSC分化潜能中最强的[24]。因此，与观察到myc转化后MSC性 质基本无变化的以前的报道不同[29]，本发明人观察到了myc-转化的 细胞的一些基本变化，使得所述细胞不再满足对人MSC的定义的 ISCT最低标准[31]，并且在技术上不是MSC。虽然失去一种明确的 MSC性质，但所述myc-转化的细胞在小鼠缺血/再灌注损伤模型中继 续分泌能够减少梗塞面积的外核体。然而，本发明人注意到，在转化 后每个细胞分泌的外核体的量减少，但这一点可以通过较高增殖速度 或通过以更高细胞密度铺板细胞用于收获外核体而充分补偿。因此， c-myc转化代表了可实施的策略，确保无限提供用于产生作为治疗剂或 递送载体的外核体的细胞。另外，增殖速度增加可减少细胞生产的时 间，从而降低生产成本。

实施例16.材料和方法：构建和产生c-mcyc和GFP慢病毒载体

使用包含XhoI或EcoRI限制位点的引物从pMXs-hc-MYC扩增 c-myc cDNA序列（15A）。

然后，将所扩增的片段以XhoI或EcoRI切割，并克隆至 XhoI-EcoRI限制性的慢病毒载体——pLVX-puro（Clontech, www.clontech.com）。

然后，对所述重组载体测序以确认重组的myc序列。使用Lenti-X HT Packaging System（Clontech,www.clontech.com）依照制造商的方 案产生慢病毒颗粒。

病毒效价使用Lenti-X^TM qRT-PCR滴定试剂盒（Clontech, www.clontech.com）测定。

实施例17.材料和方法：转化MSC

将第22次传代的HuES9.E1hESC-MSC（14A）以包含c-myc或 GFP转基因的慢病毒感染。

将所述细胞以每10cm皿10⁶个细胞铺板。第二天，将所述细胞在 存在4μg/ml聚凝胺的情况下以MOI=5的病毒感染过夜。

第二天，替换培养基，在感染后48小时开始以嘌呤霉素（2μg/ml） 选择。

c-myc或GFP转基因的插入是通过使用分别对外显子2和3特异 性的引物扩增基因组DNA进行确认：5′- GCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACC-3′和5′- ACATTCTCCTCGGTGTCCGAGG-3′，使用如下的PCR条件：1个 循环：94，2分钟；32个循环：94℃，15秒；60℃，30秒，72℃，90 秒；以及1个循环：72℃，5分钟。

将PCR产物在1%琼脂糖胶上分离。

实施例18.材料和方法：端粒末端转移酶活性

使用改良的Wege H.et al描述的方法，通过SYBRGreen实时 定量端粒扩增方案测量相对端粒末端转移酶活性（16A）。

简而言之，收获3百万细胞病并使用市售的哺乳动物细胞提取试 剂盒（Cat K269-500-1,BioVision,www.biovision.com）制备细胞裂解 物。

用于PCR扩增的试剂的组合物为1μg的蛋白细胞裂解物、10μl 的2X SYBR Green Super Mix（Cat 170-8880,BioRad,Singapore）， 含0.1μg的TS引物（5′-AATCCGTCGAGCAGACTT-3′）、0.1μg 的ACX引物（5′-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3′）和10mM EGTA， 总体积25μl。

首先将所述反应物在25℃下孵育20分钟，以使所述细胞裂解物中 的端粒末端转移酶延长TS引物，然后在95℃下孵育2分钟以失活端 粒末端转移酶活性并变性所述引物。

通过40个循环的95℃，30秒；60℃，90秒的PCR扩增所述端粒 末端转移酶产物。使用1μg蛋白细胞裂解物的阈值循环数（或Ct值）， 相对于HEK细胞评估所述相对端粒末端转移酶活性。

实施例19.材料和方法：制备包含外核体的条件培养基

如以前所述从HuES9.E1MSC、（c-myc）MSC和（GFP）MSC 制备条件培养基（CM）（17A）。

简而言之，将80%汇合的HuES9.E1培养物以PBS洗涤，转移至 化学成分确定的无血清培养基进行孵育过夜，以PBS洗涤并在新鲜配 制的化学成分确定无血清培养基中培养三天。

将包含MSC分泌物的所述CM收集，通过离心澄清，使用100-kDa MW截留的超滤膜（Sartorius,www.sartorius.com）浓缩50倍并通过 过滤通过0.2μm滤器灭菌。

实施例20.材料和方法:分离RNA

通过将三倍体积的Trizol LS（Invitrogen,www.invitrogen.com） 加入至一倍体积的CM并依照制造商的方案完成提取，从CM分离 RNA。

来自MSC的总RNA和小RNA分别使用Trizol（Invitrogen, www.invitrogen.com）和mirVana^TM miRNA Isolation Kit（Applied  Biosystems,www.appliedbiosystems.com.sg）纯化。

RNA使用Quant-iTTM RiboGreen RNA Assay Kit（Invitrogen, www.invitrogen.com）纯化并使用在含8%乙二醛或15%Novex Tris-borate-EDTA（TBE）-脲凝胶（Invitrogen,www.invitrbgen.com） 的1.5%琼脂糖凝胶分离。

在所述凝胶中的分离RNA通过溴化乙啶（EB）染色显示。对于 一些实验，将CM以等体积的PBS、细胞裂解缓冲液（Biovision, www.biovision.com）、40mM环糊精（Sigma-Aldrich）或4000U/ml 磷酸酯酶A2（Sigma-Aldrich,www.sigmaaldrich.com）在37℃下预孵 育30分钟，然后加入十分之一体积的1mg/ml RNase A（Roche Applied  Science,www.roche-applied-science.com）。

然后，将这些混合物在37℃下再孵育5分钟。以Trizol LS提取 RNA，并在TBE-脲凝胶上分离，然后进行EB染色

实施例21.材料和方法：通过qRT-PCR分析RNA

使用qRT-PCR确定细胞的相对myc转录物水平。使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI,USA）将来自 GFP-MSC（p17）和E1myc-MSC（p24,p27,p29）的20ηg RNA转 换成cDNA。

然后在StepOnePlus Real-Time PCR系统（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）上以对myc或肌动蛋白特异性的引物 组通过1个循环：94，10分钟；40个循环：94℃，15秒；60℃，60 秒；以及1个循环：95℃，15秒，60℃60秒，95℃，15秒扩增所述 cDNA。

myc特异性引物组是5′-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3′和 5′-AGAAGGGTGTG ACCGC AACGTAG3′。

为了检测MSC或CM中的成熟miRNA，使用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）依照制造商的方案将10ng小RNA转 换成cDNA，再悬浮成15μl。

对每个RNA样品的PCR反应均在StepOne Plus Realtime PCR系 统（Applied Biosystems,www.appliedbiosystems.com.sg）中重复进行 三次，在20-μl反应体积中含1μl cDNA和10μl TaqMan 2X Universal  PCR Master Mix（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）。

热循环参数是1个循环的95℃，10分钟；接着40个循环的95℃， 15秒；然后1个循环的60℃，60秒。

所使用的引物是TaqMan引物：hsa-let-7b（Cat AB Assay ID 000378,AppliedBiosystems）和hsa-let-7g（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）。

为了对前体miRNA进行qRT-PCR检测，如前述使用Primer ExpressSoftware Version 3.0（AppliedBiosystems）设计所述引物 （18A）。

为了转换成cDNA，在12μl反应体积中将10ng的RNA样品与 10pmol的下游引物在80℃下变性5分钟。

然后将所述RNA和下游引物在60℃下退火5分钟，然后冷却至 室温。

如制造商所推荐加入5X反应缓冲液、dNTP、DTT、RNA酶抑制 剂和Thermoscript逆转录酶（Invitrogen,www.invitrogen.com）。将 所述反应混合物在60℃下孵育45分钟，然后在85℃下孵育5分钟。

然后，在20μl反应体积中，使用十分之一的含cDNA的反应混合 物和SYBR green PCR Master.Mix（AppliedBiosystems）进行PCR。

PCR参数是1个循环的在95℃下15秒和40个循环的在60℃下1 分钟。PCR反应重复三次。

hsa-let-7b前体miRNA（登记号MI0000063, http://microrna.sanger.ac.uk）的引物序列是5′TGAGGTAG- TAGGTTGTGTGGT3′和5′GGAAGGCAGTAGGTTGTATAG3′

对于hsa-let-7g前体miRNA（登记号MI0000137, http://microrna.sanger.ac.uk），引物序列是5′GTAGTAGTTT- GTACAGTTTGAGGGT3′和5′GGCAGTGGCCTGTACAGT3′。

实施例22.材料和方法：统计分析

统计显著性使用Student′s t检验进行分析。

实施例23.结果：通过c-myc转基因转化MSC

hESC-MSC能够以1:4平分比在培养物中广泛繁殖最多至25世代， 然后开始发生衰老。

将p22的HuES9.E1hESC-MSC以慢病毒载体转染c-myc基因或 GFP基因（图6）。如预计的，c-myc转染的MSC（myc-MSC）表达 比GFP转染的MSC（GFP-MSC）更高水平的c-myc mRNA（图7）。

在p23或转染后的一代，GFP-MSC培养物呈现衰老特征：更大的 和更扁平的细胞，同时繁殖或分裂细胞很少。相反，myc-MSC培养物 呈现致癌特征：失去接触抑制和存在大量较小的繁殖细胞。

不是作为粘着单层生长，myc-MSC形成具有多层细胞的聚集物 （图8）。

与GFP-MSC或亲本MSC不同，myc-MSC的端粒末端转移酶活 性显著更高（图9）。

实施例24.结果：前体microRNA与成熟microRNA的比例被转 化改变

本发明人以前报道了，相对于细胞miRNA群，对于至少两种 miRNA——hsa-let-7b和hsa-let-7g miRNA来说，分泌的miRNA群具 有较高的前体microRNA与成熟microRNA的比例。

为了确定转化是否影响hsa-let-7b和hsa-let-7g miRNA的该比例， 分别从myc-MSC和myc-MSC条件化的培养基制备分泌的RNA。

进行定量RT-PCR。

C-myc转化增加了hsa-let-7b miRNA的前体miRNA与成熟 miRNA的比例，但未增加hsa-let-7g miRNA的（图10）。

hsa-let-7b的前体miRNA与成熟miRNA的比例从2.5增加至7.1， 表明增加至2.8倍。

为了确定该比例变化是否是由于分泌物或细胞中前体miRNA和/ 或成熟miRNA的水平的变化，通过qRT-PCR确定这些水平。

实施例25.讨论

本发明人以前证明，hESC-MSC可分泌含RNA的外核体（Chen et  al.，印刷中）。

通过使用这些细胞条件化的培养基，本发明人观察到了，该CM 包含包裹在富含胆固醇的磷脂囊泡中的RNA，并且主要包含小RNA， 不存在大于500nt的可检测RNA。

所述外核体的小RNA包括miRNA，一些核糖体的RNA降解中间 产物和最可能的其他小非编码RNA，但不包括细胞中存在的更大量的 完整mRNA或核糖体RNA。

MSC外核体miRNA主要是前体而不是成熟形式，使得一些外核 体RNA（例如hsa-let-7b和hsa-let-7g miRNA）的前体miRNA与成熟 miRNA的比例显著超过细胞RNA。

在本文中，本发明人提出，前体miRNA与成熟miRNA的比例很 可能受细胞的生理或病理状态调节。

在本文中，本发明人证明了，分泌的hsa-let-7b miRNA的前体 miRNA与成熟miRNA的比例在以c-myc癌基因转化时升高，但分泌 的hsa-let-7g miRNA的未升高。

分泌miRNA的前体miRNA与成熟miRNA的比例的该选择性变 化可以被改编，以扩展鉴定作为癌症预测性和预后性标记物的独特循 环系统microRNA（miRNA）谱的现行做法（13A）（6A）。

使用前体miRNA与成熟miRNA的比例来评估分泌的miRNA或 循环系统miRNA将向现行循环系统miRNA的定性作谱引入定量成分， 并使生物样品和样品制备的固有变异最小化，并通常将增加基于前体 miRNA与成熟miRNA的比例的生物标记物的稳健性。

参考文献

1.Le Blanc K，Pittenger M(2005)Mesenchymal stem cells：progress toward promise. Cytotherapy 7：36-45.

2.Minguell JJ，Erices A(2006)Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac  disease.Exp Biol Med(Maywood)231：39-49.

3.Schuleri KH，Boyle AJ，Hare JM(2007)Mesenchymal stem cells for cardiac  regenerative therapy.Handb Exp Pharmacol：195-218.

4.Abdel-Latif A，Bolli R，Tleyjeh IM，Montori VM，Perin EC，et al.(2007)Adult  bone marrow-derived cells for cardiac repair：a systematic review and meta-analysis.Arch  Intern Med 167：989-997.

5.Mazhari R，Hare JM(2007)Advances in cell-based therapy for structural heart  disease.Prog Cardiovasc Dis 49：387-395.

6.Ohnishi S，Nagaya N(2007)Prepare cells to repair the heart：mesenchymal stem  cells for the treatment of heart failure.Am J Nephrol 27：301-307.

7.Behfar A，Terzic A(2007)Optimizing adult mesenchymal stem calls for heart  repair.J Mol Cell Cardiol 42：283-284.

8.Atsma DE，Fibbe WE，Rabelink TJ(2007)Opportunities and challenges for  mesenchymal stem cell-mediated heart repair.Curr Opin Lipidol 18：645-649.

9.Gnecchi M，He H，Liang OD，Melo LG，Morello F，et al.(2005)Paracrine action  accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells. Nat Med 11：367-368.

10.Caplan AI，Dennis JE(2006)Mesenchymal stem cells as trophic mediators.J Cell  Biochem 98：1076-1084.

11.Kinnaird T，Stabile E，Burnett MS，Shou M，Lee CW，et al.(2004)Local delivery  of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation 109：1543-1549.

12.Leedham SJ，Brittan M，McDonald SA，Wright NA(2005)Intestinal stem cells.J  Cell Mol Med 9：11-24.

13.Togel F，Hu Z，Weiss K，Isaac J，Lange C，et al.(2005)Administered  mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation- independent mechanisms.Am J Physiol Renal Physiol 289：F31-42.

14.Patschan D，Plotkin M，Goligorsky MS(2006)Therapeutic use of stem and  endothelial progenitor cells in acute renal injury：ca ira.Curr Opin Pharmacol 6：176-183.

15.Miyahara Y，Nagaya N，Kataoka M，Yanagawa B，Tanaka K，et al.(2006) Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med 12：459-465.

16.Gnecchi M，He H，Noiseux N，Liang OD，Zhang L，et al.(2006)Evidence  supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac  protection and functional improvement.Faseb J 20：661-669.

17.Mayer H，Bertram H，Lindenmaier W，Korff T，Weber H，et al.(2005)Vascular  endothelial growth factor(VEGF-A)expression in human mesenchymal stem cells：autocrine  and paracrine role on osteoblastic and endothelial differentiation.J Cell Biochem 95：827-839.

18.Nakagami H，Maeda K，Morishita R，Iguchi S，Nishikawa T，et al.(2005)Novel  autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured  adipose tissue-derived stromal cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol 25：2542-2547.

19.Van Overstraeten-Schlogel N，Beguin Y，Gothot A(2006)Role of stromal-derived  factor-1 in the hematopoietic-supporting activity of human mesenchymal stem cells.Eur J  Haematol 76：488-493.

20.Cheng L，Qasba P，Vanguri P，Thiede MA(2000)Human mesenchymal stem cells  support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34(+)hematopoietic progenitor  cells.J Cell Physiol 184：58-69.

21.Caplan AI，Dennis JE(2006)Mesenchymal stem cells as trophic mediators.J Cell  Biochem.

22.Liu CH，Hwang SM(2005)Cytokine interactions in mesenchymal stem cells from  cord blood.Cytokine 32：270-279.

23.Pittenger MF，Martin BJ(2004)Mesenchymal stem cells and their potential as  cardiac therapeutics.Circ Res 95：9-20.

24.Lian Q，Lye E，Suan Yeo K，Khia Way Tan E，Salto-Tellez M，et al.(2007) Derivation of Clinically Compliant MSCs from CD105+，CD24-Differentiated Human ESCs. Stem Cells 25：425-436.

25.Lai RC，Arslan F，Tan SS，Tan B，Choo A，et al.Derivation and characterization of  human fetal MSCs：An alternative cell source for large-scale production of cardioprotective  microparticles，J Mol Cell Cardiol.

26.Lai RC，Arslan F，Lee MM，Sze SK，Choo A，et al.(2010)Exosome secreted by  MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem Cell Res.

27.Timmers L，Lim S-K，Arslan F，Armstrong JS，Hoefler IE，et al.(2008)Reduction  of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned mediurn.Stem Cell  Research 1：129-137.

28.Chen TS，Lai RC，Lee MM，Choo AB，Lee CN，et al.(2010)Mesenchymal stem  cell secretes microparticles enriched in pre-microRNAs.Nucleic Acids Res 38：215-224.

29.Sun D，Zhuang X，Xiang X，Liu Y，Zhang S，et al.(2010)A Novel Nanoparticle  Drug Delivery System：The Anti-inflammatory Activity of Curcumin Is Enhanced When  Encapsulated in Exosomes.Mol Ther 18：1606-1614.

30.Nagai A，Kim WK，Lee HJ，Jeong HS，Kim KS，et al.(2007)Multilineage  Potential of Stable Human Mesenchymal Stem Cell Line Derived from Fetal Marrow.PLoS  ONE 2：e1272.

31.Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，Slaper-Cortenbach I，Marini F，et al.(2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International  Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy 8：315-317.

32.Kitamura T，Koshino Y，Shibata F，Oki T，Nakajima H，et al.(2003)Retrovirus- mediated gene transfer and expression cloning：powerful tools in functional genomics.Exp  Hematol 31：1007-1014.

33.Wege H，Chui MS，Le HT，Tran JM，Zem MA(2003)SYBR Green real-time  telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. Nucleic Acids Res 31：E3-3.

34.Sze SK，de Kleijn DP，Lai RC，Khia Way Tan E，Zhao H，et al.(2007)Elucidating  the secretion proteome of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells.Mol  Cell Proteomics 6：1680-1689.

35.Que J，Lian Q，El Oakley RM，Lim B，Lim SK(2007)PI3 K/Akt/mTOR-mediated  translational control regulates proliferation and differentiation of lineage-restricted RoSH stem  cell lines.J Mol Signal 2：9.

36.Thomas PD，Campbell MJ，Kejariwal A，Mi H，Karlak B，et al.(2003)PANTHER： a library of protein families and subfamilies indexed by function.Genome Res 13：2129-2141.

37.Thomas PD，Kejariwal A，Guo N，Mi H，Campbell MJ，et al.(2006)Applications  for protein sequence-function evolution data：mRNA/protein expression analysis and coding  SNP scoring tools.Nucleic Acids Res 34：W645-650.

38.Lai RC，Arslan F，Lee MM，Sze NS，Choo A，et al.(2010)Exosome secreted by  MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem Cell Res 4：214-222.

1A.Pan，B.T.and Johnstone，R.M.(1983)Fate of the transferrin receptor during  maturation of sheep reticulocytes in vitro：selective externalization of the receptor.Cell，33， 967-978.

2A.Simpson，R.J.，Lim，J.W.，Moritz，R.L.and Mathivanan，S.(2009)Exosomes： proteomic insights and diagnostic potential.Expert Rev Proteomics，6，267-283.

3A.Lakkaraju，A.and Rodriguez-Boulan，E.(2008)Itinerant exosomes：emerging  roles in cell and tissue polarity.Trends Cell Biol，18，199-209.

4A.Zoller，M.(2009)Tetraspanins：push and pull in suppressing and promoting  metastasis.Nat Rev Cancer，9，40-55.

5A.Cocucci，E.，Racchetti，G.and Meldolesi，J.(2009)Shedding microvesicles： artefacts no more.Trends Cell Biol，19，43-51.

6A.Rabinowits，G.，Gercel-Taylor，C.，Day，J.M.，Taylor，D.D.and Kloecker，G.H. (2009)Exosomal microRNA：a diagnostic marker for lung cancer.Clin Lung Cancer，10，42- 46.

7A.Al-Nedawi，K.，Meehan，B.and Rak，J.(2009)Microvesicles：messengers and  mediators of tumor progression.Cell Cycle，8，2014-2018.

8A.Pisitkun，T.，Shen，R.F.and Knepper，M.A.(2004)Identification and proteomic  profiling of exosomes in human urine.Proc Natl Acad Sci U S A，101，13368-13373.

9A.Hoorn，E.J.，Pisitkun，T.，Zietse，R.，Gross，P.，Frokiaer，J.，Wang，N.S.，Gonzales， P.A.，Star，R.A.and Knepper，M.A.(2005)Prospects for urinary proteomics：exosomes as a  source of urinary biomarkers.Nephrology(Carlton)，10，283-290.

10A.Adachi，J.，Kumar，C.，Zhang，Y.，Olsen，J.V.and Mann，M.(2006)The human  urinary proteome contains more than 1500 proteins，including a large proportion of membrane  proteins.Genome Biol，7，R80.

11A.Pisitkun，T.，Johnstone，R.and Knepper，M.A.(2006)Discovery of urinary  biomarkers.Mol Cell Proteomics，5，1760-1771.

12A.Zhou，H.，Pisitkun，T.，Aponte，A.，Yuen，P.S.，Hoffert，J.D.，Yasuda，H.，Hu，X.， Chawla，L.，Shen，R.F.，Knepper，M.A.et al.(2006)Exosomal Fetuin-A identified by  proteomics：a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.Kidney Int，70，1847- 1857.

13A.Taylor，D.D.and Gercel-Taylor，C.(2008)MicroRNA signatures of tumor- derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.Gynecol Oncol，110，13-21.

14A.Lian，Q.，Lye，E.，Suan Yeo，K.，Khia Way Tan，E.，Salto-Tellez，M.，Liu，T.M.， Palanisamy，N.，El Oakley，R.M.，Lee，E.H.，Lim，B.et al.(2007)Derivation of Clinically  Compliant MSCs from CD105+，CD24-Differentiated Human ESCs.Stem Cells，25，425- 436.

15A.Kitamura，T.，Koshino，Y.，Shibata，F.，Oki，T.，Nakajima，H.，Nosaka，T.and  Kumagai，H.(2003)Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning：powerful tools  in functional genomics.Exp Hematol，31，1007-1014.

16A.Wege，H.，Chui，M.S.，Le，H.T.，Tran，J.M.and Zern，M.A.(2003)SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase  activity.Nucleic Acids Res，31，E3-3.

17A.Sze，S.K.，de Kleijn，D.P.，Lai，R.C.，Khia Way Tan，E.，Zhao，H.，Yeo，K.S.， Low，T.Y.，Lian，Q.，Lee，C.N.，Mitchell，W.et al.(2007)Elucidating the secretion proteome  of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells.Mol Cell Proteomics，6， 1680-1689.

18A.Schmittgen，T.D.，Jiang，J.，Liu，Q.and Yang，L.(2004)A high-throughput  method to monitor the expression of microRNA precursors.Nucleic Acids Res，32，e43.

本文件中提及的每篇申请和专利，以及上述每篇申请和专利中引用 或参考的每篇文件(包括上述每篇申请或专利的审查过程中的引用或参考 的每篇文件每件申请和专利(“申请引用文件”)，以及在每篇上述申请和 专利中以及在任何申请引用文件中引用或提及的任何产品的任何厂商说 明书或目录)，均通过引用纳入本文。再者，本文中引用的所有文件，本 文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或提及的任何产品 的任何厂商说明书或目录，通过引用纳入本文。

只要不偏离本发明的范围和主旨，本发明所述方法和系统的多种 修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然本发明是结 合具体优选的实施方案来描述的，但应理解所要求保护的发明不应被 不适当地局限于这些具体的实施方案。事实上，对所述用于实现本发 明的模式的多种修改意欲被包括在权利要求的范围内，所述修改对分 子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的。