通过环己烷-1,2-二羧酸二甲酯的催化生物拆分制备(3aS,7aR)-六氢异苯并呋喃-1(3H)-酮

摘要

合成(3aS,7aR)-六氢异苯并呋喃-1(3H)-酮的方法，所述方法包括使环己烷-1,2-二羧酸二甲酯经酶促水解形成(1S,2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸。所述酶可来自于非哺乳动物来源。

说明书

技术领域

本申请涉及制备(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1(3H)-酮(1)的方法， 所述(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1(3H)-酮是合成(2S，3aR，7aS)-苄基八氢 -1H-吲哚-2-羧酸酯盐酸盐的中间体。

背景技术

现有的合成方法利用了猪肝酯酶。希望用源自非哺乳动物的酶来替 换这一方法中的猪肝酯酶。此外，由这一猪肝酯酶生物拆分(biological  resolution)获得的(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(4)仅具有80％e.e.， 这意味着需要盐提升作用(salt upgrade)来生产>98％e.e.的材料。一种 提供更高e.e.的产物的替代酶(从而消除方法中对盐提升作用的步骤的需 要)将更简单并将降低生产成本。此外，固定化酶的使用将有利于生物 催化剂的回收。

多篇专利和期刊文章公开了制备光学富集的2-(甲氧基羰基)环己烷 羧酸的方法。以下专利和文章所公开了环己烷-1，2-二羧酸二甲酯(2)的 猪肝酯酶催化生物拆分：美国专利号4,879,392；F.Brion等， “Stereoselective Synthesis of a trans-Octahydroindole Derivative，Precursor  of Trandolapril，an Inhibitor of Angiotensin Converting Enzyme”， Tetrahedron Letters，Vol.33，No.34，4889-4892页，1992；R.M.Borzilleri 等，“Total Synthesis of the Unusual Marine Alkaloid(-)-Papuamine Utilizing a Novel Imino Ene Reaction”，Journal of the American Chemical Society， Vol.117，10905-10913页，1995。

发明内容

本申请一方面提供了合成(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1-(3H)-酮(1) 的方法。一方面，本申请提供了制备(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸 (3)的方法，所述(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(3)为制备所述 (1)的中间体。

附图说明

图1为三种酶的序列表，所述三种酶被鉴定为Chirotech酯酶K、 Chirotech酯酶N和南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶。

具体实施方式

本申请一方面提供了合成(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(3)的 方法，所述方法包括环己烷-1，2-二羧酸二甲酯(2)的酶促水解。

本申请一方面提供了制备(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1-(3H)-酮(1) 的方法，所述方法包括(3)的还原环化。

本申请一方面提供了使用固定化酶制剂进行酶促水解的方法。

本申请一方面提供了使用固定化酶制剂的方法，所述固定化酶制剂 具有例如通过戊二醛处理而交联的基质。

本申请的多个方面提供了使用酶进行酶促水解的方法，所述酶例如 但不限于如下脂肪酶和丝氨酸酯酶中的任一种：Chirotech酯酶K或 Chirotech酯酶N(在图1中示出了这两种酶的序列表以及可用的天然 CAL-B酶的序列表)；来自Novozymes A/S的Novozym^TM 435、NZL-107 LYO和42044；来自Codexis的ICR-110CALB；来自Chiralvision的 CV-CALB和CALB-Y；以及角质酶。酶的混合物也同样可用。以任何物 理形式存在的酶都是可用的，例如，酶的溶液以及处于对酶加以固定的 树脂中的分散体。

在来源于南极假丝酵母的可用的酶中，包括下列文章中所描述的酶： J.Uppenberg等，“The Sequence，Crystal Structure Determination and  Refinement of Two Crystal Forms of Lipase B from Candida Antarctica”， Structure，Vol.2(4)，293-308页，1994；和J.Uppenberg等，“Crystallographic  and Molecular-Modeling Studies of Lipase B from Candida Antarctica  Reveal a Stereospecifity Pocket for Secondary Alcohols”，Biochemistry，Vol. 34(51)，16838-16851页，1995。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，使用Novozym^TM 435酶 进行酶促水解。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，底物浓度为约10-200g/L。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，底物浓度为至少约75 g/L。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，相对于底物的重量而言， 载酶量(enzyme loading)为约1％到约20％。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，相对于底物的重量而言， 载酶量小于约10％。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，酶促水解温度为约10℃ 到约50℃。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，酶促水解温度为约40℃。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，酶促水解pH为约6到约 9。

本申请的实施方式提供了如下方法，其中，酶促水解pH为约7到约 8。

本申请一方面提供了如下方法，其中，将水解酶直接加入至反应容 器中，待生物拆分完成后通过过滤进行回收，然后用新鲜的缓冲液进行 洗涤，并加入至新一批的底物/缓冲液中。

在实施方式中，新鲜的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

本申请一方面提供了如下方法，其中，使水解酶包含于柱反应器中， 通过该柱对一个生物拆分批次进行连续循环，待生物拆分完成后，将该 柱用新鲜的缓冲液进行洗涤，然后下一批底物/缓冲液可通过该柱进行循 环。

在实施方式中，新鲜的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

本申请一方面提供了如下方法，其中，使用氯甲酸C₁-C₆烷基酯，再 用硼氢化物(boron hydride)进行还原，使(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷 羧酸(3)还原环化。

本申请一方面提供了如下方法，其中，氯甲酸C₁-C₆烷基酯为氯甲酸 乙酯。

本申请一方面提供了如下方法，其中，硼氢化物为硼氢化钠。

在本文中，将酶Novozym^TM 435用来对酶水解方法进行示例。这一 产品为具有大孔丙烯酸树脂聚合基质的固定化颗粒状南极假丝酵母脂肪 酶B。Novozym 435并不是源自哺乳动物，而且能产生具有98％e.e.的产 物，从而消除了方法中对盐提升作用的步骤的需要。在实验中，这一酶 源(enzyme source)至少重复利用8次。

在本申请的实施方式中，(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1-(3H)-酮(1) 通过如下方法进行制备：首先用氯甲酸乙酯对(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环 己烷羧酸(3)进行处理，从而产生中间体混合酸酐，然后用硼氢化钠进 行还原产生相应的羟基酯，该羟基酯原位环化从而产生期望的顺式内酯 产物。

环己烷-1，2-二羧酸二甲酯(2)的Novozym^TM 435催化生物拆分产生 (1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(而非(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷 羧酸)。然而，在随后的合成步骤中，酸部分(而非酯部分)的还原使得 顺式内酯具有与使用猪肝酯酶得到的顺式内酯相同的立体化学。此外， 与本技术领域中已知的相比，生物拆分产生出具有明显更高e.e.的产物 (98％vs.80％)。Novozym^TM 435为固定化酶制备品，这使得生物催化剂 得以重复利用。非哺乳动物的酶适于重复利用并提供了较高e.e.的产物。 这消除了对为改善产物e.e.而进行的盐提升作用的需要。

定义

除非上下文另有说明，关于本申请的化合物使用下列定义。一般而 言，将给定基团中的碳原子数命名为“C_x-C_y”，其中x和y分别为下限 和上限。例如，命名为“C₁-C₆”的基团含有1-6个碳原子。如在本文定 义中使用的碳数是指碳骨架和碳支链(carbon branching)，但不包括取代 基(如烷氧基取代基等)的碳原子。

“烷基”是指含有所示数目碳原子的、可为直链或支链的烃链。在 未标明任何数值的情况下，“烷基”为其中具有1-6个(含端值)碳原子 的、直链或支链的链。C₁-C₆烷基基团的实例包括但不限于：甲基、乙基、 丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、 新戊基和异己基。

“氯甲酸C₁-C₆烷基酯”是指式R-O-C(O)-Cl的化合物，其中R为 C₁-C₆烷基基团。

“硼氢化物”为还原剂，将在酯存在的情况下对酸进行还原。硼氢 化物的实例包括但不限于：硼氢化钠、硼氢化锌、乙硼烷、BH₃/THF和 9-BBN。

术语“e.e.”意味着物质的对映体过量，该对映体过量被定义为各对 映体摩尔分数之间的绝对差，并以百分比表示。

作为Celite^TM出售的材料为经熔融煅烧的(flux-calcined)硅藻上。 Celite^TM为World Minerals Inc.的注册商标。GC为气相色谱。NMR为核 磁共振谱。MTBE为甲基叔丁基醚或2-甲氧基-2-甲基丙烷。Novozym^TMNZL-107LYO为真菌来源的脂肪酶。Novozym^TM 435为来自南极假丝酵 母的脂肪酶B的固定化形式。Novozym^TM为Novozymes A/S，Novo Industri A/S Bagsvaerd DK-2880 Denmark的注册商标。PLE为猪肝酯酶。Chirotech 酯酶K 310-903对酯、特别是羧酸酯的立体选择性水解进行催化。 Chirotech酯酶K 310-903为最初分离自长喙壳属(Ophiostoma)真菌的 重组酶。Chirotech酯酶N 310-902对酯、特别是羧酸酯的立体选择性水 解进行催化，并且是最初分离自长喙壳属真菌的重组酶。

实施例

参考下列实施例1和实施例2，将对本申请方法的某些方面进行更加 详细的解释，这些实施例仅出于说明的目的而提供，不应认为其以任何 方式限定了本公开的范围。

实施例1：(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(3)的制备

向100mL夹套式容器中放入环己烷-1，2-二羧酸二甲酯(2，4g， 20mmol)和39mL的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8)。将混合物在40℃下 连续搅拌，并加入Novozym^TM 435(320mg)。在40℃下连续搅拌43小 时，并通过添加2M NaOH溶液将pH维持在8。通过GC对来自该反应 中的样品进行分析以确认剩余的原料少于5％。将反应混合物进行过滤以 移出酶，并将滤液用甲苯(20mL)进行萃取，从而除去任何残余的原料。 将水相的pH用2M的HCl重新调节至3.5，然后用2×50mL的MTBE 进行萃取。将合并后的萃取物用硫酸镁进行干燥，然后在减压下进行浓 缩，从而产生3.2g的e.e.＝98％的无色油状(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷 羧酸(3)(86％)。将分离后的酶用新鲜缓冲液进行洗涤，以供第二批底 物/缓冲液再次使用。

¹H-NMR(d₆-DMSO)：12.17(brs；1H)，3.57(s；3H)，2.82-2.72(m；2H)， 1.97-1.79(m；2H)，1.79-1.59(m；2H)，1.48-1.26(m；4H)；¹³C-NMR (d₆-DMSO)：174.61，173.62，51.16，41.63，25.96，25.60，23.34，23.17。

GC分析条件为：Chirasil Dex-CB 25m×0.25mm柱；氦载气，20psi； 升温程序为在140℃下保持30分钟，然后以5℃/分钟至200℃，并保持 5分钟(约47分钟的运行时间)；检测器和注射器温度200℃；2-(甲氧基 羰基)环己烷羧酸(1S，2R)的保留时间为36.99分钟，2-(甲氧基羰基)环 己烷羧酸(1R，2S)的保留时间为37.28分钟。

实施例2：(3aS，7aR)-六氢异苯并呋喃-1-(3H)-酮(1)的制备

向冷却至0℃以下的25mL夹套式容器中放入处于THF(6.6mL) 中的(1S，2R)-2-(甲氧基羰基)环己烷羧酸(3，880mg，4.72mmol)和三 乙胺(659μL，4.72mmol)的溶液。将处于1.2mL THF中的氯甲酸乙酯 (512μL，4.72mmol)溶液经数分钟慢慢加入，然后将所得到的混合物 搅拌30分钟。通过过滤移除沉淀的三乙胺盐酸盐，并在12℃下将滤液滴 加至处于4.6mL水中的硼氢化钠悬浮液中。滴加完成后，将反应混合物 在20℃下继续搅拌3.5h。然后，将该反应混合物冷却至低于10℃，用 2M的HCl溶液酸化至pH 4，再用2×15mL的二氯甲烷进行萃取。将合 并后的有机萃取物用硫酸镁进行干燥，然后在减压下移除溶剂，从而产 生450mg的无色油状物。将材料通过短程蒸馏进行纯化，从而产生170 mg的e.e.＝98％且[α]D²⁰＝-39.3°(c1，甲醇)的无色油状物。

比较例：(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)-环己烷羧酸的制备

向设定在30℃下的2L夹套式容器中放入环己烷-1，2-二羧酸二甲酯 (2，84.6g，0.42mol)和900mL的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8)。将混 合物在30℃下不断搅拌，并加入PLE(600mg，10200单位)。将混合物 搅拌91小时，并通过添加5M NaOH溶液将pH维持在8。通过GC对来 自该反应中的小份试样进行分析以确认残余的原料少于5％。然后，将反 应混合物通过Celite^TM床进行过滤，并将滤液用250mL的MTBE进行萃 取，从而移除残余的原料。然后，用浓HCl将水相酸化至pH 4，并用3×500 mL的MTBE进行萃取。将合并后的萃取物用硫酸镁进行干燥，然后在 减压下移除溶剂，从而产生69.28g的e.e.＝79％的无色油状(1R，2S)-2-(甲 氧基羰基)环己烷羧酸(4)(产率88％)。

虽然已对本申请的特定实施方式进行了说明和描述，但对本领域技 术人员来说显而易见的是，可在不背离本公开的精神和范围的情况下作 出各种变化和改进。因此，打算在所附的权利要求书中覆盖落入本公开 范围内的所有此类变化和改进。