利用除草剂加倍玉米单倍体的方法及其专用除草剂

摘要

本发明公开了一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法及其专用除草剂。该玉米单倍体的加倍方法使用专用除草剂处理玉米单倍体，获得玉米二倍体；所述专用除草剂的有效成分为任意一种如下化合物：甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵。所述专用除草剂由所述专用除草剂的有效成分、助剂和水组成；所述助剂由二甲基亚砜和TWEEN-80组成或由二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮组成。本发明所提供的专用除草剂对环境的污染小，低毒、低残留、易降解，利用该专用除草剂滴心法处理玉米单倍体后死苗率为0，且该方法简便、高效，加倍率可达27.9％；利用该专用除草剂浸芽法处理玉米单倍体的加倍率可达17.9％，死苗率明显低于秋水仙素。本发明适合于规模化操作，可应用于玉米单倍体的规模化育种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法及其专用除草剂。

背景技术

基于诱导系的玉米单倍体育种技术，近些年来，其规模化应用，已成为与分子标 记辅助育种技术、转基因技术相媲美的现代玉米育种三大核心技术之一。玉米是唯一 利用遗传方法大规模培育单倍体的作物，但其自然和化学加倍率依然偏低，导致许多 农艺性状和产量性状优良的单倍体材料，由于未能加倍而丢失，造成较大的损失。

当前，玉米单倍体化学加倍主要使用秋水仙素，该方法存在着很多缺点：处理时 易形成嵌合体；导致植株异常生长、死苗、畸形；处理方法繁琐，不适合规模化应用； 秋水仙素有剧毒，易对环境造成污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用除草剂加倍玉米单倍体的方法及其专用除草剂。

本发明所提供的玉米单倍体的加倍方法为使用专用除草剂处理玉米单倍体，获得 玉米二倍体；所述专用除草剂的有效成分为任意一种如下化合物：甲基胺草磷、炔苯 酰草胺和氟乐灵。

所述处理为滴心法或浸芽法；所述滴心法包括如下步骤：在玉米单倍体植株3叶 期和5叶期的心叶中均加入专用除草剂A；所述浸芽法包括如下步骤：将所述玉米单 倍体籽粒的胚芽浸泡于专用除草剂B中；

所述专用除草剂A由所述专用除草剂的有效成分、助剂A和水组成，所述专用除 草剂B由所述专用除草剂的有效成分、助剂B和水组成；

所述助剂A由二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮组成，所述助剂B由二甲基亚砜和 TWEEN-80组成。

在所述专用除草剂A中，所述专用除草剂的有效成分的浓度为20～160μmol/L， 所述二甲基亚砜的浓度为0.01％～2％(质量百分含量)，所述TWEEN-80的浓度为0.01％～ 0.1％(质量百分含量)；所述噻酮的浓度为0.001～0.05％(质量百分含量)；

在所述专用除草剂B中，所述专用除草剂的有效成分的浓度为1～20μmol/L，所 述二甲基亚砜的浓度为0.01％～2％(质量百分含量)，所述TWEEN-80的浓度为0.01％～ 0.1％(质量百分含量)。

在所述专用除草剂A中，所述二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮的浓度具体可为：1％ (质量百分含量)、0.05％(质量百分含量)和0.025％(质量百分含量)；

在所述专用除草剂B中，所述二甲基亚砜和TWEEN-80的浓度具体可为：0.5％(质 量百分含量)和0.01％(质量百分含量)。

所述在玉米单倍体植株的3叶期和5叶期的心叶中均加入所述专用除草剂A的量 为1～2ml；所述浸芽法的浸泡条件如下：光照条件为黑暗，温度为15～18℃，时间为 6～12h，具体可为12小时。

本发明所提供的专用除草剂由所述专用除草剂的有效成分、助剂和水组成；所述 专用除草剂的有效成分为任意-种如下化合物：甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵；

所述助剂由二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮组成或由二甲基亚砜和TWEEN-80组成。

当所述助剂由二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮组成时，所述除草剂有效成分在所述 除草剂中的浓度为20～160μmol/L，所述二甲基亚砜在所述除草剂中的浓度为 0.01％～2％(质量百分含量)，所述TWEEN-80在所述除草剂中的浓度为0.01％～0.1％(质 量百分含量)，所述噻酮在所述除草剂中的浓度为0.001％～0.05％(质量百分含量)；

当所述助剂由二甲基亚砜和TWEEN-80组成时，所述除草剂有效成分在所述除草 剂中的浓度为1～20μmol/L，所述二甲基亚砜在所述除草剂中的浓度为0.01％～2％(质 量百分含量)，所述TWEEN-80在所述除草剂中的浓度为0.01％～0.1％(质量百分含量)。

当所述助剂由二甲基亚砜、TWEEN-80和噻酮组成时，所述除草剂有效成分在所述 除草剂中的浓度为20～160μmol/L，所述二甲基亚砜在所述除草剂中的浓度具体可为 1％(质量百分含量)，所述TWEEN-80在所述除草剂中的浓度具体可为0.05％(质量百 分含量)，所述噻酮在所述除草剂中的浓度具体可为0.025％(质量百分含量)；

当所述助剂由二甲基亚砜和TWEEN-80组成时，所述除草剂有效成分在所述除草 剂中的浓度为1～20μmol/L，所述二甲基亚砜在所述除草剂中的浓度具体可为0.5％ (质量百分含量)，所述TWEEN-80在所述除草剂中的浓度具体可为0.01％(质量百分 含量)。

所述玉米单倍体是通过包括如下步骤的方法得到的：以玉米单倍体诱导系为父本 给母本授粉，收获杂交当代籽粒，得到玉米单倍体。

所述父本为玉米单倍体诱导系Stock6，所述母本为先玉335。

本发明所提供的专用除草剂对环境的污染小，低毒、低残留、易降解，利用该专 用除草剂滴心法处理玉米单倍体后死苗率为0，且该方法简便、高效，加倍率可达 27.9％；利用该专用除草剂浸芽法处理玉米单倍体的加倍率可达17.9％，死苗率明显低 于秋水仙素。本发明适合于规模化操作，可应用于玉米单倍体的规模化育种。

附图说明

图1为玉米单倍体诱导及加倍过程图。其中，单倍体植株散粉情况图中的A为完 全可育植株，B为部分可育植株，C为完全不育植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用试剂的生产公司及纯度如下：

甲基胺草磷：西格玛-奥德里奇公司生产，纯度为98％；

炔苯酰草胺：西格玛-奥德里奇公司生产，纯度为98％；

氟乐灵：西格玛-奥德里奇公司生产，纯度为98％；

高金噻酮：有效成分为噻酮，新乡高金药业有限公司生产，纯度为99.57％。

下述实施例中除草剂溶液的摩尔浓度是以购买的甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐 灵中的有效成分计的。

实施例1、利用专用除草剂加倍玉米单倍体

(一)、玉米单倍体籽粒的获得

以玉米单倍体诱导系Stock6(美国高士得公司，Garst Seed Co)作为父本，先 玉335(敦煌种业先锋良种有限公司)作母本进行杂交(图1)。种子成熟、干燥后， 挑选紫顶白胚的籽粒，备用。

(二)、玉米单倍体的鉴定

1、遗传标记鉴定

基于Navajo遗传标记系统，以籽粒的紫顶和紫胚为显性标记。对收获的杂交种子 逐粒鉴定，紫顶白胚的籽粒为单倍体，紫顶紫胚的籽粒是正常杂交的二倍体，白顶白 胚是受花粉污染的二倍体种子，另还有少量的无胚种子。滴心法在单倍体幼苗期，根 据由Navajo基因控制的植株颜色鉴定单倍体，紫色植株为杂株，绿色植株为单倍体； 浸芽法在浸种后24小时第一次剔除紫胚的二倍体种子；发芽48小时后第二次剔除紫 根、胚芽鞘尖有紫点的二倍体种子，第三次在苗期挑出植株健壮、叶鞘紫色的二倍体 植株。

2、细胞学鉴定

在玉米单倍体幼芽时切取根尖进行细胞学压片，观察染色体数目。切取玉米根尖 2～3mm，放到饱和的对二氯苯水溶液中，浸泡3～4h，取出用卡诺固定液(95％乙醇∶ 冰醋酸＝3∶1)固定24h。转入70％的酒精，4℃冰箱中保存。用ddH₂O清洗数次，加入 纤维素酶(2％)和果胶酶(0.5％)的混合物，在28℃温箱中进行解离4～5h。压片， 在显微镜下观察染色体数目，并拍照。正常的玉米染色体数为2n＝20，单倍体的染色 体数为n＝10。

(三)、玉米单倍体的加倍

1、利用滴心法加倍玉米单倍体

将甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵三种除草剂分别按照表1的配方配制成浓度 为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L的水溶液。

取步骤(一)Stock6与先玉335杂交得到的紫顶白胚籽粒(图1)，种植于大田， 3叶期前剔除植株健壮、叶鞘紫色的二倍体植株。

当玉米单倍体植株生长至3叶期和5叶期时(图1)，分别将上述不同浓度的除草 剂水溶液(表1)滴入心叶，每株两个时期各滴1～2ml，叶心滴满即可，每个浓度除 草剂水溶液的处理做3次重复，每个重复设90株，以同期播种的未经滴心法处理的单 倍体为对照。

表1.滴心法加倍玉米单倍体的除草剂配方

2、利用浸芽法加倍玉米单倍体

(1)将步骤(一)中Stock6与先玉335杂交得到的玉米紫顶白胚籽粒浸种12h 后摆入湿毛巾，最后用塑料盘盖上，发芽48h。操作时湿毛巾使用蒸馏水500ml，玉米 籽粒胚全部朝上整齐摆放；发芽24h后第一次剔除紫胚的二倍体种子；发芽48h后第 二次剔除紫根、胚芽鞘尖有紫点的二倍体种子。

(2)将步骤(1)发芽48h的玉米籽粒胚芽鞘顶端切口，浸入不同浓度的除草剂 溶液(将除草剂甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵分别按照表2的配方配制成浓度为 1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L的水溶液)中低温(15～18℃)处理 12h。然后用清水清洗处理的胚芽30min(清洗时注意不要弄伤胚芽)后移入田间。操 作时胚芽鞘顶端切口时要注意不要伤及鞘内组织，处理要在暗箱中。每个处理3次重 复，每个重复90粒单倍体种子，以同期浸种发芽但未经除草剂溶液处理的单倍体为对 照。

(3)田间第三次挑除植株健壮、叶鞘紫色的二倍体植株。

表2.浸芽法加倍玉米单倍体的除草剂配方

(四)、加倍率统计

将经过滴心法或浸芽法处理的玉米单倍体植株的雄穗和雌穗分别套袋，人工进行 单株自交授粉。授粉前，取玉米单倍体植株的雄穗进行花粉活力分析，证明一部分植 株的花粉为完全可育，一部分为部分可育，一部分为完全不育(图1)。授粉后，在严 格隔离和严格人工自交授粉的条件下，统计滴心法和浸芽法中各处理和重复的单倍体 植株加倍成功获得结实果穗(图1)的植株数目，计算加倍率，结果见下表3和表4。

单倍体加倍率(％)＝(处理的单倍体植株中结实植株的数目/处理单倍体植株的数 目)×100％。

上述花粉活力分析方法为：玉米单倍体植株抽雄后，采集雄穗散粉的花药置于载 玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴0.2％ 的I-KI溶液，压片，于低倍显微镜下观察。正常花粉内含淀粉遇碘变蓝色，活力低的 花粉遇碘呈黄褐色。若花粉部分可染色，部分不被染色，说明花粉只有部分加倍成功， 表现为部分可育。

表3.不同浓度除草剂滴心法处理玉米单倍体的加倍效果统计

表4.不同浓度除草剂浸芽法处理玉米单倍体的加倍效果统计

(五)、不同处理方法对单倍体植株成活率影响的统计

田间观察表明(见表5)：不同浓度除草剂浸芽法处理单倍体成活率存在一定的差 异，1～20μmol/L甲基胺草磷处理过幼芽的成活率为80.00％～96.36％，1～20μmol/L 炔苯酰草胺处理过幼芽的成活率为75.44％～91.53％，1～20μmol/L氟乐灵处理过幼芽 的成活率为52.08％～83.33％，250.4～1502.1μmol/L秋水仙素浸芽法处理过幼芽的成 活率为36.00～60.00％；不同浓度除草剂滴心法处理单倍体植株成活率均为100％。

表5.不同方法处理玉米单倍体植株成活率统计表

(六)、结果分析：

本发明加倍成功的果穗籽粒种植后经表型鉴定(植株绿色，高度整齐一致的植株 为二倍体)和细胞学鉴定(同单倍体鉴定，染色体数为2n＝20为二倍体)均为二倍体。 本发明的除草剂滴心法处理玉米单倍体的加倍率最高可达到27.9％，浸芽法处理玉米 单倍体的加倍率最高可达到17.9％，明显高于对照自然加倍率的1.6％；与传统的利用 秋水仙素(一般有效浓度为250.4～1502.1μmol/L)加倍方法相比，浸芽法死苗率明 显低于秋水仙素；滴心法死苗率为0。