获得肾蕨属植物变异植株的方法及其在育种中的应用

摘要

本发明公开了一种获得肾蕨属植物变异植株的方法及其在育种中的应用。本发明提供的获得肾蕨属植物的变异植株的方法，包括如下步骤：将肾蕨属植物的绿色球状体用60Coγ射线进行辐照处理。本发明以60Coγ射线进行辐射诱变，提高了植株的变异率，且本发明以GGB作为辐照材料，短期内可以获得一定数量规模的辐照植株，有利于筛选获得变异植株，从而缩短了波士顿蕨的育种周期，克服了波士顿蕨传统育种方式周期长、变异率低的缺点。本发明将辐射诱变与组织培养技术相结合，可以在有限的时空内进行大量的筛选，从而提高辐射波士顿蕨诱变育种的效率，对于波士顿蕨的育种具有重大价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得肾蕨属植物变异植株的方法及其在育种中的应用。

背景技术

波士顿蕨，学名：Nephrolepis exaltata‘Bostoniensis’，英文名：Boston Fern， 属于肾蕨科肾蕨属，是高大肾蕨（Nephrolepis exaltata）的一个栽培种，是观赏蕨 类的一个重要类群。波士顿蕨以其优美的外形和良好的栽培特性，成为深受各国消费 者喜爱的一类室内观叶植物，具有较好市场前景。

自然条件下，蕨类植物主要通过孢子繁殖产生新植株，但是波士顿蕨不能产生孢 子，故不能通过孢子进行繁殖。目前，波士顿蕨主要通过组织培养进行繁殖，通常以 波士顿蕨匍匐茎茎尖作为外植体诱导得到绿色球状体（Green Globular Body，GGB）， GGB进一步分化将得到大量波士顿蕨幼苗。蕨类植物的GGB是指由部分种类的蕨类植 物的匍匐茎茎尖、根状茎侧芽等分生组织通过组织培养诱导得到的由众多绿色小体组 成的球状体，分化后可得到大量的蕨类植物幼苗，繁殖系数较高。

波士顿蕨有着100多年的栽培和育种历史，其传统的育种方式为芽变育种，即： 对波士顿蕨匍匐茎上的芽变植株进行选育，从而获得新的栽培品种。尽管波士顿蕨通 过芽变育种获得了众多新的栽培品种，但此方法存在育种周期长、筛选群体庞大等缺 点。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得肾蕨属植物变异植株的方法及其在育种中的应用。

本发明提供的获得肾蕨属植物的变异植株的方法，包括如下步骤：将肾蕨属植物 的绿色球状体用60Coγ射线进行辐照处理。

所述辐照处理的辐照剂量可为100-200Gy（如100-150Gy、150-200Gy、100Gy、 150Gy或200Gy）。

所述辐照处理的辐照剂量率可为10Gy/min。

所述肾蕨属植物的绿色球状体的制备方法具体如下：取肾蕨属植物的匍匐茎茎 尖，灭菌后接种于诱导和增殖培养基进行培养；所述诱导和增殖培养基为含有 1.0-3.0mg/L（如1.0-2.0mg/L、2.0-3.0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L或3.0mg/L）BA 和0.1-0.3mg/L（如0.1-0.2mg/L、0.2-0.3mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L或0.3mg/L）NAA 的1/2MS固体培养基。

所述灭菌的具体方法如下：将肾蕨属植物的匍匐茎茎尖先用溶液甲浸泡3秒，然 后用溶液乙浸泡5分钟。溶液甲的溶剂为水，含有体积百分含量为70%的乙醇。溶液 乙的溶剂为水，含有5g/100ml NaClO和0.1g/100ml Tween80。

所述培养的方法如下：20-25℃、每天的光照时间为12小时。

所述方法还包括如下步骤甲：完成所述辐照处理后，将肾蕨属植物的绿色球状体 接种至MS培养基，培养（每30d更换一次培养基）至成苗。所述培养的方法如下： 20-25℃、每天的光照时间为12小时。所述培养至成苗的时间具体可为120天。

所述方法还包括如下步骤乙：将所述步骤甲得到的苗移栽至培养基质并进行培 养。所述培养基质具体制备方法如下：将7体积份草炭和2体积份珍珠岩混合。

所述方法甲和所述方法乙之间还可包括炼苗的步骤。所述炼苗的时间具体可为3 天。所述炼苗过程中的培养条件具体如下：20-25℃，每天的光照时间为12小时

所述方法甲和所述方法乙之间还可包括如下步骤：将步骤甲得到的苗或炼苗后得 到的苗种植于草炭中,培养30天。所述培养的方法如下：20-25℃，每天的光照时间 为12小时。

所述肾蕨属植物可为高大肾蕨，具体可为波士顿蕨。

本发明还保护以上任一所述方法在肾蕨属植物育种中的应用。

所述肾蕨属植物可为高大肾蕨，具体可为波士顿蕨。

本发明以60Coγ射线进行辐射诱变，提高了植株的变异率，且本发明以GGB作为 辐照材料，短期内可以获得一定数量规模的辐照植株，有利于筛选获得变异植株，从 而缩短了波士顿蕨的育种周期，克服了波士顿蕨传统育种方式周期长、变异率低的缺 点。本发明将辐射诱变与组织培养技术相结合，可以在有限的时空内进行大量的筛选， 从而提高辐射波士顿蕨诱变育种的效率，对于波士顿蕨的育种具有重大价值。

附图说明

图1为波士顿蕨的匍匐茎茎尖。

图2为波士顿蕨的GGB。

图3为进行辐照处理前排布于培养皿中的波士顿蕨GGB。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。波士顿蕨：购于北京吉鼎立达科贸有限公司。

实施例1、利用波士顿蕨GGB进行辐射育种

一、波士顿蕨绿色球状体的制备

1、灭菌

取波士顿蕨幼嫩的匍匐茎茎尖（照片见图1），先用溶液甲浸泡3秒，然后用溶液 乙浸泡5分钟，用无菌水冲洗五次。

溶液甲的溶剂为水，含有体积百分含量为70%的乙醇。

溶液乙的溶剂为水，含有5g/100ml NaClO和0.1g/100ml Tween80。

2、制备绿色球状体

将完成步骤1的茎尖接种于培养基甲，20-25℃培养（每天的光照时间为12小时）， 30天后可以观察到茎尖开始有GGB产生，将GGB接种于新的培养基甲，每20-30d更 换一次培养基，可实现GGB的大量扩繁。GGB的照片见图2。

培养基甲（又称GGB诱导和增殖培养基）为含有1.0mg/L6-BA（6-苄氨基嘌呤） 和0.1mg/L NAA（a-萘乙酸）的1/2MS固体培养基。

二、波士顿蕨绿色球状体的辐射处理

将步骤一获得的GGB切成2mm大小，接种于装有培养基甲的培养皿中，沿直径所 在直线排列（照片见图3），用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处 理（辐照剂量为100Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

三、存活率、分化率和变异率的统计

1、分别将步骤二得到的GGB或步骤一得到的GGB接种至装有MS培养基的培养瓶 中，20-25℃培养，每30d更换一次培养基，将完成辐射处理的当天定义为第0天， 第60天统计GGB的存活率及分化率（分化的标志为：GGB上有幼叶长出），第120天 打开培养瓶瓶盖并炼苗3天；培养条件为20-25℃，每天的光照时间为12小时。

2、将步骤1得到的小苗种植于装有草炭的育苗盒内,20-25℃培养30天；培养 条件为20-25℃，每天的光照时间为12小时。

3、将步骤2得到的小苗移栽到花盆中（装有将7体积份草炭和2体积份珍珠岩 混合得到的基质），在温室中培养5个月后统计变异率。

步骤一得到的GGB进行上述处理后，形态如下：一回羽状复叶，复叶长30-50cm, 小叶披针形、羽状中裂、边缘褶皱，叶片为绿色。

步骤二得到的GGB进行上述处理后，如果某植株与正常植株的形态和叶色相比， 发生了变化，该植株为变异植株。形态变化列举如下：1）复叶长10-20cm，植株整 体变小；2）小叶叶片变小、小叶羽状浅裂；3）小叶阔披针形、羽状深裂至小叶叶脉、 边缘无褶皱。叶色变化列举如下：1）叶片白化。

结果见表1（三次试验的平均值）。

表1存活率、分化率及变异率

  存活率（%） 分化率（%） 变异率（%） 步骤一得到的GGB 100.00 100.00 0.00 步骤二得到的GGB 80.36 28.07 1.16

实施例2、利用波士顿蕨GGB进行辐射育种

一、波士顿蕨绿色球状体的制备

1、灭菌

同实施例1的步骤一的1。

2、制备绿色球状体

将完成步骤1的茎尖接种于培养基乙，20-25℃培养（每天的光照时间为12小时）， 30天后可以观察到茎尖开始有GGB产生，将GGB接种于新的培养基乙，每20-30d更 换一次培养基，可实现GGB的大量扩繁。

培养基乙为含有2.0mg/L6-BA和0.2mg/L NAA的1/2MS固体培养基。

二、波士顿蕨绿色球状体的辐射处理

将步骤一获得的GGB切成2mm大小，接种于装有培养基乙的培养皿中，沿直径所 在直线排列，用parafi lm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐照剂量 为150Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

三、存活率、分化率和变异率的统计

同实施例1的步骤三。

结果见表2（三次试验的平均值）。

表2存活率、分化率及变异率

  存活率（%） 分化率（%） 变异率（%） 步骤一得到的GGB 100.00 100.00 0 步骤二得到的GGB 40.35 11.67 2.63

实施例3、利用波士顿蕨GGB进行辐射育种

一、波士顿蕨绿色球状体的制备

1、灭菌

同实施例1的步骤一的1。

2、制备绿色球状体

将完成步骤1的茎尖接种于培养基丙，20-25℃培养（每天的光照时间为12小时）， 30天后可以观察到茎尖开始有GGB产生，将GGB接种于新的培养基丙，每20-30d更 换一次培养基，可实现GGB的大量扩繁。

培养基丙为含有3.0mg/L6-BA和0.3mg/L NAA的1/2MS固体培养基。

二、波士顿蕨绿色球状体的辐射处理

将步骤一获得的GGB切成3mm大小，接种于装有培养基丙的培养皿中，沿直径所 在直线排列，用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐照剂量 为200Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

三、存活率、分化率和变异率的统计

同实施例1的步骤三。

结果见表3（三次试验的平均值）。

表3存活率、分化率及变异率

  存活率（%） 分化率（%） 变异率（%） 步骤一得到的GGB 100.00 100.00 0 步骤二得到的GGB 7.55 3.77 3.13

对比例、利用波士顿蕨GGB进行辐射育种

一、波士顿蕨绿色球状体的制备

1、灭菌

同实施例1的步骤一的1。

2、制备绿色球状体

同实施例2的步骤一的2。

二、波士顿蕨绿色球状体的辐射处理

第一组：将步骤一获得的GGB切成3mm大小，接种于装有培养基丙的培养皿中， 沿直径所在直线排列，用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐 照剂量为50Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

第二组：将步骤一获得的GGB切成3mm大小，接种于装有培养基丙的培养皿中， 沿直径所在直线排列，用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐 照剂量为80Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

第三组：将步骤一获得的GGB切成3mm大小，接种于装有培养基丙的培养皿中， 沿直径所在直线排列，用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐 照剂量为220Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

第四组：将步骤一获得的GGB切成3mm大小，接种于装有培养基丙的培养皿中， 沿直径所在直线排列，用parafilm进行密封，然后采用60Coγ射线进行辐照处理（辐 照剂量为250Gy，辐照剂量率为10Gy/min）。

三、存活率、分化率和变异率的统计

同实施例1的步骤三。

结果见表4（三次试验的平均值）。

表4存活率、分化率及变异率

剂量（Gy） 存活率（%） 分化率（%） 变异率（%） 第一组 86.25 43.75 0.00 第二组 81.25 35.00 0.38 第三组 2.50 1.25 0.00 第四组 0.00 0.00 0.00