荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法及应用

摘要

本发明合成了一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶，其采用DNA作水凝胶网状框架与寡聚苯撑乙炔通过静电作用合成一种新型的DNA杂化水凝胶，合成方法简单，条件温和，该水凝胶能将寡聚苯撑乙炔有效包裹在DNA的网状结构中，阻碍其与细菌接触；该水凝胶可应用于调控杀菌方面，当其中加入脱氧核糖核酸酶时，DNA的网状结构被破坏，释放出寡聚苯撑乙炔，游离的寡聚苯撑乙炔可接近细菌或进入细菌中，在白光照射下产生单线态氧或活性氧物质，进而杀死细菌，利用脱氧核糖核酸酶，实现可控性的杀菌。

说明书

技术领域

本发明属于DNA杂化水凝胶的研究技术领域，特别涉及一种荧光DNA- 寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法及其在杀菌调控方面的新用途。

背景技术

凝胶态是一种近似于固态，其分子之间通过一些非共价作用力形成三维 网络结构而把溶剂分子固定在其中形成的。

近年来，脱氧核糖核酸（DNA）水凝胶在药物释放、组织工程、成像、医 疗设备、基因治疗、生物传感方面具有广泛的应用前景，水凝胶具有三维网 络结构，在水中能够吸收大量的水分溶胀，并在溶胀后继续保持其原有结构 而不被溶解。水凝胶类似于生命组织材料，在与血液、体液及人体组织相接 触时，表现出良好的生物相容性。

对于很多能够与之发生共轭聚合的电解质有很多文献报道，如有人提出 的水溶性共轭寡聚电解质，其中有的水溶性共轭寡聚电解质具有杀菌效果， 并且水溶性好，与细菌的细胞膜有很好的亲和性，进而导致细胞膜凝聚、裂 解甚至死亡。但是其制备方法复杂，而且用于杀菌时其杀菌过程都是不可控 制的，因此有待设计可控的释放杀菌剂的体系。

发明内容

本发明提供了一种合成方法简单且能将寡聚苯撑乙炔有效包裹的DNA- 寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法。

本发明还提供了上述DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶在调控杀菌方面的新用 途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：该荧光DNA-寡聚苯撑 乙炔水凝胶的合成由以下方法制备：

将DNA溶于浓度为0.01mol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解， 加入乙二醇二缩水甘油醚和寡聚苯撑乙炔溶液，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二 醇二缩水甘油醚的质量比为1：25～50：15～30，在超纯水中渗析10～30小 时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。

上述寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比优选为1：30～40：20～28。

上述DNA的分子量是1×10⁶～1×10⁷。

上述羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液的pH为6.8～8.2。

上述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶在调控杀菌方面的应用，其使用 方法如下：在菌类悬浮液中加入DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶和脱氧核糖核酸 酶，暗处孵化20分钟，白光照射30分钟。在1mg DNA-寡聚苯撑乙炔水凝 胶中添加10～100U的脱氧核糖核酸酶。

本发明合成了一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶，其采用DNA作水凝 胶网状框架与寡聚苯撑乙炔通过静电作用合成一种新型的DNA杂化水凝胶， 合成方法简单，条件温和，该水凝胶能将寡聚苯撑乙炔有效包裹在DNA的网 状结构中，阻碍其与细菌接触；该水凝胶可应用于调控杀菌方面，当其中加 入脱氧核糖核酸酶时，DNA的网状结构被破坏，释放出寡聚苯撑乙炔，游离 的寡聚苯撑乙炔可接近细菌或进入细菌中，在白光照射下产生单线态氧或活 性氧物质，进而杀死细菌，利用脱氧核糖核酸酶，实现杀菌的可控性。

附图说明

图1为未添加DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的空白培养板细菌分布照片。

图2为添加了DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的培养板细菌分布照片。

图3为添加了DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶和脱氧核糖核酸酶的培养板细 菌分布照片。

图4为实施例1合成的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的表面形貌扫描电镜照片。

图5为DNA的荧光显微镜相差图片。

图6为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的荧光显微镜相差图片

图7为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的荧光图片。

图8为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶水解的琼脂糖凝胶电泳照片。

具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明 不仅限于下述的实施方式。

实施例1

取原料寡聚苯撑乙炔1g为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是： 将35g分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、pH 为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA的 溶液，向其中加入25g乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将1g 寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙 炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油 醚的质量比为1：35：25，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙 炔水凝胶。

上述寡聚苯撑乙炔的制备方法，参考ACS物理化学快报“End-Only”中 公开的文献“功能化寡聚苯乙炔的合成，光物理性质及杀菌活性的研究” （Functionalized Oligo(phenylene ethynylene)s:Synthesis,Photophysical and  Biocidal Activity，The Journal of Physical Chemistry Letters，2010,1（21）， 3207-3212.）。

实施例2

取原料寡聚苯撑乙炔1g为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是： 将40g分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、pH 为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA的 溶液，向其中加入28g乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将1g寡 聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔 溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚 的质量比为1：40：28，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔 水凝胶。

实施例3

取原料寡聚苯撑乙炔1g为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是： 将30g分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、pH 为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA的 溶液，向其中加入20g乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将1g寡 聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔 溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚 的质量比为1：30：20，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔 水凝胶。

实施例4

取原料寡聚苯撑乙炔1g为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方 法是：将25g分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、 pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA 的溶液，向其中加入15g乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将 1g寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑 乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘 油醚的质量比为1：25：15，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑 乙炔水凝胶。

实施例5

取原料寡聚苯撑乙炔1g为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方 法是：将50g分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、 pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA 的溶液，向其中加入30g乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将 1g寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑 乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘 油醚的质量比为1：50：30，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑 乙炔水凝胶。

实施例6

在上述实施例1～5的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法中：将 分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、pH 为6.8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA 的溶液，然后加入乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将寡聚苯 撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液 加入上述DNA溶液中，在超纯水中渗析10小时，其它的步骤与相应实施例相 同，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。

实施例7

在上述实施例1～5的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法中：将 分子量为1×10⁶～1×10⁷的DNA（Sigma公司）溶于浓度为0.01mol/L、pH 为8.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司）溶液中至完全溶解，形成DNA 的溶液，然后加入乙二醇二缩水甘油醚（百灵威科技有限公司），再将寡聚苯 撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液 加入上述DNA溶液中，在超纯水中渗析30小时，其它的步骤与相应实施例相 同，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。

上述实施例1～7的方法所合成的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶（下述 简称DNA‐OPE）应用于调控杀菌体系中，现以大肠杆菌为例，其具体的使用 方法如下：

步骤1：挑取大肠杆菌的单克隆菌落置于5mL含50μg/mL卡那霉素 （Kana）的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养过夜（约12h），得到活化 的菌液，取活化菌液离心，0.9%NaCl溶液洗细菌三次，0.9%NaCl溶液悬浮 细菌，稀释至OD600nm=1.0。

步骤2：取三组100μL细菌悬浮液，第一组中加入400μL0.9%NaCl溶液， 室温暗处孵育20min，然后用白光照射样品30分钟（90mW/cm²），作为空白 实验；第二组中加入400μL0.9%NaCl溶液和浓度为2.5mg/mL的实施例1的 DNA‐OPE水凝胶溶液40μL，室温暗处孵育20min，然后用白光照射样品30 分钟（90mW/cm²），作为对比实验；第三组中加入400μL0.9%NaCl溶液和浓 度为2.5mg/mL实施例1的DNA‐OPE水凝胶溶液40μL与10U的脱氧核糖核 酸酶（DNase），室温暗处孵育20min，然后用白光照射样品30分钟（90 mW/cm²）；

步骤3：将上述三组的菌液连续稀释6×10⁴倍，分别取100μL的大肠 杆菌（E.coli）菌液涂布于固体LB培养板上，37℃孵育12～14h，琼脂糖固体 培养基的直径为90mm，计数培养板上形成的细菌克隆数，计算公式为：

结果见表1。

表1为三组对比实验在培养板上形成的细菌克隆数

由表1可知，水凝胶本身的杀菌率仅为21.61%，而加入脱氧核糖核酸酶 （DNase）后，杀菌率能够达到100%，由此可以表明，在加入脱氧核糖核酸 酶后水解水凝胶的框架释放出寡聚苯撑乙炔（OPE），实现杀菌，进而实现可 调控杀菌。

将上述的三组实验的培养板用相机拍照，观察细菌分布，结果见图1，图2，图3。

由图1和图2、图3对比可知，向细菌悬浮液中加入DNA‐OPE水凝胶溶 液，细菌减少量很少，即杀菌率很低；向细菌悬浮液中加入DNA‐OPE水凝胶 溶液和脱氧核糖核酸酶，细菌全部死亡，即杀菌率为100%。表明脱氧核糖核 酸酶诱导的DNA‐OPE水凝胶的可控性杀菌可以实现。

上述脱氧核糖核酸酶（DNase）的添加量根据DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶 的量来确定，具体为1mg DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶中可以添加10～100U 的脱氧核糖核酸酶。

同样的，本发明的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶还能用于调控枯草芽孢杆 菌、金黄葡萄球菌等。

为了进一步验证本发明的有益效果，发明人以实施例1所合成的DNA- 寡聚苯撑乙炔水凝胶（DNA‐OPE）为例，通过大量的实验研究，具体如下：

1、将实施例1所制备的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶用扫描电镜观察其表 面形貌，结果见图4。

由图4可看出，DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶（DNA-OPE）水凝胶是微米 大小的多孔网状结构。

2、将实施例1所制备的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶用荧光显微镜观察其 光学性质，并与DNA进行比较，结果参见图5，图6，图7，其中：图5为 DNA的荧光显微镜相差图片，图6为DNA-OPE水凝胶的荧光显微镜相差图 片，图7为DNA-OPE水凝胶的荧光图片。

由图5和图6、图7对比可知，DNA和DNA-OPE水凝胶均为网状结构， 不同的是，DNA-OPE水凝胶的网状框架明显比DNA的粗，且图7的荧光图 片显示，DNA-OPE水凝胶框架带蓝色荧光，正好是OPE的荧光颜色。所以， DNA-OPE水凝胶成功合成并且带有荧光性。

3、水解实验

取实施例1所制备的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶0.1mg与10U的脱氧核 糖核酸酶加入缓冲液（40mmol/L三羟甲基氨基甲烷‐盐酸，8mmol/L氯化镁， 5mmol/L二硫苏糖醇）中，室温反应30分钟，Marker I和上述样品在2%的 琼脂糖凝胶中，以0.5×TBE为缓冲，电压80V的电泳仪中电泳35min，用凝 胶成像系统拍照，参见图8。

由图8可知，原始的DNA和DNA-OPE水凝胶均可被脱氧核糖核酸酶 （DNase）水解，说明通过加入脱氧核糖核酸酶（DNase）使DNA-OPE水凝 胶水解。