基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器及其制备方法，该DNA电化学传感器为具有工作电极、辅助电极和参比电极的三电极体系传感器，该工作电极为共价固定了5’-末端修饰氨基的单链探针DNA后的靛蓝胭脂红聚合膜修饰玻碳电极。本发明具有响应时间短、检测限低、稳定性和重现性好的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及电化学传感器领域，更具体的说涉及一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器及其制备方法。

背景技术

DNA生物传感器在基因序列分析、疾病诊断、环境监测等方面具有重要的作用，其中电化学DNA生物传感器因具有简单、快速、灵敏、低成本和易于微型化等优点，已成为生物分析领域的研究热点。

电化学DNA生物传感器大致可分为两大类：电化学DNA杂交生物传感器和非基因识别的电化学DNA传感器，其中电化学DNA杂交生物传感器测定DNA的过程包括DNA探针的固定、杂交过程、杂交的指示和电化学信号的检测4个步骤。对于DNA电化学传感器，探针的固定量和活性直接影响着传感器的灵敏度，为了在电极表面有效连接DNA，保持其待测分子的特异性和结合活性，往往需要借助有效的物理或化学方法。目前DNA固定方法主要有直接吸附法、自组装膜法、亲和素-生物素反应系统固定法、直接共价键合法和聚合膜法。聚合物薄膜法固定DNA具有所含电活性中心的浓度大、有三维可利用场势、性能稳定、不溶不熔以及修饰方法简单等优点。

靛蓝胭脂红（IC），又叫靛蓝二磺酸钠，具有很好的电活性和光学性质。有文献报道，采用电化学聚合制备了聚靛蓝胭脂红膜，并通过静电吸附固定辣根过氧化酶，构建了一种新型的酶电极；也有文献曾制备了一种聚吡咯-靛蓝胭脂红复合膜并用于多巴胺和抗坏血酸的同时测定，但是，目前还未见有基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器制备的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器，其具有响应时间短、检测限低、稳定性和重现性好的特点。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器，为具有工作电极、辅助电极和参比电极的三电极体系传感器，其中，该工作电极为共价固定了5’-末端修饰氨基的单链探针DNA后的靛蓝胭脂红聚合膜修饰玻碳电极。

进一步，该辅助电极为铂电极，该参比电极为Ag/AgCl电极。

本发明的第二目的在于提供一种制备上述基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器的方法，其包括如下步骤：

①采用循环伏安法在玻碳电极修饰上靛蓝胭脂红聚合膜，得到聚靛蓝胭脂红修饰电极；

②将聚靛蓝胭脂红修饰电极通过五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基团，与5’-末端修饰氨基的单链探针DNA发生共价缩合作用，得到探针序列修饰电极；

③将探针序列修饰电极与铂电极和Ag/AgCl电极一起形成三电极体系电化学DNA传感器。

进一步，在步骤①中，该玻碳电极在采用循环伏安法修饰靛蓝胭脂红聚合膜之前还经过预处理步骤，该预处理步骤为采用粒径为1.0、0.3和0.05μm的α-Al₂O₃抛光粉打磨成镜面后, 再分别在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗3分钟，重复2~3次，再将电极置于0.5 mol/L 的H₂SO₄溶液中用循环伏安法连续扫描至稳定，扫描范围-1.0~+1.0 V。

进一步，该步骤①为将经过预处理过的玻碳电极置于含5 mmol/L 靛蓝胭脂红的pH7.0混合磷酸盐缓冲液中进行循环伏安法扫描电聚合，聚合电位-0.1~+1.8 V，扫速20 mV/s，扫描段数为10段；聚合完后在混合磷酸盐缓冲液中浸泡5分钟并用二次蒸馏水洗涤，得到聚靛蓝胭脂红修饰电极。

进一步，该步骤②为将聚靛蓝胭脂红修饰电极在40 mmol/L 五氯化磷丙酮溶液中浸泡30分钟活化磺酸根得到酰氯化磺酸基团后，取10 μL、1×10^-6 mol/L的5’-末端修饰氨基的单链探针DNA滴于电极表面自然晾干，用TE缓冲液洗去未固定的5’-末端修饰氨基的单链探针DNA得到探针序列修饰电极。

采用上述结构后，本发明涉及的一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器及其制造方法，其采用循环伏安法将靛蓝胭脂红电聚合在玻碳电极表面，通过五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基团，与5’-末端修饰氨基的单链探针DNA的氨基共价缩合作用实现探针的固定，最后再结合铂电极和Ag/AgCl电极，从而形成具有响应时间短、检测限低、稳定性和重现性好的DNA电化学传感器。

附图说明

图1为玻碳电极在含有5mmol/L 靛蓝胭脂红的混合磷酸盐缓冲液（pH7.0）中的连续循环伏安图（扫速：20 mV/s）；

图2A和图2B为5.0mmol/L、K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和0.1 mol/L氯化钾混合液在裸GCE（a）、PIC/GCE（b）和S1/PIC/GCE（c）上的循环伏安图和交流阻抗图；

图3为1×10^-4 mol/L亚甲基蓝在S1/PIC/GCE上富集不同时间的差分脉冲伏安图（a到l分别为：4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48分钟）；

图4为亚甲基蓝在S1/PIC/GCE上的不同扫速循环伏安图（a到k依次是：20，40，60，80，100，150，200，300，400，500 mV/s），插图为氧化还原峰电流值（I_p）与扫描速率（v）的线性关系图；

图5为S1与不同浓度S2杂交亚甲基蓝的差分脉冲伏安图（a到h分别为：0，1×10^-9，1×10^-10，1×10^-11，1×10^-12，1×10^-13，1×10^-14，1×10^-15 mol/L）；

图6 为S1/PIC/GCE与不同序列DNA杂交差分脉冲伏安曲线氧化峰电流值柱状图。

具体实施方式

为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。需要说明的是，本发明中的电化学试验在CHI650C型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）上进行的。

本发明涉及一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器，为三电极体系传感器，即具有工作电极、辅助电极和参比电极，其中，该辅助电极为铂电极，该参比电极为Ag/AgCl电极，该工作电极为以玻碳电极为基底的为S1/PIC/GCE，即共价固定了5’-末端修饰氨基的单链探针DNA后的靛蓝胭脂红聚合膜修饰玻碳电极。

本发明还提供一种制备上述的基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器的方法，该方法包括如下步骤：

①采用循环伏安法在玻碳电极修饰上靛蓝胭脂红聚合膜，得到聚靛蓝胭脂红修饰电极；具体地，该玻碳电极在采用循环伏安法修饰靛蓝胭脂红聚合膜之前还经过预处理步骤，该预处理步骤为采用粒径为1.0、0.3和0.05μm的α-Al₂O₃抛光粉打磨成镜面后, 再分别在丙酮、乙醇和二次水中超声清洗3分钟，重复2~3次，再将电极置于0.5 mol/L 的H₂SO₄溶液中用循环伏安法连续扫描至稳定，扫描范围-1.0~+1.0 V，如此即得到了干净的裸玻碳电极，记为GCE；

具体地，该步骤①为将经过预处理过的玻碳电极置于含5 mmol/L 靛蓝胭脂红的pH7.0混合磷酸盐缓冲液中进行循环伏安法扫描电聚合，聚合电位-0.1~+1.8 V，扫速20 mV/s，扫描段数为10段；聚合完后在混合磷酸盐缓冲液中浸泡5分钟并用二次蒸馏水洗涤，得到聚靛蓝胭脂红修饰电极，记为PIC/GCE。具体请查阅图1所示，第一次扫描在+0.0V和+0.7V处出现2个氧化峰，而没有看到对应的还原峰出现，表明靛蓝胭脂红在玻碳电极上为一不可逆过程。而随着扫描圈数的增加，这2个氧化峰电流显著下降，并趋于稳定，表明聚合膜在电极表面覆盖饱和。扫描结束，将电极用混合磷酸盐缓冲液淋洗除去物理吸附的靛蓝胭脂红分子，发现电极表面呈墨蓝色，进一步证明靛蓝胭脂红分子已在玻碳电极上形成了一层聚合膜。

②将聚靛蓝胭脂红修饰电极通过五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基团，与5’-末端修饰氨基的单链探针DNA发生共价缩合作用，得到探针序列修饰电极；具体地，该步骤②为将聚靛蓝胭脂红修饰电极在40 mmol/L 五氯化磷丙酮溶液中浸泡30分钟活化磺酸根得到酰氯化磺酸基团后，取10 μL、1×10^-6 mol/L单链探针序列（S1：5’-NH₂-(CH₂)₆-TCT TTG GGA CCA CTG TCG-3’）滴于电极表面自然晾干，用TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl+1 mmol/L EDTA，pH8.0）洗去未固定的单链探针序列S1得到探针序列修饰电极。

③将探针序列修饰电极与铂电极和Ag/AgCl电极一起形成三电极体系电化学DNA传感器。

这样，本发明涉及的一种基于靛蓝胭脂红电化学聚合膜的DNA电化学传感器及其制造方法，其采用循环伏安法将靛蓝胭脂红电聚合在玻碳电极表面，通过五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基团，与5’-末端修饰氨基的单链探针DNA的氨基共价缩合作用实现探针的固定，最后再结合铂电极和Ag/AgCl电极，从而形成具有响应时间短、检测限低、稳定性和重现性好的DNA电化学传感器。

将各修饰电极在CHI650C电化学工作站上分别测定它们在含有1 mmol/L、K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的0.1mol/L氯化钾溶液中循环伏安信号的大小（电位区间为-0.2~+0.6 V）和交流阻抗曲线，结果见图2A和图2B。从循环伏安图可发现，K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆]在裸玻碳电极有一对可逆的氧化还原峰（曲线a），而在PIC/GCE上K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆]氧化还原电对的峰电流明显减小。当PIC/GCE上进一步固定上S1后（曲线c），K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆]氧化还原峰的电流明显大于曲线b。该结果也说明通过-SO^3-酰化及磺胺缩合反应能成功实现探针DNA的固定。本发明进一步采用交流阻抗法对电极的修饰过程进行表征，结果与循环伏安法相一致。靛蓝胭脂红在GCE表面的覆盖度可以通过以下公式进行计算：                                               ,公式中和分别表示裸玻碳电极和PIC/GCE上的电子传递电阻值。因此，由玻碳电极聚合前后的阻抗值计算得覆盖度为92.3%，表明玻碳电极表面的绝大部分已被靛蓝胭脂红聚合膜覆盖。

本发明以亚甲基蓝为电化学杂交指示剂考察了传感器对目标DNA的检测能力。将S1/PIC/GCE浸入含1×10^-4 mol/L 亚甲基蓝指示剂中，每富集4分钟用pH 7.0 混合磷酸盐缓冲液淋洗后在混合磷酸盐缓冲液空白液中进行差分脉冲伏安扫描，直到富集达到饱和，得到最佳的富集时间。由图3可知，随着富集时间的增加，氧化峰电流越来越大，表明亚甲基蓝在电极表面富集的量越来越多。当富集时间达48分钟时，氧化峰电流基本稳定，说明亚甲基蓝在S1/PIC/GCE上已经富集饱和。

淋洗亚甲基蓝富集饱和的电极后，将其置于空白混合磷酸盐中改变扫速进行循环伏安测定，结果如图4所示。由图可知，随着扫描速率的增大，氧化还原峰电流均越来越大。将氧化还原峰电流I_p与扫速v作图，结果发现扫描速率为20~500 mV/s范围内，亚甲基蓝在S1/PIC/GCE的氧化峰电流（I_pa）和还原峰电流值（I_pc）与扫描速率（v）均呈良好的线性关系；

其线性方程分别为：

I_pc (10^-6A)=5.165+0.0629v(mV/s),r=0.9975；

I_pa (10^-6A)=0.2232-0.0411 v(mV/s),r=0.9974。

由此，说明亚甲基蓝在电极表面的电化学行为受吸附控制，进一步说明亚甲基蓝在电极表面与S1发生了特异性吸附作用。

对传感器分析性能的检测：

将制备的S1/PIC/GCE与一系列不同浓度（1.0×10^-15~1.0×10^-9 mol/L）互补序列（S2：5’-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3’）杂交后，经亚甲基蓝富集，混合磷酸盐缓冲液淋洗，在混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线。从图5可以看出，随着互补链DNA浓度的升高，氧化峰电流强度逐渐减小，说明由于随着目标互补序列浓度的增大，电极表面双螺旋DNA量逐渐增大，减弱了探针DNA中鸟嘌呤碱基对亚甲基蓝的吸附。将峰电流I_p对S2浓度对数lgC_S2作图，结果发现I_p与lgC_S2在1.0×10^-15~1.0×10^-9 mol/L的浓度范围，I_p与lgC_S2呈良好的线性关系（插图），线性回归方程为I_p (10^-5 A)=-1.164-0.285 lg (C_S2/mol/L),相关系数r=0.9941，表明该传感器能在此浓度范围内对互补序列进行定量分析。根据3σ（σ为空白溶液相对标准偏差），得到该传感器的检测限为2.0×10^-16 mol/L。

进一步通过改变杂交序列的碱基组成，考察了传感器的杂交选择性。实验中，将S1/PIC/GCE分别放入浓度均为1.0×10^-9 mol/L的互补序列（S2）、单碱基错配序列（S3：5’-CGA CAG TGG ACC CAA AGA-3’）、三碱基错配序列（S4：5’-CGA CAA TGG CCC CAA CGA-3’）和非互补序列（S5：5’-GCATCGAGCGAGCTCGTA-3’）进行杂交，然后于亚甲基蓝中富集后在混合磷酸盐缓冲液进行差分脉冲检测。由图6可知，亚甲基蓝在S5-S1/PIC/GCE电极上的峰电流与S1/PIC/GCE接近，这是因为非互不序列并未与探针发生杂交，故亚甲基蓝在此电极上的峰电流值与S1/PIC/GCE接近；随着序列中错配碱基数的减少（S4和S3），序列与探针的杂交率随着增大，亚甲基蓝在相应电极上的峰电流相应减小；当S1/PIC/GCE与完全互补序列S2杂交后，亚甲基蓝的峰电流最小。由此说明，该传感器对不同序列DNA具有良好的选择特异性，能有效区分互补序列、碱基错配序列和非互补序列。

上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。