光合细菌转化纤维素热解液和内醚糖产类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法

摘要

本发明涉及光合细菌及其应用。利用纤维素热解液和内醚糖培养光合细菌，所得光合细菌可以产类胡萝卜素和单细胞蛋白，也可作为水质改进剂用于水产养殖和处理污水或作为叶面肥等。将内醚糖或纤维素热解液，制成培养液，在一定装液量，转化温度条件下，培养一定时间得到富含类胡萝卜素的光合菌菌体，提取类胡萝卜素后的菌体可作为单细胞蛋白饲料使用。本发明利用光合细菌有效利用纤维素类生物质的高温热解产物和内醚糖制备类胡萝卜素和光合菌单细胞蛋白，是对纤维素生物质的有效利用，可将来源丰富的生物质转化为具更高附加值的产物，变废为宝，具有良好的经济和环境应用潜力和社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及以纤维素类生物质的热解液和内醚糖为原料增养光合菌产高附加值产品的方 法，具体涉及利用光合细菌发酵纤维素热解液和内醚糖产类胡萝卜素和单细胞菌体蛋白。

背景技术

类胡萝卜素(carotenoids)是一种广泛存在于植物和微生物中的重要天然性色素（罗璇， 红酵母产类胡萝卜素提取工艺的优化研究[J].生物技术，2007,17(4):86-89）。类胡萝卜素之所 以具有重要的经济价值，是因其不仅具有预防癌症和心血管疾病的功能，可以广泛地用于医 药、食品和化妆品等领域(王岁楼.刘凤珠.高建奇.红酵母类胡萝卜素发酵助剂的筛选及应用 [J].食品与生物技术，2002,21(1):1-5.)，作为光合作用的辅助色素，类胡萝卜素还参与执行光 能传递和物质转化功能，具有抗光敏作用、淬灭自由基等重要的生理生态功能(张坤生.张亮. 吕晓玲.陈晓娟.红酵母色素抗氧化性质的研究[J]，食品科学，2004,25(3):61-63)。

因动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等因素的影响，原料不足，从中提取的色素 价格昂贵，应用受到局限，而利用微生物资源生产天然色素，克服以动植物为原料生产天然 色素的诸多缺点，易于工业化(王君.微生物产天然色素的研究进展[J].微生物学通报， 2007,34(3):580-583)。

光合细菌是20亿年前最早出现的利用光能进行光合作用生长繁殖的原核古微生物，能够 进行不放氧的光合作用，在自然界C、N、P的循环中起着重要的作用(杨官娥，张肇铭，熊 琦.光合细菌的化学成分、生理活性研究及新应用的进展动态.2004年中国药学会学术年会论 文，2004)，其个体虽小，但营养成分极丰富，含有大量的优质蛋白，菌体除含有蛋白、脂肪、 可溶性糖类外还含有多种生物活性物质，例如类胡萝卜素、泛醌、叶酸、B族维生素、生物 素等等。光合细菌不仅可以作为水产养殖的饲料添加剂，还可用于改善土壤质量、防治植物 病虫害等(杜近义.光合细菌的开发应用进展[J].生物学通报，1998,33(11):15-17)。通常光合 细菌合成培养基成本较高，制约了其大规模的推广应用。因此降低生产成本，寻求廉价的原 料是应用中迫切需要解决的问题(杨启银，陈育如.菌肥用光合菌在纤维素水解液中的培养[J]. 南京师大学报，2001,24(3):82-87)。

本发明提供的方法，利用光合细菌转化经济廉价的纤维素类生物质热解产物产类胡萝卜 素，具有营养要求简单，菌体无毒，营养丰富等优点。

纤维素类生物质原料来源广泛，成本低廉。本发明利用光合细菌将廉价的生物质经热解 后转化为高值类胡萝卜素和单细胞蛋白，是将纤维素类生物质变废为宝，提高环境效益和经 济效益的有效途径。

发明内容

本发明旨在提供一种利用廉价纤维素生物质高温热解产物培养光合细菌产类胡萝卜素和 单细胞蛋白的方法。

本发明利用光合细菌转化从生物质热解得到的内醚糖或热解液产类胡萝卜素和单细胞蛋 白菌体，光合菌可用于污水处理、植物病虫害防治和作为饲料添加剂等。

将初始OD660值0.2光合细菌接种到内醚糖或纤维素热解液配置的培养基中，在30℃， 1500lx光照，厌氧条件下培养7天，得到菌体，将菌体用盐酸破壁2h后，丙酮萃取可得到类 胡萝卜素。

本发明公开了一种制备类胡萝卜素的方法，是将光合细菌接种到含内醚糖的培养液中， 培养后得到菌体，菌体中含类胡萝卜素。

还公开了一种获得光合菌单细胞蛋白的方法，是将光合细菌接种到含内醚糖的培养液中， 培养后得到的菌体作为单细胞蛋白使用。

上述含内醚糖的培养液配方为：0.2-20%内醚糖、1%硫酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、 0.01%FeSO₄、pH为2.0-7.0.内醚糖浓度最好1-5%，pH最好为4.0-5.0。

另一种利用光合细菌制备类胡萝卜素和单细胞蛋白的方法，是用光全细菌对纤维素热解 液进行转化，具体是将光合细菌接种到以纤维素热解液配置好的培养液中，培养后得到类胡 萝卜素和单细胞蛋白；所述培养液的配方为：0.2-20%热解液、1%硫酸铵、0.1%KH₂PO₄、 0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄、pH为2.0-7.0。

所述纤维素是木材纤维素、竹材纤维素或秸秆纤维素。

所述的光合细菌包括：紫色光合细菌（Thermochromatium tepidum）、红螺菌（Rhodospirillum  sp.）、红球菌（Rhodococcus sp.）、红微菌（Rhodomicrobium sp.）菌株号ACCC00063、红假单 胞菌（Rhodopseudomonsi）等通称为光合菌的单菌种或菌群。本发明所提及的微生物可以市 购或从相关的微生物保藏机构获得。

类胡萝卜素的测量方法：将浸提液适当稀释后用分光光度计在475nm下测定吸光值，按 下式计算类胡萝卜素含量。

类胡萝卜素的含量(ug/g)=A_λmax×D×V/0.16×W

式中：A_λmax-最大吸收波长475nm下的吸光度，V-提取所用有机溶剂的总体积9（ml）， D—浸提液稀释倍数，W—干酵母菌体重量，0.16—类胡萝卜素的消光系数。

实验中所提到的热解液是由本实验室制得，具体是将秸秆、竹材、木材等生物质废料烘 干并粉碎，利用管式炉热解反应器（主要由管式炉热解器、电加热器、温控仪、冷凝和真空 系统组成）在高温条件下进行热解，收集冷凝得到的组分即为热解液。

附图说明：

图1紫色光合细菌菌量的增长曲线。

具体实施方式

本发明结合具体的实验和数据作进一步的说明，举例是为了说明本发明的过程，而非仅 限于实施例。

实施例1：

配制0.2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为0.2%内醚糖、1% 硫酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄。接入紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为79.4%，类胡萝卜素的量401.3ug/g，单细 胞蛋白产量1.61g/L.

实施例2：

配制20%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为20%内醚糖、1% 硫酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄接入的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为70%，类胡萝卜素的量377.1ug/g，单细胞 蛋白的量1.34g/L.

实施例3:

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4.接入的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的同化率为79.2%，类胡萝卜素的量517.6ug/g，单细 胞蛋白的量1.74g/L.

实施例4：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4.接入0.1%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，菌量增加如图1所示。5000rpm离心收集 菌体，3mol/L的盐酸破壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量132.3ug/g，单细胞蛋 白的量0.83g/L.

实施例5：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4。接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量517.6ug/g，单细胞蛋白的量1.74g/L.

实施例6：

配制2%（W/W）、pH为5.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4。接入5%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量374.4ug/g，单细胞蛋白的量1.46g/L.

实施例7：

配制2%（W/W）、pH为2.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4。接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量386.3ug/g，单细胞蛋白的量1.37g/L.

实施例8：

配制2%（W/W）、pH为7.0，内醚糖为底物的培养基，具体的配方为2%内醚糖、1%硫 酸铵、0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO_4.接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量517.6ug/g，单细胞蛋白的量2.03g/L.

实施例9：

配制木材热解液为底物的培养基，具体的配方为10%木材热解液、1%硫酸铵、 0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄，pH5.0接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，内醚糖的转化率为31.7%.类胡萝卜素的量234.6ug/g，单细胞 蛋白的量0.72g/L.

.实施例10：

配制木材热解液为底物的培养基，具体的配方为0.2%木材热解液、1%硫酸铵、 0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄，pH5.0接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量157.3ug/g，单细胞蛋白的量0.46g/L.

实施例11：

配制木材热解液为底物的培养基，具体的配方为20%木材热解液、1%硫酸铵、 0.1%KH₂PO₄、0.5%MgSO₄、0.01%FeSO₄，pH5.0接入10%的紫色光合细菌（Thermochromatium  tepidum），30℃，1500xl光照，厌氧静止培养7天，5000rpm离心收集菌体，3mol/L的盐酸破 壁，丙酮萃取获得类胡萝卜素，类胡萝卜素的量261.2ug/g，单细胞蛋白的量1.69g/L.

实施例12：

与实施例9基本相同，只是将木材热解液替换为竹材热解液。

实施例13：

与实施例12基本相同，只是将竹热解液替换为秸秆热解液。

实施例14：

与实施例1基本相同，其中的光合细菌为红螺菌（Rhodospirillum sp.）ACCC00318。

实施例15：

与实施例1基本相同，其中的光合细菌为红微菌（Rhodococcus sp.）ACCC00063。

实施例16：

与实施例1基本相同，其中的光合细菌为红球菌（Rhodomicrobium sp.）MCCC1A00766。

实施例17：

与实施例1基本相同，其中的光合细菌为红假单胞菌（Rhodopseudomonai）CGMCC1.219。